N-TAP设计通过修改c端串联亲和标签(C-TAP)费尔南德斯et al ., 2009 9]。这顶帽子标签被放大,使用c端标记( 9作为模板和PCR引物(图 1(一))设计添加TEV蛋白酶裂解位点的引物和glycine-alanine重复和额外的NotI-cloning网站反向引物。HindIII-NotI片段被插入到p3XFLAG-CMV-10 polylinker地区(σ)与3 xflag(图框架 1 (b))。鼠标雄激素受体cDNA克隆(礼物教授Jan Trapman病理学系鹿特丹伊拉斯谟MC / JNI)被替换修改开始蛋氨酸ATG NotI站点定向诱变(Stratagene)和2.787 kb NotI-BHI完整鼠标cDNA引入N-TAP-CMV-10向量(图 1 (c))。N-TAP-mAR融合构建测序证实了。

总共10⁵COS-1或海拉细胞/被播种在DMEM 12-well组织培养板,包含10% charcoal-stripped血清。细胞是暂时性的转染使用Fugene(罗氏)或Lipofectamine 2000(表达载体)25 ng AR或N-TAP-mAR 500 ng pGRE-luciferase和25 ng pTK-RL根据制造商的指示。转染后12到16小时,媒介是DMEM取代,含有10% charcoal-stripped血清+或者−10 nM二氢睾酮(DHT;σ)。24小时后,细胞收获和细胞溶解25毫米甘氨酸(pH值7.8),MgSO 15毫米₄,EGTA 4毫米,二硫苏糖醇1% triton×100和1毫米。荧光素酶检测的试剂进行nanolight技术和荧光素的比例:renillaluciferase活动测量使用特纳TD-20/20光度计。标准误差与三个独立转染实验。

雄激素敏感细胞株PC1和MFVD鼠标尿道担任控制细胞系nonmodified状态。个人电脑1细胞株是一份礼物从荒木等。 4)和MFVD细胞系的礼物Umar et al。 5]。PC1细胞系是附睾的细胞系无限增殖与SV 40大t抗原和详细关于形态学特征( 4),上皮和epididymus特定基因的表达( 4),而雄激素反应( 10]。MFVD细胞系是它由一个温度敏感的SV 40大t抗原的表达,而是间充质来源。MFVD细胞来源于胎儿(18 d.p.f。沃尔弗氏管)鼠标输精管和显示的特性间充质细胞和雄激素反应( 5]。细胞系都不断培养条件下给其他地方( 4, 5]在5 nM mibolerone,合成雄激素。

控制细胞系PC1和MFVD转染与脊髓(细菌耐氨苄青霉素)独特的网站使直线化N-TAP-mAR向量使用Lipofectamine 2000(表达载体)。48小时后,转染细胞被稀释的山肩10⁵-10年³细胞/ 14厘米直径盘和G418抗性与750年克隆选择 μg / mL G418 (PC1)和250 ug /毫升G418 (MFVD)。单一的殖民地来与克隆挑戒指,长大为N-TAP-mAR表达式和测试使用国旗M2抗体免疫印迹分析和免疫细胞化学(σ)和AR-N20抗体(Santa Cruz)。

PC1细胞,来源于鼠标近端头epididymus,它由一个温度敏感的SV 40大T抗原的表达,在33°C,不断培养大的宽容温度T的5 nM mibolerone。在生理温度(37°C),细胞生长在一定程度上抑制和T-antigen-expressing细胞可以存活 11]。大T然而退化后长期暴露的细胞非许可的温度(39°C),然后发生显著的细胞死亡,细胞不会恢复( 11]。防止细胞死亡,但仍然对增殖有抑制作用早期通过PC1和P17细胞培养至接近融合在33°C,然后保存1周在生长介质的37°C包含5 nM mibolerone之前准备的细胞质和核提取物仍然健康的细胞。提取由增殖PC1和P17细胞,这些细胞被种植在33°C包含5 nM mibolerone生长介质。类似数量的细胞颗粒的扩散和nonproliferating细胞蛋白质提取处理。

细胞来自subconfluent文化洗,使胰蛋白酶化,颗粒状的离心和洗3 x在寒冷的PBS。完整的细胞溶解产物,细胞细胞溶解在SDS加载缓冲区(0.03125米三pH值6.8、5%甘油、0.001%溴酚蓝3,1% SDS, 2.5% β巯基乙醇)。样品受到钠十二烷基sulphate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page),转移到聚乙二烯二氟化物膜,阻止和探测磷酸盐(150毫米氯化钠,氯化钾3毫米,10毫米磷酸盐(mono和氢)(pH值7.3),0.05%(卷/期)渐变20)含10%脱脂奶粉。主要抗体被用于推荐的稀释和辣根peroxidase-conjugated二级抗体(Dako)和ECL +印迹检测试剂(Amersham)或SuperSignal西方毫微微(热科学)是按照制造商的指示使用。SRC-1 (128 e7)和CTNNB1(9587)抗体购自内,国旗M2 (F3165)σ,和N20-AR (sc - 816), NR3C1 (sc - 8992), SMARCC1 (sc - 9748), ACTB从圣克鲁斯(sc - 81178)。

