1。介绍
口腔舌鳞状细胞癌(OTSCC)是最普遍的头部和颈部癌症,和神秘的颈部转移的主要预测结果患者早期OTSCC [
1 - - - - - -
4 ]。在文献中,已经证明,原发肿瘤的浸润深度与区域淋巴结转移率显著相关(
5 - - - - - -
7 ),但具体的截止值的深度渗透区分高风险和低风险的患者仍存在争议
8 ,
9 ]。最近,甘利et al。
10 ]表明,患者病理t1 - t2 / N0 OTSCC比预期更大的脖子,失败主要发生在患者原发肿瘤大于4毫米厚度。
众所周知,OTSCC的组织学特性各不相同,内部不同地区之间相同的肿瘤,并已给探索具体的入侵模式可能有预后价值。共识是肿瘤发展中,不同模式的入侵是由肿瘤细胞之间的交互和限定基质环境(
11 ,
12 ),大多数有用的预后信息可以推导出最深的入侵前的肿瘤,发现最激进的细胞可能(
13 - - - - - -
15 ]。在文学,深的入侵模式OTSCC通常分为三个或四个类别,如(i)推动类型well-delineated渗透边界;(2)扩散类型与浸润固体绳索,乐队,和/或链;和(iii)破坏类型广泛细胞分裂小组和/或单个细胞(
8 ,
16 - - - - - -
18 ]。对入侵模式和临床结果之间的关系,许多研究认为患者的预后OTSCC展品pushing-border入侵模式比扩散和毁灭性的入侵类型(
8 ,
14 - - - - - -
18 ]。然而,OTSCC转移亚临床的倾向仍然很难预测仅仅通过显微镜检查
19 ,
20. ]。
一个重要的考虑是,肿瘤恶性肿瘤的组织病理学特征通常是诊断从二维(2 d)显微镜发现,而肿瘤恶化实际上发生在一个三维(3 d)微环境。最近的计算能力和软件复杂性的发展促进了解剖和病理结构的三维重建
21 - - - - - -
24 ]。我们先前描述的发展技术重建tumor-host环境使用串行组织学部分人类癌症档案石蜡包埋标本的
25 ]。在当前的论文中,我们使用双免疫染色和pan-cytokeratin Ki67抗体相关微观2 d和3 d发现肿瘤对异构架构在T1 / T2 OTSCC最深的入侵。本研究的主要目的是直接可视化的组织架构tumor-host接口和定量评估的入侵方式的单一细胞和细胞团内的三维微环境。
2。材料和方法
2.1。病人和舌癌病例
在目前的研究中,我们包含了14名患者早期(cT1-T2 / N0) OTSCC治疗和埼玉县的日本牙科大学癌症研究所2000年和2009年之间。病人记录从档案检索OTSCC记录基于以下标准:(a)患者根治手术作为第一线的管理(即。,没有术前化疗和放疗);(b)石蜡包埋组织标本的原发肿瘤是可用的;和(c)的临床随访数据至少24个月或直到死亡记录。病人组包括九个男人和五个女人平均58岁(范围:33 - 82年)的诊断。尽管所有患者N0表示,八个神秘颈部病变发现了在后续没有失败在主站点。基于整个肿瘤病变的显微图像(见补充材料板S1网上
http://dx.doi.org/10.1155/2013/482765 ),肿瘤的生长模式分为三种类型,即表面传播,外生型的,内寄生的。这些OTSCC病例的临床和病理特征如表所示
1 。档案的使用人体组织在这个研究是依照本法规定《赫尔辛基宣言》的研究涉及人体组织和机构审查委员会批准的日本牙科大学和埼玉县癌症研究所。
表1
14 OTSCC患者的临床病理特征。
OTSCC情况下
年龄(岁)
性
- t
增长模式(1)
深度入侵(2) (毫米)
神秘的转移
一个
51
米
T1
党卫军
1。9
−
B
59
米
T1
党卫军
2。4
+
C
82年
F
T2
在
2。5
+
D
52
米
T2
党卫军
2。6
−
E
53
米
T1
前女友
2。8
−
F
52
米
T2
前女友
2。9
+
G
60
米
T1
党卫军
3所示。3
−
H
78年
米
T2
在
3所示。5
+
我
55
F
T1
前女友
3所示。6
−
J
57
米
T1
党卫军
4.6
+
K
40
F
T2
在
7.0
+
l
76年
F
T2
在
7.6
+
米
69年
F
T1
在
10.6
+
N
33
米
T2
在
附加说明
−
(
1
)
