致病和同桌的GBS分离不同集合的选择从以前的流行病学研究。集合包括隔离从妊娠健康男性和女大学生进入密歇根大学( 27- - - - - - 30.),隔离从有症状和无症状的孕妇在密歇根大学医学中心诊所( 31日),隔离来自病人通过威斯康辛入侵细菌实验室监测系统在1998年和2002年之间( 32]。额外的隔离与早期和晚期新生儿在德州发生疾病( 8)以及隔离于孕妇有无GBS疾病得到从卡罗尔·j·贝克博士(美国德克萨斯州休斯顿贝勒医学院)。这些菌株被大致分为两类:入侵隔离从患者侵袭性疾病( n = 386年 )和殖民分离对象没有任何症状的疾病( n = 563年 )。GBS应变NEM316 [ 21),2603 vr ( 23],A909 [ 33)被用作参考菌株。GBS分离培养过夜在Todd-Hewitt肉汤(Oxoid) DNA隔离。

但是脉冲场凝胶电泳的出现了如前所述[ 30.]。简单地说,GBS DNA消化了 Sma18个小时我和电泳(初始开关时间4秒;最后的切换时间16秒)厨师三世装置(Bio-Rad大力神,CA)。凝胶是紧张4 h Vistra绿色(美国新泽西州Amersham生物科学,皮斯卡塔韦)在4摄氏度,暴风雨和可视化PhosphorImager(美国新泽西州Amersham生物科学,皮斯卡塔韦)。但是脉冲场凝胶电泳的出现模式分析了使用BioNumeric软件(应用数学、yves gijarth,创立比利时)。构建系统树图使用未加权的两组与算术方法手段,骰子系数,优化设置为1.0%,和1.0%的位置公差。GBS分离分为荚膜类型Ia, Ib,并使用DNA II-VIII点污点杂交,如前所述[ 34]。

两个fine-tiling寡核苷酸微阵列设计使用发表第三血清型菌株的DNA序列(NEM 316年加入基因库。AL732656 V)和血清型菌株(2603 vr,加入基因库。AE009948)。NEM 316阵列由368576 32-mer探测器(184288对)瓷砖2.21 Mb基因组每12股的基地。360040年总共2603 vr阵列由32-mer探测器(180020对)瓷砖2.16 Mb基因组每12股的基地。数组通过定制全息阵列设计和建造服务从罗氏(美国威斯康星州麦迪逊)使用它的无掩模的阵列合成(MAS)技术。一系列密集的瓷砖用较短的寡核苷酸是通常用于罗氏两步比较基因组测序(CGS) ( 35]。

比较基因组杂交和信号处理是由罗氏定制服务(美国威斯康星州麦迪逊罗氏系统公司)。短暂,GBS四个测试菌株和两个参考菌株的DNA被分解成单独的低分子量片段,池标签独立与青蓝荧光染料和每个杂化是一个NEM316 2603 vr全基因组花砖数组。类似于Affymetrix芯片,短期低聚糖GBS阵列是由在幻灯片的从头合成。像Affymetrix芯片杂交,幻灯片是用于杂交/标签样本。总共12微阵列杂交过程的进行。基因组杂交NEM316或2603 vr的数组作为参考信号与测试菌株杂交过程使用相同的数组。基因组杂交测序的基因组与其它测序基因组数组用于验证目的。DNA测试的信号强度比率每个引用DNA比较识别探针序列缺失或不同于基因组测试人员。比率是由规范生成的信号强度(设置值比为1,标准差0.45),参考除以测试人员对于每一个链,然后平均两股。信号的比例绘制基因组的位置的函数,使用从罗氏SignalMap软件可视化。 A custom algorithm was used to mark the potential variable probe sequence (absent or different in tester genome) based on comparison to a local threshold (a 1800 bp window). This analysis was also performed by NimbleGen (see Supplementary Material available at doi:10.1155/2007/14762 for the analytical algorithm).

公司的基因组序列对比NEM316和2603 vr使用GenomeComp[执行 36]。所有毒株特异性基因岛大于10 bp被确定使用运行参数设置为0.01, − 3 1,期望值(e),处罚不匹配,分别为匹配和奖励。探针序列的识别匹配从一个fine-tiling oligoarray其他测序基因组,一个自定义Bioperl程序被用于本地批爆炸分析。独立的爆炸计划( 37)为Unix操作系统和身份的最佳百分比用于查询基因组中的每个调查确定。所有其他数据分析使用SAS v9.0(美国SAS研究所、公司卡里、数控)和S + v6.1(美国深刻的公司、西雅图、洗)。