蛋白质提取协议是一个修改版的染色质的组蛋白提取协议co-purification Saade et al ., 2009 12]。细胞生长在14厘米直径菜融合(10个盘子PC1或20板P17给约700 μL细胞体积),洗3 x prewarmed PBS, trypsinised 1毫升trypsin-EDTA(σ)/板5分钟37°C,灭活与媒介,集中在50毫升猎鹰,spun1200 rpm 5分钟RT,洗3 x冷(4°C) PBS。细胞被转移到一个2毫升microfuge离心管和颗粒状的6500 rpm在4°C 2 - 3分钟。丸(2×200 μL)在2×1.8毫升resuspended低渗的缓冲区(10毫米三pH值7.5,氯化钾10毫米,1.5毫米MgCl,特里同0.1%,4.5毫米 β巯基乙醇蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏)5 nM mibolerone, 1毫米Pefabloc(罗氏)和Phosstop(罗氏))由上下移液和涡流大力最高设置为15秒之后,45分钟孵化冰上涡流每10分钟。原子核旋转在4°C 13.000转5分钟,上层清液,称为胞质分数,转移到一个干净的管和氯化钠添加到15毫米。这个胞质部分添加到FLAG-M2耦合的磁珠(ca。5毫克)保持一个整除后细胞溶质输入分数页面。耦合的磁珠(Dynabeads m - 270环氧树脂从英杰公司)的国旗M2抗体(σF3165)是根据制造商的指示执行。胞质提取物对珠子旋转1小时最低在4°C。核了蔗糖缓冲区(0.34蔗糖,10毫米三羟甲基氨基甲烷pH8液,3毫米MgCl₂1毫米CaCl₂150毫米生理盐水1毫米德勤,蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏),5 nM mibolerone, 1毫米Pefabloc(罗氏)Phosstop(罗氏))150 μL / 100 μL细胞颗粒和resuspended。0.3单位微球菌的核酸酶从σ(0.1 U / μ三羟甲基氨基甲烷/ 0.1毫米CaCl液L在10毫米₂pH8) 100 μL核提取物添加和孵化为30分钟37°C。提取与1体积的蔗糖被稀释缓冲和用6×10秒在冰上10秒脉冲和10秒冷却波动交替。提取终于装上国旗M2-coupled磁珠和旋转至少1小时在4°C在寒冷的房间。上层清液保持在装货前流过,整除的珠核输入。潜伏期后,珠子含有细胞溶质的准备与低渗的洗水洗3 x缓冲区(10毫米三pH值7.5,10毫米氯化钾,1.5毫米MgCl,特里同0.1%,4.5毫米 β巯基乙醇蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏)5 nM mibolerone, 1毫米Pefabloc(罗氏)和Phosstop(罗氏)NP40 0.5%, 0.05%钠脱氧胆酸盐,0.005% SDS, 15毫米氯化钠)或蔗糖缓冲区(核预备)紧随其后3洗TEV缓冲区(0.05米三pH值8,德勤1毫米,0.5毫米EDTA)补充了蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏)mibolerone(5海里),和磷酸酶抑制剂(Phosstop和Pefabloc(罗氏)和生理盐水to15 mM氯化钠在胞质和150毫米氯化钠在核TEV缓冲区。珠子终于了100 uL TEV缓冲区和绑定蛋白复合物被筛选了10单位TEV蛋白酶(GST-tag) (TEVP美国生物)在RT 1小时。蛋白质浓度筛选了部分由布拉德福德分析决定。珠子被保存在PBS回收。