宏观经济增长模式的OTSCC分为表面扩散(SS)、外生型的(前),和内生(EN)类型。
(2) 入侵的深度测量的水平相邻正常粘膜表面的最深的部分肿瘤入侵。N,测量是不适用(附加说明)。
2.2。准备组织部分
我们首先从14重新审视了原发肿瘤病变的病人准备从档案formalin-fixed HE-stained和cytokeratin-immunostained部分,石蜡包埋组织块。入侵的深度测量水平的最近的相邻正常粘膜的程度最深的肿瘤入侵舌头肌肉组织。考虑异构组织学观察到局部区域特征,我们收集核心直径3毫米的标本来自多个深入侵网站的整个肿瘤病变使用tissue-array装置(kim我模型,Azumaya、东京、日本;图
1 (b))。形态学数据三维重建,提出了一个代表站点为每个鳞状细胞癌(补充材料,板S1)。所选组织核心标本reembedded连续石蜡和组织学的4
μ 米厚度是准备使用电子电动旋转式切片机(355年代Microm HM, Microm国际GmbH,老总孔翰宁德国;图
1 (c)),它已被成功地用于由其他人准备串行部分(
22 ]。一个至关重要的核心技术是使用一个组织标本的直径3毫米,使我们始终从感兴趣的地区80 - 120年连续获得部分的厚度和最小失真(图
1 (c))。这些串行部分安装在玻璃幻灯片,通常在三行(图8 - 9部分
1 (d))。因为它的数量降至最低,玻片用于免疫染色,所述后,促进了自动图像配准,这种管制安排载玻片上的圆形串行部分辅助histology-based 3 d重建的有效执行,否则将会相当的时间和劳动密集型的。
图1
(a)原始pan-cytokeratin-stained OTSCC病变的图像。酒吧= 1毫米。(b) Tissue-array装置用于收集的核心活检3毫米直径从最深的入侵前(见板S1)。(c)制备串行部分(4
μ 米厚的)从核心标本使用旋转式切片机。串行部分转达了
通过 连续层状水流直接从刀口水浴加热。(d)三排9部分是安装在每个载玻片疣状Ki67和CK鸡尾酒。(e)组织学图像都是使用虚拟显微镜数字化。
![]()
2.3。免疫组织化学
我们首先建立了免疫反应性的OTSCC病变使用一系列anticytokeratin抗体,因为癌细胞通常异构对细胞角蛋白的表达。从这个分析,我们选择的三个抗体(AE1 / AE3、34
β E12汽油,MNF116;以下称为CK)为我们的3 d重建,这CK鸡尾酒强调癌细胞浸润和团入侵前按照文献[
20. ]。疣状串行部分之前,幻灯片在二甲苯deparaffinized 3×5分钟,患者通过分级乙醇蒸馏水,孵化20分钟3%氢过氧化物酶在PBS抑制内源性过氧化物酶活性,然后加热在TE缓冲(0.01 Tris-HCl EDTA + 1毫米;pH9.0在98°C) 60分钟抗原检索。冷却到室温后(约60分钟),部分被孵化5%脱脂奶在PBS 20分钟在室温下阻止非特异性蛋白质绑定。双免疫染色的部分最先孵化一夜之间在4°C Ki67主要抗体(MIB-1, 1: 100;DAKO、东京、日本),然后使用Vectastain精英ABC开发工具包(鼠标;美国向量实验室Inc .,伯林盖姆,CA)。向量SG (sk - 4700,蓝色/灰色;向量实验室Inc .)是用作peroxidase-mediated反应的底物。后Ki67疣状,部分TE缓冲在微波炉中加热5分钟在90°C抗原检索。 For detection of tumor parenchyma using the CK cocktail, the same sections were processed using a labeled streptavidin-biotin (LSAB) method according to the Ventana DAB Universal Kit and an automated staining apparatus (NexES IHC, Ventana Medical Systems, Oro Valley, AZ, USA). Slides were mounted with EntellantNew (MERCK, Darmstad, Germany).