我们最近开发了一种微阵列技术的新的应用程序,名为图书馆幻灯片(洛杉矶),细菌的比较基因组学研究[ 38]。洛杉矶技术结合了点状杂交和微阵列技术导致玻片成千上万的细菌基因组排列。因此整个基因组的库,而不是一个基因组序列或一组基因是印在幻灯片。幻灯片是筛选大量的菌株用于特定基因的存在感兴趣的元素。创建一个GBS洛微阵列与基因组DNA从949年GBS分离采样来自各种GBS的集合和各种控制压力。使用高通量基因组DNA分离sonication-based前面描述的方法( 39]。GBS菌株的DNA以及控制排列在生动的基因阵列复制幻灯片(美国密歇根州笼罩在生命科学)使用VersArray ChipWriter紧凑的数组(美国加州Bio-Rad)。选择GBS子和四个房子保持基因,(乙醇脱氢酶( adhP),phenylalanyl tRNA合成酶( ph值)、谷氨酰胺合成酶( glnA)和葡萄糖激酶( glcK)),扩增从应变NEM316或2603 vr菌进行基因。纯化PCR产品fluorescein-labeled使用BioPrime DNA标签工具包(美国加州表达载体)。每个探针杂交一夜之间用不同的幻灯片 68年 ° C在PerfectHyb +杂交缓冲(σ,密苏里州,美国)。洗后,fluorescein-labeled探针检测使用antiflourescein碱性磷酸酶(瑞士罗氏公司)和碱性磷酸酶工具包(美国加州TeleChem)。每个点的强度归一化强度的量化调查(四个看家基因)的混合DNA浓度的差异在不同的地方,和比强度的积极控制(序列已知应变包含基因探针)来确定存在/缺失的基因片段在不同菌株使用先前建立的方法( 38, 40]。

比较致病性和非病原的菌株在一个物种可以提供关键的见解细菌的发病机理。然而,所有测序GBS菌株来自侵入性疾病。我们采用分子流行病学比较选择代表共餐的殖民GBS分离获得最高的比较基因组杂交可能识别潜在pathogenesis-related入侵基因组的基因测序(NEM316菌株和2603 vr)。我们的多样性特征882殖民隔离以人群为基础的纵向研究妊娠的健康男性和女大学生( 28)使用但是脉冲场凝胶电泳的出现和血清型。聚类分析的系统树图上执行这些隔离的样本35入侵隔离和测序NEM316致病性菌株和2603 vr。在此基础上分析,我们选择了三个基因共餐的隔离距离隔离的两个基因组测序但代表相对较大的应变集群共生的主要的来源。隔离657 - 461 V是一个血清型菌株代表最大的克隆群体在我们同桌的集合。隔离g617 - 061 (III)血清型和g293 - 061(血清型II)来自另外两个集群由殖民菌株。除了这三个同桌的隔离,一个入侵隔离,H-19,被选为比较基因组减法,因为它代表了最常见的克隆类型的血清组Ia应变分析。由于血清型分类并不一定反映菌株之间的遗传距离( 20.),我们没有选择测试菌株完全基于血清型的差异。殖民的少量污迹选择在这里不能和不是为了捕获的多样性共生的隔离。这是我们第一次尝试执行全基因组比较殖民菌株和测序的基因组,所以我们可以从列表中选择候选基因数千协会研究使用洛微阵列,收集大量的以人群为基础的GBS分离筛选。

我们使用共享探针序列中的两个基因组数组的再现性的比较基因组杂交,杂交测序基因组与其它基因组测序的数组来评估的准确性评估序列变化的数组。

184288个探针对之间NEM316数组和180020调查对2603 vr数组,总共有16364相同的探针对比赛(32/32)被确定。这个探针杂交结果从两个数组子集为每个测试人员基因组被视为副本用于访问全息的再现性。为每个探针杂交分为相同或变量在试验机的基因组相比,参考基因组。试验机的一致性百分比基因组g293 - 061, H1-19, g617 - 061和g654 - 461分别为98.75%,99.50%,99.88%,和98.62%,分别。再现性是非常高的,即使原始信号率检查。重复的相关系数都大于90%。

