IJMB 国际微生物学杂志 1687 - 9198 1687 - 918 x Hindawi出版公司 767314年 10.1155 / 2011/767314 767314年 研究文章 增长和细菌的识别 N-Halamine牙科单位水线油管使用超纯水来源 Porteous Nuala 1 罗 杰 2 Hererra 莫妮卡 3 Schoolfield 约翰 1 太阳 认为 2 Fialho Arsenio M。 1 部门综合牙科 圣安东尼奥德克萨斯大学健康科学中心 圣安东尼奥 TX 78229 美国 utexas.edu 2 生物医学工程项目 南达科他大学 苏福尔斯 SD 57107 美国 usd.edu 3 微生物学和免疫学 圣安东尼奥德克萨斯大学健康科学中心 圣安东尼奥 TX 78229 美国 utexas.edu 2011年 15 12 2011年 2011年 06 06 2011年 15 09年 2011年 19 09年 2011年 2011年 版权©2011 Nuala Porteous et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

这项研究检查了细菌生长和类型biofilm-controlling牙科单位水线(DUWL)油管(T)和控制制造商的油管(C)在实验室使用超纯源水DUWL模型是骑车穿过线。部分管道线路已分离,使用SEM成像检查对生物膜的增长在六个采样周期。细菌从内表面(T)和C,源单元,和水库是培养和枚举。在六个月时,生物分子识别的对齐匹配从三大爆炸搜索获得16 s地区。有1 - 3日志增加生物的生长在干净、未经消毒水库在一小时内。建立了生物膜的内表面C在三周内,但T。 变形菌门, Sphingomonas种虫害源储层中被识别和C线,和属的一种变体是T线。

 1。介绍

细菌生物膜的存在内部牙科单位水线(DUWLs)记录和被认为是一个无可争议的牙科病人治疗的污染水源( 1]。此外,由于大多数DUWL治疗方法有局限性,生物膜是具有挑战性的消除 2]。众多研究表明,生物膜DUWL港生物的多样化人口和至少40个属的细菌已确定在分子水平上( 3- - - - - - 5]。虽然早期鉴定技术培养,某些生物,如 假单胞菌种虫害和 Sphingomonasspp,通常发现在研究在全球范围内( 5- - - - - - 9]。系统发生的组 α- - - - - - 变形菌门已被证明是主要在氯化水分配系统和幸存者吗 Sphingomonas这些属种虫害紧密的结合在一起 10]。

大多数研究DUWL生物膜测试牙科单位使用源水从市政供水 11- - - - - - 13]。一些研究单位与源蒸馏水和测试表明,蒸馏水本身并没有阻止生物膜的形成没有并发,常规间歇DUWL清洗方案( 14, 15]。

没有先前的研究已经报道了生物膜增长当I型超纯水作为源水。这种类型的水溶解固体ppb(磅),建议使用洗涤/清洗半导体组件在制造和敏感的实验室分析方法( 16]。

本研究的目的是检查机体生长和类型,和生物膜发展biofilm-controlling的内表面 N-halamine DUWL油管与通用的制造商的聚氨酯油管使用超纯源水。的biofilm-controlling属性 N-halamine油管使用源代码自来水已在以前的工作中,作者和其他已发表( 17, 18]。

 2。材料和方法

使用修改后的执行测试实验室DUWL模型交付系统,第一次描述了由美国牙科协会(ADA) /美国国家标准协会(ANSI)工作小组 19]。细节模型设置在我们实验室前面描述的( 20.]。每周5天6个月期间,1500毫升水收集从纳滤/ uv净水器(Barnstead NANOpure钻石水净化系统)在干净、未经消毒收集瓶,转移到一个未经消毒聚碳酸酯水库,并通过两个5英尺长的部分注入硅的油管,然后 N-halamine测试(T)和通用的制造商(C)线的控制。C T和线路组成的 24 × 5 cm部分与2厘米部分硅管连接在一起。从线排水污水排放到覆盖玻璃烧瓶集合。计算机系统(科尔parm Masterflex系统)是用于设置每日流量从水库1.4毫升/分钟,5分钟到25分钟去模拟一个典型的工作日博士前的教学牙科诊所。