2.4。组织学图像数字化
红绿蓝(RGB)彩色图像的连续组织学部分是用20 x目标虚拟显微镜(NanoZoomer HT、滨松光子学、滨松,日本)(图
1 (e))。为了确保可再生的图像采集,色彩平衡校正进行了使用一个空白的参考标准根据制造商的程序。制造商也提供了查看软件的扫描模式可以自由调整自动捕获单个圆形组织学方面根据他们的载玻片上进行数值顺序。整个系列的存储后组织学数字化图像(分辨率为0.92
μ 每像素5120×4096像素,60 MB,和32位RGB TIFF格式),整个循环肿瘤区域转置到台式电脑(见下文)使用抓帧器软件(TRI-SRF2 Ratoc系统工程有限公司、东京、日本)。
2.5。图像配准、分割的组织组件和几何重建
图像配准(连续组织学图像的粗糙和细对齐)和分割(识别图像目标边界的结构)进行了使用开源ImageJ软件被认为是提供实际的解决方案来管理内存和自动化的方法在三维注册和可视化
26 ]。具体来说,我们使用ImageJ插件(StackReg TurboReg,颜色反褶积)计算的图像配准和RGB颜色分割。这个开源软件提供色彩分割的巨大优势渠道具体民建联和向量SG用于我们double-immunostained部分。
在这项研究中,80 - 108年连续捕获的图像的叠加(如图
2(一个) )在一个自动化已成功完成,由算法的方式。通过浏览图像栈,证实肿瘤架构是平稳连续相邻切片没有明显的不规则性和几何失真在肿瘤内部和表面轮廓描述(图
2 (b) )。完成自动图像配准是一个至关重要的条件制备regularly-oriented优质串行部分,因为计算对齐串行部分取决于近似初始登记正确的性能变化和旋转的部分在玻片上。同样值得注意的是,我们没有使用算法图像变换,如拉伸或收缩图像
x
- - - - - -
y
尺寸调整为小章节之间的失调;图像配准在我们的经验中,引入ImageJ仿射图像实际上变压器导致恶化的质量形象堆栈而不是改进。
(一)连续组织学图像的图像配准
z
设在。(b)矢状正交视图包含一个图像的中心叠108串行部分,显示成功叠加没有明显不规则或在内部组织几何失真。酒吧= 0.5毫米。((c) - (e))分割的癌细胞和Ki67-positive核:(c)原始double-immunostained图像与民建联和矢量SG色原体;(d)细分CK-positive癌症细胞的细胞质,显示为紫色的伪彩色(注意,Ki67-negative核仍开放分段细胞质内);和(e)基质(黄色)减法后肿瘤实质(有关详细信息,请参阅文本);(f) Ki67-positive核(红色)获得由ImageJ SG颜色分割。酒吧= 50
μ m。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
(e)
![]()
(f)
![]()
图像分割的肿瘤架构(数据
2 (c) - - - - - -
2 (e) )进行使用ImageJ DAB-color分割基于CK-positive鳞状细胞癌的细胞的免疫组织化学特征。分割后的肿瘤实质体积,体积RGB颜色数据倒在二进制代码的一种形式。此后,基质体积被减去计算薄壁组织体积从整个组织体积。根据相同的计算逻辑,根据ImageJ Ki67-positive核都贴上SG-color分割过程(图
2 (f) ),然后划分为两个部分:核嵌入到CK-positive癌症细胞质和细胞核内整个基质体积。在这个细分的核,我们采用了所有对象分配的标准核必须至少两个连续图像之间的连接。因此,任何二进制信号在一个图像平面上,没有连接到任何相应的对象在相邻图像被删除噪音。细分为每一个微观领域的结果验证了覆盖原文分段元素应用电脑屏幕上的图像。
最后,一个串行堆栈的图像被用来重建3 d标本的配置。
Z
深度调整每个薄片的厚度(4
μ 米)要准确的3 d表示组织体积。体系结构的三维体绘制整个肿瘤和分段组件执行使用VG工作室Max软件(体积图像有限公司、海德堡、德国),提高了质量调整不透明度和颜色的三维可视化重建目标组件的空间。
2.6。肿瘤的三维形态测量学建筑和核扩散活动
基于3 d体积信息,定量评估进行了使用RATOC SRF2软件。感兴趣的参数的数量肿瘤实质和间质(毫米3 );的面积分割parenchymal-stromal边境(毫米2 );Ki67-positive核的数量和癌细胞浸润或块。测量肿瘤浸润,我们标记,统计只有癌细胞或团相互脱离,被基质完全包围。任何肿瘤组件接触的外表面(即图像堆栈。,both top and bottom image planes and lateral circularly-cut margins) were deleted from the pool of the putative infiltrating cancer cells or clumps. We also conducted a computational test with voxel-based dilation/shrinkage functions of the labeled components to validate the continuity of tumor architecture or detachment of cancer cells from neighboring cancer foci in the 3D space.