胶体coomassie染色蛋白质乐队(胶体蓝染色设备,英杰公司)切除后5%的页面分离7片覆盖范围的大小48 kDa的凝胶。MilliQ水凝胶片简要洗净,保持在水−80°C,直到提交“剑桥蛋白质组学服务”,所有质/ MS实验使用Eksigent NanoLC-1D + (Eksigent技术、都柏林、CA)高效液相色谱系统和一个LTQ Orbitrap Velos质谱仪(ThermoFisher沃尔瑟姆,MA)。肽是由反相色谱分离使用300 nL /分钟的流量和一个LC-Packings (Dionex,桑尼维尔CA) PepMap 100列(C18, 75 μM身份证。×150毫米,3 μ米颗粒大小)。肽被加载到一个precolumn (Dionex赞誉PepMap 100 C18, 5 μ米颗粒大小,100,300 μM身份证。×5毫米)从autosampler 0.1%甲酸5分钟的流量10 μL / min。后这段时期时,打开阀门,让洗脱肽的precolumn到分析柱上。溶剂是水+ 0.1%甲酸和溶剂B甲酸乙腈+ 0.1%。使用的梯度是5 - 50%在45分钟。LC洗提液喷入质谱仪nanospray源通过一个新的目标。所有 m / z淋洗离子测定的值在一个Orbitrap Velos质量分析器,设定在30000年的一项决议。数据依赖扫描(前20名)被自动隔离并生成collision-induced离解碎片离子的线性离子阱,导致MS / MS谱的生成。离子的电荷状态2 +以上被选为碎片。

运行后,数据加工使用蛋白质发现者(版本1.2。ThermoFisher)。简而言之,所有MS / MS数据被转换为mgf(文本)文件。这些文件被提交给吉祥物搜索算法(矩阵科学、英国伦敦)和搜索Uniprot鼠标数据库,使用固定的carbamidomethyl修改和修改变量的氧化(M)。

稳定MFVD和PC1克隆表达N-TAP-mAR开发节中描述 2。总蛋白提取几个克隆和分析N-TAP-mAR表达式通过免疫印迹使用国旗和AR-specific抗体(数据未显示)。第二个标准是N-TAP-mAR的核本地化,由免疫荧光检查在几个克隆使用国旗和AR-specific抗体。MFVD细胞系(M7)和一个PC1细胞系(P17)被选择的基础上,他们表达了类似的水平的稳定综合N-TAP-mAR和内源性野生型AR (WT AR)。都是主要位于细胞核在与5 nM mibolerone(图中补充 2(一个))。N-TAP-mAR transactivation属性的测试因为细胞的cotransfection GRE记者构造,与表达水平证实了免疫印迹(数字 2 (b)和 2 (c))。表达水平稳定,允许相当大的细胞成长。

不同的蛋白质纯化协议生产核和胞质细胞提取物进行了测试。商用净化用品和染色质的修改版本净化协议(FLAG-antibody捕获)相比,后者被选中。FLAG-antibody捕获了一个很好的恢复N-TAP-mAR当M7的摘录(图做准备 3(一个)(图)或P17细胞 3 (b))。已知coregulators SRC-1和CTNNB1 copurified P17提取但不是在M7提取物。试图优化他净化条件未果;镍亲和纯化的PC1 (N-TAP-mAR -控制)染色质提取了高镍树脂背景与非特定的蛋白质绑定。33°C的细胞株增殖生长受温度敏感SV40 t抗原;和扩散停在37°C。图 3 (c)演示了一个制备凝胶TEV protease-eluted蛋白质纯化P17细胞核的细胞培养在33°C和37°C。凝胶片被选为LC - MS / MS,和数据处理用吉祥物搜索引擎在剑桥中心蛋白质组学。

女士从质/搜索结果描绘成肽和分组匹配蛋白达到使用一个简单的吝啬算法( http://www.matrixscience.com/)。只有那些离子分数超过0.05的意义阈值(1 20的几率被一个假阳性)导致了分数。这将转化为1500肽下降质量公差窗口内的分数≥45岁。已知AR-interacting蛋白( http://androgendb.mcgill.ca)确定蛋白质中支安打,表中列出 1随着各自肽的分数。在第一个质量规范分析,我们确定了1196年旗帜AR相关蛋白质纯化提取物从nonproliferating细胞增殖细胞和1456。882这两个组之间是很常见的,314只捡起国旗从增殖细胞方法进行了净化,574只捡起国旗从nonproliferating细胞方法进行了净化。功能分析是使用web工具“大卫”[ 6, 7)和“g:分析器”( 8),提供功能丰富功能的途径,生物过程,分子功能、代谢功能、细胞定位、蛋白质-蛋白质之间的关系,和共享的转录因子结合位点。只有通路和生物过程,得到最高的分数是利用。

相同的基因列表提交给大卫也提交给基因本体在线工具g:分析器的功能特性。“转录调控”并不是一个高得分生物过程”这一次,而“基因表达“得分在温度过高,许多基因重叠的类别(表 2)。为前列腺癌也在这里Kegg通路组件显示的温度,但只有4(一半,AR, CTNNB1 TRP53)如表所示 3。