评估的准确性数组在评估序列变异,我们比较的结果与实际的分类结果数组silicoanalysis杂交NEM316之间交换和2603 vr基因组。几乎所有的完美匹配被正确标识为相同的杂交探针序列。133520年只有4和5的133570探针序列被错误地认定为不同NEM316和2603 vr数组,分别。然而,28673年的50768(56%)和25435年的46450(55%)不匹配的探针序列是相同的错误,NEM316和2603 vr数组,分别。在调查层面,杂交特异性检测灵敏度高,但低守恒的探针序列。尽管如此,瓷砖数组的高密度性质仍然提供全面的信息在基因组序列变异和开放水平。我们直观地显示全息结果通过绘制杂交信号探测的比率在基因组的位置和比较他们的在网上比较NEM316和2603 vr。大多数的变量探测器(即。,probes with high reference versus tester signal ratios) are clustered primarily around strain-specific genetic islands identified by the in silico analysis. To convert probe-level variation to ORF sequence variation, we calculated the percentage of variable probes for each ORF (number of variable probes identified within an ORF divided by the total number of probes tiling the ORF). Using different percentage cutoff values in classifying variable ORFs (divergent or absent), the CGH-based data was compared with in silico analysis (Table 1)。316年NEM数组,15%截断值2.9%的假阴性率(即。,羊痘疮s known to be present but classified by hybridization as absent or very divergent) and the best overall sensitivity and specificity (97% and 94%, resp.). For the 2603VR array, the 20% cutoff point gave the best overall sensitivity and specificity (97% and 91%, resp.). Thus, these two cutoff points were chosen to classify variable ORFs for the remaining CGH analyses.

比较基因组杂交与fine-tiling 32-mer寡核苷酸微阵列没有识别所有调查两个参考基因组序列变化但可靠地确定变量并使用结合的探针杂交结果在每个子。

CGH使用NEM316和2603 vr基因组数组显示3.4 -15.4%的探针序列缺席或发散的四个测试菌株(表 2)。这个范围的多样性是类似于序列差异的范围(5%对15%)最近在成对的比较观察到所有可用八个完整或草案GBS基因组序列( 20.]。瓷砖数组允许一个高分辨率的基因组变异菌株之间的比较。图 1比较杂交结果显示测试菌株2603 vr策划参考测试信号的比率在基因组的位置。虽然四个测试菌株代表四个不同的血清型(Ia, II, III和V),大多数的缺失或发散探针序列在这些菌株被映射到同一组NEM316基因组区域,第三个血清型菌株。在较小程度上,相同的地区在2603 vr基因组涵盖了大多数的缺失或发散的探针在四个测试中的三个基因组。应变g617 - 061,第三个血清型菌株,非常类似于V血清型参考菌株2603 vr基因组中,只有3.4%的调查确认为不同的相比 > 其他测试人员基因组的13%。比较所有可用八个完整或GBS基因组序列草案也表明,血清型分类并不能反映GBS的遗传多样性( 20.]。一个可能的解释为密切相关的菌株表现出不同的胶囊是遗传基因决定的荚膜型交换水平基因转移。

从所有的探针杂交结果在每个开放框架被用来确定是否存在/散度测试仪使用标准建立了通过分析基因组控制实验(如上所述)。在2134 orf NEM316基因组内,484名(22.7%)认定为变量orf因为他们列为缺席/发散在至少一个测试人员基因组。269(56%)人缺席/四tester基因组不同,到96年,84年,和35分为缺席/发散在1、2和3基因组分别。2124子在2603 vr的基因组中,530(25%)被确定为变量羊痘疮。其中,81年、121年、162年和166年被列为缺席/发散在4、3、2和1 tester基因组分别。成对的基因组比对两个参考基因组毒株特异性识别区域的总长度288 kb和239 kb NEM316和2603 vr,分别。大于95%的orf驻留在这些毒株特异性区域被确定为变量并在我们的全息四个测试人员基因组,代表NEM316变量orf的64%(309/484)和52%(275/530)的2603 vr变量羊痘疮。大约80%的变量并确定由全息位于14假定的致病性岛之前确定NEM316 [ 22]。

调查这些官能团变量orf属于,我们分类并成簇的直系同源基因(齿轮) 41]。图 2显示变量在每个齿轮orf类别的数量。大约一半的变量并没有被分为齿轮和未知函数。最常见的可分类的变量orf属于齿轮一类DNA复制,重组和修复。这可能是由于集成噬菌体的存在或在参考基因组质粒。大量的变量并预计参与运输、监管、中间代谢,和细胞壁代谢。这些基因可能在维护重要致病入侵GBS的生活方式和传输压力。基因在这些类别也被确定通过一个体内研究,signature-tagged诱变和新生儿鼠模型被用来识别中涉及小说GBS基因毒性( 42]。相对较少的变量并被发现参与辅酶运输和代谢和脂质运输和代谢。

orf一直缺席/发散在共生体tester菌株相比,侵入性菌株可能毒性基因的候选人。六个orf缺席/发散在所有三个同桌的测试人员紧张,两个入侵和守恒的参考基因组和侵入性测试压力。我们确定了一个额外的29个orf参考基因组的缺席/发散至少三分之二的共生体(表压力 3)。15这些35 orf预计假设未知蛋白质的功能。几个子预测蛋白质参与运输、代谢和其他代谢功能。还包括有两个假定的脂蛋白和两个表面蛋白。基因gbs0850预测编码是纤维蛋白原结合蛋白和以前是一样的 fbsB基因( 43, 44]。2603年gbs0850 vr的最佳匹配是ORF sag0832,纤维蛋白原结合蛋白的编码不同变体。orf gbs2015和gbs2016两个相邻基因高度相似的DNA序列预测编码糖基转移酶。这两个基因一起还发现在2603 vr基因组sag2060和sag2061。