2.1。实验室抽样

有六个样本收集时间;1到4是每隔三周(周3、6、9、12);每隔六周5和6(18和24周)。每个集合初期间,水库的水被刷新并通过T和C线运行5分钟,以确保它的分布。这5分钟循环重复和实验室程序都按照标准的程序执行( 21)如下。

2.1.1。从源代码抽样单元、储层和内部油管表面

一百毫升(100毫升)的水从源净水器收集在一个无菌收集容器含有硫代硫酸钠(Idexx实验室。有限公司、英国)和冷藏。

三个部分的油管脱离T和C线(6×5厘米的部分)。附着细菌内的六个部分脱落,悬浮在磷酸缓冲溶液(PBS)通过推动无菌针腔冲洗和PBS无菌管。

一段油管从T和C线分离(2×5厘米的部分),每个放置在一个固定的甲醛和运输的电子显微镜实验室在UTHSCSA,部分被削减和准备与hexamethyldisilazane (HMDS)内表面的扫描电子显微镜(SEM)成像来检测生物膜的存在( 22]。

后步骤(A)、(B)和(C)完成,100年mL-sample水库的水收集在一个无菌容器中描述(一个)。

十倍系列稀释(A), (B)和(D)样本是用PBS和十分之一毫升(0.1毫升)的每个解决方案在R2A琼脂平板培养的一式三份,使用spread-plate方法。生物孵化在精神分裂症一般在20°C为7天,平均,报道意味着CFU /毫升。

每日8小时泵循环重新开始。

2.2。CFU /毫升数据的统计分析

三管部分样本分析T、C年底每个3 -或六周纯水曝光时间。T和C管样品的比较,学生的两个示例 t进行了测试以确定日志CFU /毫升的方式明显不同的T和C年底每个3 -或六周时间。此外,治疗油管意味着观察6次时间比较来确定整体研究治疗差异显著。对于所有的比较, P < 0.05 被认为是显著的。

 2.3。分子识别

在25周后细菌菌落是枚举,隔离R2A琼脂板上提交给美国微生物学和免疫学在UTHSCSA分子识别。来确定病原体,序列的方法使用16 s核糖体DNA区域作为目标分子识别执行隔离( 23]。

2.3.1。DNA隔离

隔离种植12 h在R2A琼脂37°C。一个铂环量在600年从每个盘子和暂停 μL细胞裂解缓冲(Promega,血液麦克斯韦LEV工具包)0.5毫升microfuge管。悬架是bead-beaten 45秒到1分钟帮助细胞壁分解,然后孵化与蛋白酶K 56°C,持续15分钟。暂停是颗粒状3分钟在最大速度microfuge根据制造商的指示。上层清液转移到麦克斯韦LEV墨盒,然后安装在自动麦克斯韦系统,导致150 ng / μL纯化细菌DNA的45分钟后运行。

 2.3.2。聚合酶链反应(PCR)

直接进行PCR反应3 μ50 L的DNA上层清液 μL反应使用5 ' PCR Extender系统(费舍尔科学公司,有限责任公司)根据制造商的指示。16 s使用引物扩增子得到(27 f 1525 r) ( 23]。PCR条件进行如前所述在5 ' Extender费舍尔手册。放大进行在ptc - 100 thermocycler (MJ研究、水城、质量,美国)使用预编的,三步协议的标准程序对所有反应和由35周期使用退火温度55°C和1分钟延长时间。一个5 μL整除的PCR反应是运行在0.7%琼脂糖凝胶和溴化乙锭染色证实放大。剩下的PCR反应(45 μL)是运行在一个凝胶,如上所述,凝胶纯化使用向导SV凝胶和PCR清理系统(WI Promega,麦迪逊,美国)和筛选了30 μL无菌H2O根据制造商的指示。

 2.3.3。测序

从PCR反应是准备测序获得DNA通过清洗Qiaprep旋转Miniprep工具包(美国加州试剂盒,瓦伦西亚),根据制造商的指示。纯化的DNA测序在UTHSCSA先进核酸核心设施。序列被用来执行个体nucleotide-nucleotide核糖体16 s地区搜索使用BLASTn算法在NCBI网站( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。识别计算基于百分比由对齐匹配从三大爆炸搜索获得16 s地区产生不同级别鉴定。百分比最高的三个身份为每个隔离细菌识别进行了分析。

