1。介绍
慢性肾功能衰竭(CRF)进展无情终末期肾病(ESRD)。先进的CRF患者的疾病往往进展速度比那些轻度至中度CRF (
1 ,
2 ]。虽然有几个因素,如高龄、高血压、脱水、和药物的使用,会影响发展的速度(
3 - - - - - -
5 ),它可以自发地加速,尽管缺乏这样的加重因素(
1 ]。这些发现表明额外的参与机制,促进CRF进展的晚期。肾脏组织病理学的阻力指标纤维化在人类也许可以CRF的特征是
6 ,
7 )和实验动物模型(
8 - - - - - -
10 ]。在肾纤维化的发展,以前的研究已经显示的初始参与炎症白细胞,如淋巴细胞、巨噬细胞、肥大细胞(
11 ,
12 ]。然而,我们知道对他们的以后参与的肾纤维化进展的晚期,部分是因为高死亡率的实验动物
11 ]。淋巴细胞和巨噬细胞主要表达延迟整流K+ 渠道(Kv1.3)等离子体膜,渠道起着至关重要的作用在细胞的激活和增殖
13 - - - - - -
16 ]。因为淋巴细胞被激活(
17 )和血清细胞因子水平升高在ESRD患者
18 ,
19 ),白细胞中表达的渠道将有助于发达CRF肾纤维化的进展。为了阐明这一点,使用先进CRF大鼠模型,我们检查了肾脏的组织病理学特点和Kv1.3的参与渠道和细胞周期标记表达式的发病机理。这里,我们首次显示白细胞的数量急剧增加与先进的CRF大鼠肾脏。我们还表明,Kv1.3渠道的过度表达在白细胞导致的肾纤维化进展通过刺激细胞循环,促进细胞增殖。
2。材料和方法
2.1。动物的准备
大鼠5/6肾切除术与复苏时期只要14周作为先进的CRF在当下研究的模型。次全切除了男性Sprague-Dawley老鼠体重150 - 180 g(日本SLC Inc .、静冈市、日本)如我们之前所述的研究(
20. ]。短暂,右肾的上1/3,降低1/3的结扎诱导梗塞。一个星期后,左肾切除手术。在随后的14周,老鼠可以免费获得标准的鼠粮和水随意和维持湿度和温度控制的房间在12小时的光暗周期。与虚假的老鼠被用作控制操作。治疗与Kv1.3通道抑制剂,margatoxin(肽研究所,日本大阪)溶解在蒸馏水准备一个100纳米的浓度。小计12周后肾切除术,CRF大鼠腹腔注射100海里/毫升margatoxin每日两周。结束的时候尽早复苏时期,老鼠深深与异氟烷麻醉,然后被颈椎错位。树干血液被撤回的测量血清肌酐,尿素氮,钾的水平。肾脏组织学检查和RNA提取被移除。 All experimental protocols described in the present study were approved by the Ethics Review Committee for Animal Experimentation of Tohoku University.
2.2。免疫组织化学
Three-micrometer石蜡4%的部分paraformaldehyde-fixed肾脏被安置在citrate-buffered解决方案(pH值6.0)为抗原检索,然后煮30分钟。内源性过氧化物酶被3%的过氧化氢,非特异性结合与10% BSA阻塞。主要抗体如下:兔抗- ki - 67 (1): 100;美国实验室有限公司愿景,Fremont, CA), anti-Kv1.3 (1: 100;Alomone实验室有限公司,耶路撒冷,以色列),和鼠标anticollagen类型III (1: 100;Abnova,台北市,台湾)。Diaminobenzidine衬底(σ化工有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国)是用于颜色反应。第三Kv1.3和胶原蛋白染色,部分与苏木精复染色。二次抗体一直独自负面的所有部分。
2.3。实时rt - pcr
新孤立肾皮质的总rna提取使用RNeasy迷你包(试剂盒、希尔登,德国)。从2 First-stand互补脱氧核糖核酸合成
μ 20 g的每个组织的总RNA
μ L反应混合物的使用上标很第一链合成装备(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。定量rt - PCR进行了使用应用生物系统公司7500实时PCR系统(美国生命技术公司,马里兰州)与SYBR预混料交货Taq II(豆类生物,京都,日本)。RNA样本的数量被规范化GAPDH的表达水平。列出了使用的引物序列表
1 。
表1
引物用于定量实时反向transcriptase-PCR。
基因
底漆
产品长度(bp)
CD3
转发:CAAAGAAACTAACATGGAGCAGGG
120年
相反:CTTTTTGCTGGGCCATGGT
ED-1
转发:TGTACCTGACCCAGGGTGGAA
92年
