Polyhydroxybutyrate (PHB)的自然起源、聚乙二醇(PEG)(分子量106年二甘醇(度)和2000年),和胰蛋白酶购买的西格玛奥德里奇(澳大利亚悉尼)。分析级氯仿和二甲亚砜(DMSO)从Univar购买(罗马、澳大利亚)。哺乳动物细胞生长介质,胎牛血清(的边后卫)和青霉素/链球菌抗生素从Gibco-Invitrogen(澳大利亚悉尼)。近年在杜尔贝科修改鹰的常规培养介质(DMEM / F12)补充10%的边后卫从Lonza购买(朴茨茅斯,在北半球,美国)。CellTiter 96水一个解细胞增殖试验和体外乳酸dehydrogenase-based毒理学工具包买来Promega(美国麦迪逊,WI)和西格玛奥德里奇,分别。

生物聚合物溶剂铸造技术制造出电影中描述的研究罗德里格斯et al。 17]。粉的PHB和挂钩样品各自的重量比为100:0,90:10,80:20,70:30 (w / w)无菌密封容器中加热溶解在氯仿(2% w / v, 160 rpm, 50°C)。解决方案是允许冷却(22°C, 160 rpm, 15分钟)涌入无菌之前,玻璃培养皿和溶剂蒸发站(12小时,22°C)。由此产生的电影,每表贴上 1,随后被维持在40°C下真空48小时删除任何溶剂残留。

生物聚合物薄膜的材料特性分析使用一个拉伸试验仪(美国instron - 5543,诺伍德,MA)在22°C相对湿度为30%。电影样本(30×15毫米)固定使用一个校准的气动控制拉伸试验仪器(20毫米分钟并且慢慢地分开⁻¹)。最大负荷、抗拉强度和破坏时扩展计算使用Bluehill计算机软件(美国诺伍德,MA)。意味着至少10个样品测定( n = 10 )。

生物聚合物薄膜的孔隙度是衡量乙醇位移法( 22]。样本切成50×10毫米大小和沉浸在量筒与一个已知体积的乙醇( V 1 )。乙醇的总量和电影( V 2 ),浸泡5分钟后记录。ethanol-impregnated电影了,剩下的乙醇成交记录( V 3 )。的五个样品测定( n = 5 )。电影的孔隙度是通过以下公式计算: (1) 孔隙度 ( % ) = ( V 1 - - - - - - V 3 ) V 2 - - - - - - V 3 × One hundred. % 。

生物聚合物薄膜的X射线衍射模式是使用飞利浦X 'pert材料研究衍射(MRD)系统(荷兰埃因霍温)。薄膜样品(20×20毫米)在玻璃幻灯片和与安全 2 θ , z 设在和ω扫描(散射角的范围 2 θ = 10 - - - - - - 30. ° 和扫描步长为0.02°连续扫描类型)。辐射波长的1.5406(铜K-Alpha)被用来生成一个45 kV和电流管40 mA。结晶度(Xc)计算下列方程和使用X 'pert Highplus Excel软件和软件: (2) 结晶度 ( % ) = ( F c F c + F 一个 ] × One hundred. % , 在哪里 F c 和 F 一个 是晶体的地区(峰值)和noncrystal地区(曲线下),分别。

水吸收(吴)电影用重力测量测量之前和之后的水浸法( 23]。生物聚合物膜切成40×10和20毫米大小 μ米厚度,重量,沉浸在50分钟37°C (RO水 W 1 )。水化膜被干燥后,体重的地表水Kimwipes(灵伍德、澳大利亚)( W 2 )。水吸收是由下列公式计算: (3) 吴 ( % ) = ( W 2 - - - - - - W 1 ) W 1 × One hundred. % , 吴水吸收的比例, W 1 和 W 2 是样品膜浸泡前后的重量。的五个样品测定( n = 5 )。

液滴的接触角测量方法使用接触角仪在室温(22°C, 30% rH)来研究聚合物的亲水性表面(KSV凸轮200年埃斯波,芬兰) 24]。生物聚合物膜切成40×30毫米,微量调节注射器水滴慢慢允许下降到他们的表面。接触角和水滴之间的生物聚合物电影记录使用KSV仪器软件。十读数方法计算每个样本( n = 10 )。