2.7。计算机硬件
计算机系统用于运行的三维重建和可视化由电脑英特尔至强3.0 GHz处理器、32 GB内存,Windows XP专业的64位版本,图形显卡NVIDIA方形住宅区外汇5600 1.5 GB内存,一个24寸双监控系统,和500 GB的内部磁盘驱动器。这台电脑是配备所有必要的软件如上所述。
3所示。结果
3.1。肿瘤的三维可视化Parenchymal-Stromal边境入侵面前
图
3 显示了一个示例的隔离CK-positive肿瘤实质(图
3 (一))和邻基质空间(图
3 (b))。在这个OTSCC案例(案例C表
2 ),肿瘤分割显得笨重低倍镜下,但一个放大的三维可视化显示,parenchymal-stromal边境有一个粗糙的表面纹理,小肿瘤绳链相互连接和狭窄的基质渗透率(图
3 (c))。当分段parenchymal-stromal边界划定在虚拟空间的平面立体像素宽,错综复杂的结构扩展到大规模intratumor空间可以充分重视(图
3 (d))。如表所示
2 基于3 d形态测量学,这个庞大的肿瘤体系结构及其复杂的tumor-host边界数值对应实质体积为2.95毫米3 ,61.4毫米的边境地区2 ,97.5毫米的表面积/体积−1 。
表2
结果3 d形态测量学14 OTSCC病例。
OTSCC
入侵模式(1)
组织体积(2)
边境地区(
年代
)2
年代
/
V
p
(
3
)
−1
Ki67 (+) nucleiin癌细胞(4)
Discohesivecancer焦点(5)
总
毫米
3
薄壁组织(
V
p
)
毫米
3
(%)
数量
×104 /毫米3
数量
%的体积
一个
DS
2.88
0.19 (6.6)
17.2
90.5
20805年
[10.9]
65年
(2.83)
B
PB
2.86
0.96 (33.6)
48.3
50.3
221803年
[23.1]
2
(0.0010)
C
PB
2.95
0.56 (21.4)
61.4
97.5
61896年
[9.8]
30.
(0.060)
D
PB
2.91
0.37 (12.7)
30.9
83.5
47913年
[12.9]
53
(0.0089)
E
TSC
2.74
0.47 (17.2)
18.3
38.9
23702年
[5.0]
19
(0.44)
F
PB
2.58
0.43 (16.7)
31.3
72.8
108234年
[25.1]
116年
(0.26)
G
TSC
2.94
0.20 (6.8)
27.2
136.0
29009年
[14.5]
76年
(0.59)
H
PB
2.19
0.92 (42.0)
81.8
88.9
88303年
[9.6]
19
(0.024)
我
TSC
2.91
0.49 (16.8)
24.4
49.8
80410年
[16.4]
7
(0.088)
J
TSC
2.59
0.11 (4.2)
11.2
101.8
18435年
[16.8]
36
(0.33)
K
科幻小说
2.39
0.031 (1.3)
3所示。8
122.6
4193年
[13.5]
117年
(27.1)
l
DS
2.73
0.11 (4.0)
18.4
167.3
35156年
[32.0]
232年
(3.76)
米
DS
2.74
0.19 (6.9)
28.8
151.6
45217年
[23.8]
159年
(8.34)
N
科幻小说
2.91
0.032 (1.1)
27.2
850.0
9751年
[30.5]
35
(1.69)
(
1
)
使用的缩写是PB、推搡和笨重的架构;TSC,小梁结构链和绳索;DS,扩散蔓延;和科幻,特殊形式。
(2) 对应的体积数据重建组织体积和分段肿瘤实质总额(
V
p
)。体积比的数字在括号中表示
V
p
总组织。
(3)
年代
/
V
p
表明肿瘤parenchyma-stroma边境地区之间的比率(