相反:GAATCCAAAGGTAAGCTGTCCGTAA
KCNA3
转发:GCTCTCCCGCCATTCTAAG
141年
相反:TCGTCTGCCTCAGCAAAGT
到
转发:CAATGTTGTACGGCTGATGG
120年
相反:GGAGGTGCTTTGTCCAGGTA
p21
转发:AGCAGTTGAGCCGCGATT
124年
相反:CGAACACGCTCCCAGACG
GAPDH
转发:GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG
143年
相反:ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA
2.4。其他测量和统计分析
血清肌酐、尿素氮和钾含量测量使用化学自动分析器(DRI-CHEM 3500 v;富士山,日本东京)。数据分析使用Microsoft Excel (WA微软雷德蒙有限公司、美国),报告为±SEM手段。统计学意义是由一个双向方差分析评估Dunnett或学生的紧随其后
t
以及。的值
P
<
0.05
被认为是显著的。
3所示。结果
3.1。原位炎症扩散白细胞与先进的CRF大鼠肾脏
血清肌酐的标记高度(
4.45
±
1.16
与虚假的操作
0.33
±
0.03
mg / dL,
n
=
6
,
P
<
0.05
)和尿素氮(
130年
±
8
。
95年
与虚假的操作
15.5
±
1.39
mg / dL,
n
=
6
,
P
<
0.05
)水平进行肾切除手术的老鼠显示先进的CRF有严重尿毒症(
11 ]。老鼠血钾过高(
6.9
±
0.5
与虚假的操作
4.3
±
0.05
毫克当量/ L,
n
=
6
,
P
<
0.05
)由于肾功能恶化。部分肾脏从虚假的老鼠显示操作的正常tubulointerstitium皮层(数字
1 (A)和
1 (c))。在CRF大鼠肾脏,正如前面演示(
8 ,
10 ,
12 指出,弥漫性纤维化髓和乳头状间质(数据没有显示)。皮质间质,除了纤维化,大量的小圆细胞纺锤形成纤维细胞(图中指出
1 (b)和
1 (d))。因为的mRNA表达CD3和ED-1,淋巴细胞和巨噬细胞表面标记,在大脑皮层明显升高隔绝CRF大鼠肾脏(图
1 (B)),这些圆形细胞被认为是炎症性白细胞、淋巴细胞和巨噬细胞等。
图1
虚假的组织学特征操作(假的)和先进的CRF大鼠肾脏。(一)苏木精和伊红染色(圆))虚假的操作(假的)和先进的CRF大鼠肾脏。(a)和(b)低功耗的皮层。放大,×20。(c)和(d)大功率皮质小间隙的观点。放大,×60。(B)的mRNA的CD3(左)和ED-1(右)在肾皮质的虚假的经营和先进的CRF (CRF)大鼠肾脏。#
P
<
0.05
而虚假的老鼠。值意味着±SEM (
n
=
6
)。差异分析方差分析Dunnett或学生的紧随其后
t
以及。利用抗体ki - 67 (C)免疫组织化学(布朗)虚假的经营和先进的CRF大鼠肾脏。(a)和(b)大功率皮质小间隙的观点。放大,×60。
![]()
在虚假的操作鼠肾脏,免疫组织化学ki - 67细胞增殖的一个标志,只有弱阳性在某些近端小管细胞(图
1 C (a))。然而在CRF大鼠肾脏,数量的免疫组织化学表现出积极的彩色小圆细胞皮质间质内(图
1 C (b)),这表明炎症白细胞增生在先进的CRF的肾脏。
3.2。过度的Kv1.3-Channels白细胞和表达细胞周期的标记
因为淋巴细胞和巨噬细胞表达Kv1.3渠道在等离子体膜(
13 ,
14 ),由于通道触发所需的钙离子流入细胞增殖(
15 ,
16 ),我们检查通道的表达在白细胞鼠肾脏(图
2 (A))。mRNA的表达
KCNA3 基因,编码Kv1.3,皮质与CRF大鼠肾脏中显著升高(图
2 (A))。在虚假的老鼠,正如前面演示(
21 ),为Kv1.3显示弱免疫组织化学染色在近端小管细胞的细胞质(图
2 (b),箭头),但不是在小圆细胞皮质间质(箭头)。然而在CRF大鼠,细胞质表达Kv1.3增加专门的小圆细胞增殖在皮质间质(图
2 (c),箭头),表明白细胞超表达的渠道。
图2
Kv1.3和细胞周期标记表达虚假的操作(假的)和先进的CRF大鼠肾脏。(一)Kv1.3表达式。(a) KCNA3 mRNA丰富肾皮质的虚假的操作(假的)和先进的CRF (CRF)大鼠肾脏。(b)和(c)免疫组织化学使用抗体Kv1.3(布朗)虚假的经营和先进的CRF大鼠肾脏。大功率的皮质间质。放大,×60。(B)细胞周期标记表达式。mRNA丰富的细胞周期蛋白依赖性激酶4(到)(左)和p21(右)在肾皮质的虚假的经营和先进的CRF大鼠肾脏。#
P
<
0.05
而虚假的老鼠。值意味着±SEM (
n
=
6