当我们发现大量的变量羊痘疮,几人失踪在所有三个,甚至两个同桌的测试压力。因为涉及多个遗传因素在GBS毒性和多个发病途径涉及不同的毒力基因可能存在,我们可以预计不同的毒力基因被识别不同对入侵和殖民时隔离进行了比较。

所有变量并潜在的毒性基因的候选人。使用新颖的GBS洛微阵列平台大量GBS分离,这些变量的重要性,并可以有效地评估。我们现在初步评估23以上的35个orf确定使用GBS洛杉矶。我们不能合成好的探针和特定的信号很强在我们最初尝试其他12个变量orf由于其小尺寸或可怜的PCR扩增。因此,我们离开他们的初始洛筛查。GBS洛微阵列包含从949年GBS分离株基因组DNA打印一式两份。其中,386人被隔离,从患者侵袭性疾病,563人共餐的殖民隔离。此外,《数组包含DNA从各种控制压力。表 3列表23个ORF的流行在整个GBS收集和他们的患病率比殖民入侵病毒的比率。sag2060、sag2061 sag0832, gbs0474更频繁地出现在比殖民入侵隔离共生的压力。相比之下,sag0814比入侵更频繁地出现在殖民隔离隔离。

orf sag2060和sag2061是两个假定的糖基转移酶基因。糖基化在许多生物过程中扮演一个重要的角色在真核生物中,并且有越来越多的证据显示细菌的糖基化作用。许多表面细菌表达结构如有限合伙人,洛杉矶,胶囊,鞭毛,病原菌的菌毛糖化( 45- - - - - - 47]。糖基化还可用于灭活细菌抗生素( 48, 49]。有趣的是,糖基转移酶基因 lic2B在 流感嗜血杆菌被发现更频繁地在隔离导致中耳炎比从孩子喉咙隔离 50]。未来的机械的研究应该阐明这些GBS糖基转移酶在发病机理的角色。

sag0832预测编码是一种纤维蛋白原结合蛋白。这个基因被认为是入侵的一个重要毒力基因GBS的疾病。在脓毒症的小鼠模型,野生型菌株比同基因的菌株毒力更强的基因灭活( 44]。sag0832也促进GBS入侵上皮细胞在体外( 43]。除了三个orf编码蛋白质,两个orf (sag0814和gbs0474)编码的蛋白质分布式入侵和殖民菌株之间有差异。鉴于没有已知的大量的子函数,存在于基因组测序,这并不奇怪。这些羊痘疮可能涉及复杂的特征,很难观察到在实验室条件和使用协会的研究将更容易识别。发现有趣的是,sag0814更频繁地在同桌的压力比在侵入性压力。可能缺乏这个基因增强毒性。commensal-to-pathogen进化过程中,细菌不仅获得毒性基因但也通过删除了基因( 51]。缺失的基因促进共生的生活方式可以提供一个额外的进化途径对毒性。例如,赖氨酸脱羧酶基因的缺失极大地促进了肠毒素的活动 志贺氏杆菌在其发展 51]。

而五23变羊痘疮不同分布式入侵和共生体之间的隔离,这些羊痘疮的关联与入侵隔离既不排斥也不强。这样的结果并不意外的有几个原因。首先,我们预期某种程度的随机错误分类降低入侵菌株也可以观察到的关联,因为同桌的,和非侵入性压力可以成为机会致病菌。第二,类似于几个不同的致病型的存在在许多细菌病原体,可能有许多不同的致病型GBS之内。一个毒力基因可能与菌株在一个特定的GBS致病型密切相关,但协会不太明显时所有的入侵隔离都包括在分析中。第三,GBS发病机理是由不是一个而是很多毒性基因和任何一个基因可能只贡献。我们在筛选的过程中这些和更多的变量并在2000年一个额外的隔离是为了执行一个更明确的分析。此外,合并GBS的人口结构可能会加强我们的分析,帮助解释。

筛选23 orf 949隔离还揭示了GBS的引人注目的基因组内容多样性。我们分配每个隔离一个基因型的存在与否全部23对。共有503个基因型949隔离观察。使用这个分类,但是脉冲场凝胶电泳的出现相同的模式菌株有不同的基因组合。剖析GBS的有限数量的基因探针可能因此提供一个高度区别的输入方法。