年代
)和肿瘤实质体积(
V
p
)。
(4) 在括号中表示数量每个肿瘤实质的Ki67-positive核数卷(
V
p
)。
(5) 在括号中表示数量的体积比discohesive癌症病灶肿瘤实质卷(
V
p
)。
图3
(a, b)的3 d视图分割肿瘤实质(紫色)和基质(黄色)地区,分别。(c)扩大CK-positive肿瘤架构的矩形(a)所示,显示详细的互联肿瘤质地和渠道或孔对应渗透基质链。(d)复杂的肿瘤parenchymal-stromal边境的架构,这实际上是显示在一个平面立体像素宽。注意,这个3 d图像构造使用30串行部分改善曲折的可见性架构。酒吧= 0.5毫米。
![]()
3.2。肿瘤的三维架构的入侵
图
4 比较微观(2 d)和图像重建(3 d)肿瘤的架构和入侵模式OTSCC 4例;剩下的数据从其他OTSCC例提出了补充材料板块S2和S3。利用CK鸡尾酒标签癌细胞,2 d视图显示模式的异构性癌细胞入侵OTSCC例之间和在个案。浸润肿瘤细胞中观察到的在二维图像,三维分割协议使离散癌细胞的可视化和团相互脱离,完全包裹在基质。这里我们使用术语“discohesive癌症病灶”指定的癌细胞浸润在3 d空间分割。我们也解决了局部区域的差异有丝分裂活动的实质Ki67-positive原子核的密度和基质部分。根据肿瘤的3 d功能架构,我们看见四种类型:(1)推动和笨重的架构与短像手指一样的预测;(2)小梁结构链和绳索;(3)扩散蔓延;(4)特殊形式。
(1)
推动和笨重的架构与短卫星传回的预测 :这种类型的鳞状细胞癌病例是由一个或几个实体瘤与划定推动大众渗透前沿。CK-immunostaining披露罚款的肿瘤网络链和绳索以及巨大的肿瘤生长的2 d图像。然而,当以3 d模式观看,我们发现大部分的肿瘤链和绳索拓扑连接,形成一个巨大的肿瘤体积与狭窄的基质渗透率,如图
3 。这个3 d分割也验证了存在和本地化tumor-host边境discohesive癌症病灶的分布。两个常见的趋势是著名的有丝分裂活动的实质和间质:(a)肿瘤边缘接触基质渗透的地区通常有丝分裂活动显示高于肿瘤的紧凑的核心质量和密度(b) Ki67核染色在狭窄的基质利润率毗邻推动肿瘤质量,其中大部分是由于浸润白细胞和内皮细胞增殖(数据不包括)。
(2)
小梁结构链和绳索 :在二维显微图像从这种类型的SCC的情况下,获得癌细胞浸润扩散地在各种形式的扩展曲折的绳线,这在一定程度上催生了一个相互联系的肺泡。3 d重建验证大多数绳索和链的连续性,产生一个蜂窝结构,通过广泛的基质渗透体积。Discohesive癌症病灶也沿着小梁肿瘤局部质量,通常没有遥远的迁移进入宿主基质环境的证据。Ki67-positive核随机分布和均匀肿瘤骨小梁反映癌细胞之间的亲密空间合同及其附近环境基质。
(3)
扩散蔓延 :2 d图像,这种类型的肿瘤入侵的特点是散射的小癌症病灶或细胞在舌头的肌肉结构,发现证实通过三维分析,证实存在许多discohesive癌症病灶组成的单个或几个癌细胞,如下所示。值得注意的是,在这些浸润肿瘤细胞有丝分裂活动并不突出,但延长广泛进入宿主环境而不是局部肿瘤的边缘。
(4)
特殊的形式 :2 d图像,这种类型的肿瘤入侵了本地化的渗透只有一小部分癌细胞或团到深处舌头肌肉组织。三维分割证实这点状的外观与细长的剖视图,曲折的链,绳扩展到肌间的空间没有舌头的肌肉结构的大规模破坏。依照他们的破坏性的能力有限,通过肿瘤Ki67-positive核的分布体系结构稀疏和异构的曲折链和绳索。
图4
四种类型的肿瘤架构和有丝分裂活动OTSCC入侵。图像从左到右:应用显微图像(2 d);的3 d视图分割肿瘤实质;3 d视图的癌症病灶浸润(黄色)分离的所有维度大部分肿瘤实质(灰色);和Ki67-positive细胞核肿瘤实质(红色)和基质(蓝色)。额外获得3 d数据从剩下的10 OTSCC病例可以找到在辅料盘子S2和S3。酒吧= 1毫米。