Preweighed生物聚合物薄膜样品(30×15毫米)样本消毒通过γ辐照和放在埃普多夫管(2毫升)。样本(37°C, 150 rpm)孵化后的2毫升磷酸盐(0.1 M, pH值7.4)和青霉素(100毫升⁻¹),链霉素(100 μ 克毫升⁻¹(2.5),fungizone-amphotericin B μ 克毫升⁻¹)。在周期性间隔一个84天的时间,样品被移除,过滤,干燥在干燥器(40°C, 24 h)允许适应之前22°C(气压上平衡重)。电影的减肥减肥(%)计算,定义为( 3): (4) W ( % ) = W t W 0 × One hundred. % , 在哪里 W 是减肥, W 0 和 W t 在孵化后最初的体重和体重。每个时间点四个样品,每个样品测定( n = 4 )[ 25]。

小鼠嗅鞘细胞(近年)在介质由DMEM培养,10%的边后卫,青霉素250单位,250年 μ 克毫升⁻¹链霉素,1 μ 克毫升⁻¹和fungizone-amphotericin B t - 75年组织培养瓶37°C和5%孵化有限公司₂( 26]。近年从瓶中取出使用胰蛋白酶(2.5%)70%的融合。大约4×10的细胞群⁴细胞毫升⁻¹用于接种的电影(13×13毫米)样品。在周期性间隔10天的时间尺度,样本牺牲和电影两次冲洗10毫升的PBS;2毫升的胰蛋白酶(2.5%)随后补充说在孵化前(37°C, 2分钟)。细胞生存能力是计算使用血球计和台盼蓝排斥技术。样品进行了一式三份( n = 3 )。光学显微镜下细胞增殖也观察到(徕卡DFC 280年,英国伦敦)。

薄膜样品的培养与近年冲洗两次1%磷酸缓冲盐(PBS)和固定四个小时22°C 0.1 2.5%的戊二醛PBS缓冲(pH值7.2)。随后,电影用PBS缓冲三次5分钟时间。另一个缓冲洗后,样品在一系列的乙醇脱水10分钟洗(30、50、70、80、90、95和100%)和临界点干燥使用液态二氧化碳。所有标本都安装在铝存根和表面涂上一层黄金粒子使用溅射涂布机(Emitech K550x,阿什福德,英格兰)。样本随后检查使用扫描电子显微镜(日立S3400-I、东京、日本)15岁kV和750 mA,程序改编自涌et al。 27]。

线粒体功能描述:人口评估使用CellTiter 96水一个解细胞增殖试验 28]。近年以10%的边后卫在DMEM培养,收获trypsinisation,统计,和镀到96孔板的PHB的电影,PHB / PEG106-20, PHB / PEG106-30的PHB / PEG2000-20和PHB / PEG2000-30 (w / w)。细胞培养在生物材料被用作控制的缺失。3000年每个细胞培养,培养48小时(37°C公司为5%₂);30 μ MTS的L (3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2、溴化5-diphenyltetrazolium)解决方案被添加到每个好,和板进一步孵化4小时。MTS浓度测定的吸光度490/690 nm使用microtitre板分光光度计。5的意思是样品确定( n = 5 )。

LDH化验中用于检测细胞毒性近年人口因此PHB的孵化和PHB /挂钩电影[ 29日]。细胞在DMEM培养,10%的边后卫,收获trypsinisation,统计,和镀96 -孔板与电影的PHB的PHB / PEG106-20, PHB / PEG106-30的PHB / PEG2000-20和PHB / PEG2000-30。生物材料的细胞培养在没有作为健康对照组。3000年每个细胞培养,培养48小时(37°C, 5%有限公司₂)。在45分钟前端点,10 μ L溶解样品的解决方案添加到5井和这些担任积极控制。板离心5分钟在250 g在室温(22°C, rH 30%)。50 μ L上层清液样本被转移到无菌96孔板和100年 μ L (LDH混合添加到每个在黑暗中孵化前30分钟(37°C, 5%有限公司₂)。LDH分析吸光度的490和650海里使用microtitre板分光光度计。5样品的测定( n = 5 )。