)。差异分析方差分析Dunnett或学生的紧随其后
t
以及。
![]()
由于过度Kv1.3渠道会影响细胞周期进展在各种类型的癌细胞
22 ,
23 ),然后又介绍了细胞周期的表达标记,如细胞周期蛋白依赖性激酶4(到)及其抑制剂,p21(图
2 (B))。在CRF大鼠肾脏皮质到mRNA的表达明显增加,但p21的mRNA相比明显减少虚假的操作鼠肾脏。
3.3。选择性Kv1.3-Channel抑制剂对肾纤维化的影响和细胞周期标记表达式
获得的直接证据表明过度Kv1.3渠道实际上会导致白细胞的扩散和肾纤维化的进展,我们终于检查CRF大鼠肾脏与margatoxin治疗后,选择性Kv1.3通道抑制剂(
22 ,
24 ]。与margatoxin治疗CRF大鼠肾脏近端小管部分保留,尽管他们萎缩性(图
3 (A))。相比CRF大鼠肾脏没有治疗(数字
1 (b)和
1 (d)),皮质小间隙的大小是小(图
3 (一)),浸润白细胞的数量少得多(图
3 (b))。胶原蛋白的免疫组织化学三世,纤维化的标志,证明不染色的皮质间质margatoxin-treated CRF大鼠肾脏(图
3 B (B)和
3 B (a)),这表明margatoxin减少肾纤维化的进展。皮质到mRNA的表达明显减少margatoxin治疗后(图
3 (C)(左),和p21的mRNA在治疗后显著增加(右)。这些结果表明Kv1.3渠道的超表达在白细胞与促进细胞循环密切相关,因此与肾纤维化的进展。
图3
胶原蛋白三世和细胞周期标记表达式在先进的CRF大鼠肾脏margatoxin (MgTX)治疗。(一)苏木精和伊红染色(圆))先进CRF大鼠肾脏后margatoxin (MgTX)治疗。(一)低功耗的皮层。放大,×20。(b)的大功率视图皮质间质。放大,×60。(B)使用胶原蛋白的抗体免疫组织化学III(布朗)先进CRF大鼠肾脏有或没有MgTX治疗。(a)和(b)低功耗的皮层。放大,×20。(C)细胞周期标记表达式。 The mRNA abundance of Cdk4 (left) and p21 (right) in the renal cortex of advanced CRF rat kidneys with and without MgTX treatment.
P
*
<
0.05
与先进的CRF大鼠没有治疗。值意味着±SEM (
n
=
6
)。差异分析方差分析Dunnett或学生的紧随其后
t
以及。
![]()
4所示。讨论
在阻力指标在CRF大鼠肾脏纤维化,也许可以发展的炎症从骨髓白细胞最初招募和渗透引发肾间质成纤维细胞的增殖(
25 ]。尿毒症的进展,这种白细胞的数量被认为是减少由于循环淋巴细胞数目的减少(
26 ]。在先进的CRF,然而,目前的研究表明,大脑皮层间质中白细胞的数量大大增加了
原位 扩散,病理特征类似于急性肾小球肾炎(
27 ]。因为白细胞产生的细胞因子刺激纤维母细胞产生胶原蛋白的活性(
25 ),间质中的白细胞数量的增加会促进肾纤维化的进展,从而导致高级CRF的肾功能迅速恶化。
先前的研究已经证明Kv1.3-channnels超表达的细胞在不同病理条件下,包括癌症(
28 ,
29日 )和缺血性心脏病(
30. ]。有关机制参与这样的超表达的渠道,刺激转化生长因子-
β (TGF -
β )是一个最可能的候选人在巨噬细胞(
31日 ]。由于尿毒症毒素,如硫酸吲哚酚、移植TGF -的表达
β (
32 ),他们可能负责的超表达渠道在先进的CRF的白细胞。通过生成钙流入的驱动力,Kv1.3渠道表达的淋巴细胞触发细胞增殖所需的钙信号(
15 ,
16 ]。从我们的研究结果表明在癌细胞
33 ),膜超极化诱导的超表达渠道也将促进白细胞的扩散通过直接刺激细胞周期进程。
除了他们的角色在细胞增殖,Kv1.3渠道表达的淋巴细胞和巨噬细胞引发这些细胞的细胞因子的生产(
14 - - - - - -
16 ]。因此,超表达渠道的白细胞会对肾纤维化的进展可增加的影响。一项研究表明阻断intermediate-conductance Ca的治疗效果2 + 激活K+ 渠道(Kc一个 对肾纤维化3.1),因为纤维母细胞过表达渠道在病理条件下(
34 ]。从我们的研究结果,针对Kv1.3渠道在白细胞也会有用的先进CRF治疗肾纤维化。除了选择的通道阻滞剂之前开发(
35 ),我们最近证明,非甾体类抗炎药(非甾体抗炎药)的抑制作用,如双氯芬酸钠、水杨酸,吲哚美辛,Kv1.3在淋巴细胞中表达的渠道
36 ]。关于这样的属性,这些药物可能是有用的作为antifibrotic代理先进CRF患者。
总之,本研究首次证明白细胞的数量急剧增加与先进的CRF大鼠肾脏。Kv1.3渠道的超表达在白细胞被认为有助于肾纤维化的进展通过刺激细胞循环,促进细胞增殖。