 3所示。结果 3.1。细菌计数

见表 1直接从净化器,源水细菌计数测量单位为零,但呈指数增加,当储层中包含45 - 60分钟在实验室取样程序(一)- (C)。

几何平均数的细菌(CFU /毫升)源储层和内表面的测试和控制线路。

周 净化水源单位 水库水源 测试油管 控制管
3 0 1.08 × 10 2 5.10 × 10 0 2.08 × 10 2
6 0 6.84 × 10 1 2.39 × 10 1 2.03 × 10 2
9 0 1.39 × 10 2 3.20 × 10 0 1.01 × 10 2
12 0 1.08 × 10 3 7.84 × 10 1 1.19 × 10 2
18 0 7.27 × 10 1 6.78 × 10 1 5.68 × 10 1
24 0 1.22 × 10 2 3.79 × 10 2 1.91 × 10 3

三个日志增加细菌计数在C指出油管六个月,年底和细菌数量在T油管都低于美国疾病控制和预防中心建议500 CFU /毫升(表 1,图 1)。

几何平均数CFU /毫升细菌中发现T和C线和源水库。

总体来说3 - 24周,意味着日志CFU /毫升C T(相比没有明显不同 t = 2.09 , P = 0.063 ),见表 2。个人周,C明显大于T在周3 ( t = 3.48 , P = 0.025 ),9 ( t = 2.78 , P = 0.050 )、24日( t = 3.69 , P = 0.021 ),但没有观察到显著C和T对数平均差异对于其他个人周比较。

对数平均CFU /毫升细菌脱落在表面的测试和控制油管。

周 治疗 N 对数平均 日志性病Dev 几何平均数 t价值 P 价值
3 测试 3 0.784 0.719 5.1 3.48 0.025
控制 3 2.321 0.263 208.3 测试<控制
6 测试 3 1.397 0.338 23.9 1.73 0.159
控制 3 2.310 0.851 203.4
9 测试 3 0.627 0.737 3所示。2 2.78 0.05
控制 3 2.007 0.443 100.7 测试<控制
12 测试 3 1.900 0.747 78.4 0.37 0.729
控制 3 2.079 0.374 119.0
18 测试 3 1.838 0.923 67.8 0.09 0.936
控制 3 1.762 1.229 56.8
24 测试 3 2.580 0.296 379.4 3.69 0.021
控制 3 3.280 0.144 1905.6 测试<控制
所有的周 测试 6 1.521 0.738 32.2 2.09 0.063
控制 6 2.293 0.526 195.5
3.2。扫描电镜成像

在三周内,SEM成像显示细菌增殖和生物膜内部建立C油管表面没有显微镜下可见细菌T管的内表面上,见图 2。一些分散的细菌是可见的T管的内表面在研究结束的时期。

SEM(放大×5000)图像,图像显示了生物膜在24周的研究期间的增长和发展。

 3.3。生物识别

BLASTn结果16 s核糖体细菌地区返回以下最高%的身份。

<斜体>测试油管< /斜体>

隔离25 b1 Sphingomonasspp。身份977/977 (100%);

隔离25 b2 Blastobacterspp。956/956 (100%);

隔离25 b2b Erythromonas ursincola956/956 (100%);

隔离25 b2c Sphingomonas游泳馆956/956 (100%);

隔离25酮 Erythromonas ursincola1369/1389 (99%);

隔离25 b-3b Sphingomonas游泳馆1369/1389 (99%)。

<斜体>控制油管< /斜体>

隔离27 a - 1 Sphingomonasspp。1350/1352 (99%),

隔离27 a-1b Proteobacterium共生有机体1350/1352 (99%),

隔离27 a - Sphingomonasspp。982/982 (100%);