平均值的数据计算每组的标准差。一个学生的 t 以及意义进行了有95%的信心。

混合是公认的具有成本效益的技术操作材料和高分子生物材料的理化性质。在这项研究中,溶剂铸的材料性质的PHB电影类似于先前的报道,19±1.7 MPa的抗拉强度和扩展打破2.5±1.8%的 26] 。而混合高达20% (w / w) PEG106的抗拉强度无显著影响的PHB /钉复合电影,加载30% (w / w) (PHB / PEG106-30)显著降低5.2±1.9 MPa(图的力量 2(一个), P > 0.005 )。相比之下,PHB / PEG106电影的扩展打破线性增加到8.3±1.1% 30% (w / w)加载。随着挂钩的分子质量的增加,抗拉强度的降低的PHB观察后10% (w / w)挂钩加载一个线性损失8.2±2.1 MPa的PHB / PEG2000-30电影(图 2 (b))。与混合PEG106, PHB / PEG2000-20电影显示增加灵活性但又减少挂钩负荷增加到30% (w / w)。因此,混合的PHB挂钩普遍增加的灵活性相对脆弱的PHB复合膜相比,变化是浓度依赖性。扩展打破的PHB / PEG106-20和PHB / PEG2000-20电影表现出类似的灵活性缝合线捏造的聚(四氟乙烯)(聚四氟乙烯),但是不灵活相比,尼龙和丝绸 30.]。

PHB是半晶质的生物聚合物;增加扩展打破与挂钩提出的复合材料结晶度的变化。x射线衍射模式和极大值,观察到在14°,17°,PHB 22°和PHB / PEG106复合电影,被发现与之前的研究相一致(图 3)[ 31日]。随着PEG106加载影片中增加,衍射峰的强度降低(图 3)。也观察到类似x射线衍射模式的PHB /聚乙二醇混合(数据没有显示)。因此观察PHB /电影挂钩的结晶度减少从70%的PHB电影为电影大约45%与30% (w / w)混合PEG106和聚乙二醇,分别的PHB / PEG106-30和PHBPEG2000-30(图 4)。结果表明PHB晶体结构保持完整的分离结晶的PHB从无定形的PHB和度地区半晶质矩阵。相似的变化在PHB混合乙酸丁酸纤维素(出租车)报道了王等。 32]。

众所周知,PHB相对缓慢的降解率在生理条件下,混合被用来操纵其降解行为( 33]。PHB在这项研究中,电影显示小减肥后84天的孵化在生理条件下(图 5)。相反,电影与提升载荷挂钩方面表现出显著的体重损失后10天(图 5)。然而,图 5清楚地表明,最初减肥近似初始载荷挂钩;这些损失发生在20天的孵化的PHB / PEG106电影和10天的PHB /聚乙二醇的电影。降解残余的电影是可以忽略不计的剩余持续时间的研究中,与PHB电影的行为(图一致 5)[ 34]。盯住这个相对较小的初始解散,亲水集团从疏水性的PHB矩阵PHB-pectin复合材料与之前的研究一致,相对较小的果胶水溶性和释放的PHB在电影( 35]。果胶的初始解散了PHB随后促进减肥的电影后明显稳定的高原期。

PHB是一种疏水性生物聚合物与电影在这里展示90.3±1.7°的水接触角;混合与PEG106降低复合材料的接触角的电影以线性方式,与PHB / PEG106-30拥有一个60.0±3.0°角(图 6)[ 24]。因此,混合与PHB可以提高挂钩的亲水性的电影,这是明显的水吸收的增加,从2.62±0.34%的PHB的PHB / PEG106-30(图9.86±1.37% 6(一))。盯住更高分子量的比例对复合薄膜的亲水性有更大的影响,一个线性减少水接触角随着聚乙二醇发生加载到20%稳定在大约39°(图之前加载 6 (b))。同样,水吸收增加到最大的PHB / PEG2000-30 11.04±1.22%。大量的研究表明,在生物材料表面的hydrophilic-hydrophobic关系影响细胞粘附和增殖 36]。