![]()
3.3。肿瘤的形态学特性的三维架构的入侵
表
2 给了3 d的形态学分析的结果14 OTSCC病例的研究。列出这些OTSCC情况下,标记一个n,以渗透的深度测量。由最初将这些情况划分为三个类(浅,< 3毫米渗透;中间,3 - 5毫米;和深度,> 5毫米),我们发现4的5 OTSCC例“推动和笨重的架构”属于浅类(另一个是在中间类),而四分之三的案件“小梁架构”的中间阶级(另一个是浅类)。所有的“扩散传播”和“特殊形式”情况下属于深类,除了一个案例中,扩散蔓延但只有肤浅的渗透。
定量分析显示OTSCC情况下的一些独有特性取决于他们的3 d结构。重建组织体积范围从2.19到2.95毫米3 ,这取决于使用的串行部分数量。分段肿瘤实质差异很大的数量从1到组织总量的42%;正如预期的那样,音量值高出一般的“推动和笨重的架构”组和“特殊形式”组最低。按照复杂tumor-host边界如图
3 ,边境地区的价值观也发生了很大变化,从3.8到81.8毫米2 。通过正常化边境地区(
年代
)对肿瘤实质体积
(
V
p
)
,值得注意的是,5例OTSCC“推动和笨重的架构”组中取得了相对统一的值(平均水平
年代
/
V
p
=
78.6
±
18.2
毫米−1 ),远远低于平均水平
年代
/
V
p
值4例“小梁架构”(
81.6
±
45
。
5
毫米−1 ),3例“扩散传播”(
136.4
±
40.6
毫米−1 )。三维重建的空间分辨率是足以确定103 -10年5 每个样本的Ki67-positive原子核在肿瘤实质。正常化Ki67-positive核的数量对肿瘤实质体积,我们发现,留学生的差异之间的平均有丝分裂活动OTSCC情况下,依赖于架构虽然没有一致的趋势。表
2 还显示discohesive癌症病灶的数目。这些变化从2到232的数量,在规范化为肿瘤实质体积的百分比,是确定的贡献分离肿瘤癌细胞的总质量只有边际“推动和笨重的架构”组,但显著增加“扩散传播”和“特殊形式”组。
3.4。大小分布Discohesive癌症病灶分割前沿
表
3 显示966 discohesive癌症病灶的大小分布分析分段14 OTSCC入侵前的情况。在这个分析中,每个分段癌症的体积质量决定重建的三维空间中,为了简单起见,大小分布表示的一个球体的直径相同的体积。值得注意的是,大多数discohesive癌症病灶是规模较小,最大的人口(39%)有一个直径16岁到20岁之间不等
μ m。获得进一步了解细胞这些宪法discohesive癌症病灶,我们开发了一种计算算法使用Ratoc TRI-SRF2软件区分Ki67-positive和Ki67-negative原子核在单独的癌症病灶。Ki67-negative核被指定为开放空间限制CK-positive细胞质(见图
2 (d) );噪声图像被删除相同的方式申请Ki67-positive细胞核分割。到目前为止,我们已经完成了3 d分析和可视化50 discohesive癌症病灶随机选择来自不同大小范围和OTSCC病例。图
5 3 d图像显示代表Ki67-positive(红色)和Ki67-negative discohesive癌症病灶(绿色)核。最小的是一个CK-positive Ki67-negative核细胞,而最大的分析到目前为止总共包括1292原子核,组成277 Ki67-positive和1015 Ki67-negative细胞核。重要的是要注意,大多数(68%)的discohesive癌症病灶直径< 25
μ m只包含几个癌细胞。除了强调核的数量的不同,三维可视化的个人discohesive癌症病灶披露他们的异构形态特性,例如,球状,变形,分支预测或延伸与扩展到周围的环境。
表3
大小分布discohesive癌症病灶分割的入侵。
OTSCC情况下(1)
一个
B
C
D
E
F
G
H
我
J
K
l