隔离27 a - 3 Sphingomonas游泳馆977/980 (99%)。

<斜体> < /斜体>源水库

隔离颈- 1 8 Sphingomonas仕达屋优先计划 。980/980 (100%),

隔离8 c - 2 Proteobacterium共生有机体的摘要选择性959/960 (99%)。

4所示。讨论

这个研究表明,水的生物指数级的增长在一个小时内当I型超纯水是包含在一个干净的,未经消毒,水库聚碳酸酯瓶刷新在每个工作日的开始。生物的生长起源于清洁,未经消毒收集瓶,或水库,或两者兼而有之,后续的生物膜的形成的内表面未经处理的控制DUWL油管。早期的生物膜殖民者是建立在控制油管,星期3,SEM图片上看到。

细菌培养的水平从 N-halamine油管仍在环保局饮用水标准/美国疾病控制与预防中心推荐水平的整个研究期间500 CFU /毫升。作者之前的研究的观察表明,细菌水平 N-halamine油管在每个时间间隔均明显与相应的细菌源水,后三周遗留效应T源水位恢复到可接受的水平。作者将此归因于乘法的有机体在死水T,即使没有生物膜的形成( 18]。这项研究的结果似乎证实了那些早期发现细菌含量的增加周12日18日和24日发生在源水的增加cfu在第12周(图 1)。这些发现再次强调需要确保交付高质量的源水通过牙科单位倾斜的水样和文化仅仅是一个细菌活动的快照在水质监测以来尚未完成之间的采样周期。

扫描电镜成像显示,没有生物膜的形成在整个研究期间,没有明显的细菌生长 N-halamine油管直到24周,尽管孤立的生物是在18周可见。的一个因素会影响杀生的功效与细菌接触时间( 24]。的杀生的性质 N-halamine,充电,是由于氯交换与接触微生物( 25]。在这项研究中,活性剂,covalently-bound氯,可能是消费过程中六个月,从而耗尽其抗菌性和指示需要氯充电24周之前。当前研究的局限性之一是6个月时间,进一步的研究将评估的影响充电24周再生的影响。

这些细菌也有可能捕捉到SEM图像在24周可能已经过期,被开除是浮游细菌。培养鉴定,居住隔离只执行在这项研究中,而有必要收集和处理死亡的微生物,或直接从水源CFU计数较低的生物。确认本研究局限性也抑制了我们的能力,与其他生物分子测序,可见在扫描电镜图像。有更多新奇的DNA提取和更好的诊断方法选择性种特异的探针检测多个生物通过实时PCR分析,可以准确地检测和量化微生物生物膜的增长更准确,而无需依靠文化识别未来的研究。

其他研究人员已经证明,一个基因突变或过度会导致杀生的阻力当杀生的代理用于低浓度( 26]。先前的研究发现细菌分离株对次氯酸钠和大多数的生物属于 变形菌门属( 27] 。在这项研究中, 变形菌门种虫害和 Sphingomonas种虫害源储层中被识别样本也从内部控制油管分离,而一个更大的多样性的细菌物种属于系统发生的 变形菌门集团从内部被孤立 N-halamine油管。本研究的另一个局限性是每个隔离的故障测试耐氯在不同时间点,如前所述,马丁et al。 28]。

 5。结论

从纳滤- I型超纯水/ uv-treated净水器收集在一个未经消毒瓶成为污染转移到水库后不到一个小时,和六个月的时间内,在未经处理的控制水线形成致密的生物膜。的biofilm-controlling N-halamine测试油管在整个研究期间阻止生物膜的形成。然而,一些分散的生物的测试油管的研究期间,被确认为一种变体的属 变形菌门发现源酸瓶中。这可能是解释为一个或所有以下原因。

的biofilm-controlling属性 N-halamine测试油管可能已经成为了研究结束的时期,在那个时期应该是充电;

有机体可能成为抗氯和经历了一个生态适应 N在研究期间-halamine油管。

进一步的研究在较长一段时间,使用超纯源水处理中包含抗菌水库之前交付 N-halamine测试油管是必要的。生物识别和耐氯在增长 N -halamine油管在更长一段时间也是很有必要用小说的DNA提取方法。这个过程可能提供线索的生态适应生物,最终为解决牙科单位水线污染的问题。

 确认

这项研究是由国家卫生研究院赞助,NIDCR(批准号R01DE018707)。作者要感谢布莱恩·维克博士的指导,和伊丽莎白·k·迈克尔,文学士学位,微生物学和免疫学,UTHSCSA, for laboratory assistance on this project.

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