与先前的报道一致,PHB电影在这项研究中有58±3.0%的孔隙度( 33]。混合的PHB的挂钩导致轻微但显著变化的孔隙度的电影,从48.3±4.0%的PHB / PEG106-20电影65.5±3.6%的PHB / PEG2000-30电影如图 7。萨阿德等人表明成骨细胞倾向于附加的孔和沟槽,成长为一个高度多孔支架,表明表面孔隙度有一个重要的角色在细胞附件( 37]。PHB-based生物材料的孔隙度的增加也被证明能加速它的生理退化率( 38]。据报道,因此,表面性质影响细胞附件可以调整在PHB电影混合不同的分子量和载荷的挂钩。

与复合材料表面性质的变化一致,成年嗅鞘细胞(近年)培养电影显示显著的吸附和扩散(图的变化 8)。近年的增长模式在聚苯乙烯细胞培养板(控制)类似的PHB的电影与稳定增加十天的潜伏期。混合PEG106增加初始细胞附件虽然他们随后的增长率的PHB与培养。相比之下,混合聚乙二醇有更大影响,PHB / PEG2000-30展示增长率为7.2×10⁵细胞毫升⁻¹每天2.7×10⁵细胞毫升⁻¹dy⁻¹的PHB / PEG106-30和2.5×10⁵细胞毫升⁻¹dy⁻¹PHB的电影(图 8)。因此,混合与促进了近年的增长挂钩PHB-based复合薄膜。

挂钩,或高分子量的等效,聚氧化乙烯(PEO),可以用来开发protein-repelling表面。因此,挂钩也已经融入到生物材料表面通过嫁接 39),吸附表面处理( 40通过交联[],通过批量合并 41]或阻止共聚[ 42]。大多数PEG-derivatized表面的设计试图消除细胞和蛋白质粘附使用高挂钩表面浓度。然而,Tziampazis等人表明,粘蛋白的构象也扮演着重要的角色在决定细胞粘附和增殖,使用小的表面浓度的盯住调节细胞粘附和分化 42]。此外,张等人已经证明,混合与挂钩,有效地提高了壳聚糖的生物相容性电影( 43]。因此,在溶剂蒸发的PHB / PEG混合报道,可以推测,大部分的挂钩是用于修改材料特性而小表面浓度增强细胞粘附和增殖。

定性调查的近年附着在电影中并没有发现异常细胞形态。健康细胞出现平与许多filopodial扩展(图 9)。这些丝状伪足发挥重要作用在神经元再生,这是第一步在生长锥的形成 44]。艾哈迈德等人也报道称actin-containing filopodial扩展PHB在近年培育电影提供了细胞迁移和更大的信息交流 45]。在三天的孵化,近年发展丰富地与控制(图一致 9)。

MTS试验措施通过减少基质细胞的线粒体活动,黄色MTS四唑盐紫色甲瓒化合物,可作为细胞生存能力的指标( 45]。在这项研究中,细胞培养的MTS的百分比的PHB和PHB /钉复合电影相比有显著不同的健康细胞的控制。此外,近年发展的PHB /钉复合薄膜表现出MTS水平接近的控制,表现出比细胞生长在健康细胞的PHB电影( P > 0.005 ,图 10 ())。当压力下细胞膜表现出增强的渗透率和随后的乳酸脱氢酶(LDH)的释放。LDH的栽培介质提供了一个指示细胞细胞毒性( 28]。在这项研究中,LDH释放的浓度从细胞培养的PHB和PHB /钉复合电影在统计学上类似于健康细胞( P > 0.005 ,图 10)。调查结果表明,没有一个电影是细胞毒性;然而,混合增强细胞生存能力挂钩。因此,PHB挂钩在电影的存在支持最初的依恋近年及其随后的扩散,尽管挂钩被释放的生物聚合物矩阵的前5天内孵化。