观察到一些AR-interacting蛋白质只有在增殖细胞中检测到和其他只在nonproliferating细胞(表 1)可能只是意味着细胞提取物的质量变化和更少的蛋白质存在于提取之一。另一个原因可能是,这些蛋白质的表达水平改变在细胞增殖过程中,和更少或更多的蛋白质可与基于“增大化现实”技术的互动。第三个选项是,基于“增大化现实”技术的相互作用蛋白的亲和力与细胞的增殖状态的变化。为了解决这些问题,我们进行了西方的屁股,探索那些AR-interacting差异表达的蛋白质(图 4)。

没有重大差异表达观察探讨了提取时AR-N20和ACTB控制抗体,但差异被发现。NR3C1表达在nonproliferating更高水平和增殖P17细胞,和表达水平的SMARCC1略低nonproliferating (37°C) PC1 / P17相比,增殖细胞(33°C)。不同的基于“增大化现实”技术copurified SMARCC1增殖与nonproliferating NR3C1不是一样引人注目的是,和大量“低表达”的温度可能是太小被质谱法检测。P17细胞的增殖状态似乎影响SMARCC1和NR3C1表达水平本身SMARCC1表达式是NR3C1表达式是在增殖细胞。然而,失去NR3C1增殖细胞中表达不太可能占AR结合观察到的所有损失。类似的损失SMARCC1 nonproliferating细胞表达并不占所有损失检测AR绑定。因此,表达水平coregulators和亲和力的基于“增大化现实”技术可能导致观察到的差异33°C和37°C coregulator概要文件。N-TAP-mAR本身似乎GR表达水平增加至少3倍nonproliferating条件下比较PC1 GR表达和P17输入样本(图 4)。

常见的通路富集或过多的增殖和nonproliferating AR标记方法进行了净化生物过程“转录监管”和“基因表达”。考虑到雄激素受体分为转录因子,在这些类别预计高分。得分高得惊人,BIOCARTA通路不涉及基于“增大化现实”技术,如“hSWI / SNF ATP-dependent染色质重塑复合物”和“控制基因表达的维生素D受体(VDR)”(图 5),其中包括WINAC chromatin-remodelling复杂。WINAC和瑞士/ SNF复合物BAF组件(Brg1-associated因素)。BAF复合物的要求已被证明 在体外对于ligand-dependent transactivation核激素受体,如维生素D3受体类维生素a X受体,过氧物酶体proliferator-activated受体PPAR - γ( 16]。它也被证明 在活的有机体内糖皮质激素受体的结合——(NR3C1)依赖转录( 17),染色质重塑干扰素和病毒诱导基因( 18)和神经发育的单元开关npBAF(神经progenitors-specific)染色质重塑复杂,从神经干/祖细胞的转变postmitotic神经元( 19),但也从未与AR。维生素D3受体没有被确认为AR-interacting蛋白质在我们净化(数据未显示)和。然而,基于“增大化现实”技术transactivation可能刺激WINAC复杂的组件。船舶和AR可以争夺coregulators共享,这将解释观察雄激素抑制VDR [AR刺激的 20., 21的差别),而基于“增大化现实”技术的对这些核刺激VDR LnCAP细胞水平( 21]。WINAC复杂的组件可能潜在coplayers AR transactivation,可测试siRNA cotransfection细胞系实验。G-profiler,不提供一个工具如BIOCARTA,还发现了BAF组件过多。另一个过多路径是前列腺癌途径,这是由生物信息学工具。G-profiler不确定EP300那样一个基因参与了前列腺癌是由大卫(表 3底部)。还“Kegg癌症通路”是由两个生物信息学工具:g-profiler标识相同的基因列表中AR-interacting蛋白质被称为“大卫”,只有不包括RB1 g-profiler基因列表(表 3底部)。

男性生殖器发展和《有关生物过程是“胚胎发展”,这是代表有13个基因被g-profiler和11被大卫。的重叠(表10 4)。脊索动物的胚胎基因被大卫是限制发展和不包括CTNNB1 HDAC1 TGFBI1,尽管CTNNB1和HDAC1“爆震出局”鼠标已被证明导致发育表型( 22, 23]。G-profiler没有接EP300。EP300的作用模式和发展是由研究在小鼠EP300表达式中断[ 24]。生物信息学工具大卫和g-profiler互补在这项研究中识别雄激素受体调节通路和生物过程。

在未来我们的目标是用N-TAP-mAR替换内生基于“增大化现实”技术。我们希望能够应用国旗净化协议测试在这项研究中识别差异蛋白质组由相应的基于“增大化现实”技术的突变造成的。蛋白质纯化方法,确定辅助因子的差异显示招聘的基于“增大化现实”技术的扩散和nonproliferating条件下鼓励进行进一步的实验旨在识别特定的相互作用蛋白质概要AR与《国家相关突变体。