米
N
总
深度入侵(毫米)
1。9
2。4
2。5
2。6
2。8
2。9
3所示。3
3所示。5
3所示。6
4.6
7.0
7.6
10.6
ND
入侵模式
DS
PB
PB
PB
TSC
PB
TSC
PB
TSC
TSC
SP
DS
DS
SP
神秘的转移
−
+
+
−
−
+
−
+
−
+
+
+
+
−
大小(
μ
米)(2)
数量的discohesive癌症病灶
16日>
4
0
0
12
1
13
4
2
0
2
1
17
18
1
75年
16 - 20
32
1
0
29日
12
73年
33
5
0
13
15
80年
63年
23
379年
21 - 25日
18
1
13
8
3
21
14
7
0
10
21
54
32
5
207年
26 - 30日
5
0
12
2
1
4
10
3
1
7
23
33
19
2
122年
31-35
3
0
4
1
0
1
5
1
2
2
12
22
8
1
62年
36-40
0
0
1
0
1
2
2
0
0
1
11
9
3
0
30.
41-45
1
0
0
0
0
1
1
1
1
0
10
6
7
1
29日
46-50
1
0
0
1
1
1
7
0
3
1
21
11
8
2
57
51 - 200
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
3
0
1
0
5
200年<
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
总
65年
2
30.
53
19
116年
76年
19
7
36
117年
232年
159年
35
966年
(
1
)
在14 OTSCC病例的临床病理学特征,重新在这里(见最相关的术语表
1 和
2 的详细信息)。
(2) 分段discohesive癌症病灶的大小是用一个球体的直径相同的体积。
图5
个体癌症病灶的三维视图分段的入侵。癌症的大小相应的质量是用直径来表示一个球体拥有相同的体积。括号中表示数量的细胞核分割肿瘤体积。红色:Ki67-positive核;格林:Ki67-negative核(见核分割文本)。
![]()
4所示。讨论
OTSCC的入侵模式通常是评估在二维显微图像。然而,肿瘤侵犯的实际三维配置不能外推2 d的基础上单独考试。举例来说,一个交织的网络组织中的肿瘤线或绳子卷可能出现在2 d部分点状的癌细胞或岛屿。在目前的研究中,这种类型的误导性的外表是最明显的OTSCC案件归类为“特殊形式”。使用双疣状三维重建与CK和Ki67抗体分离肿瘤实质是有用的从周围的基质和评估局部区域异质性肿瘤细胞的有丝分裂活动。的直接可视化和定量评估tumor-host边界,不能外推从2 d组织学检查部分,提供了一个新的维度对我们理解OTSCC架构。
在文献中,肿瘤浸润和转移的模式或机制已经被分为两类:癌细胞可以传播为单个细胞(称为“个人细胞迁移”)或固体细胞链的形式,表,或集群(称为“集体迁移”)
27 ]。从实用的角度来看,病理学家使用“肿瘤萌芽”作为多种人类癌症的预后因素(
28 - - - - - -
34 ]。肿瘤崭露头角的通常定义为小细胞群组成的不到5细胞的侵入性肿瘤边缘(
28 ,
31日 ]。根据Bryne口腔癌的恶性肿瘤分级系统,侵入性肿瘤岛屿被分为两类:> 15细胞和< 15细胞岛(
17 ]。在目前的研究中,我们发现了966 discohesive癌症病灶14 OTSCC入侵前的情况。目前,我们的3 d数据仍然有限对这些病灶的形态和细胞宪法因为分割和个人病灶的形态测量学是耗时和劳动密集型任务。然而,到目前为止的结果支持这一理论,单个细胞和集体迁移过程发生在OTSCC入侵前,多数discohesive癌症病灶包括只有少数癌细胞。
与癌原发肿瘤细胞的分离机理质量,人们普遍认为这些改变其表型与恶性肿瘤的恶化,导致损失的细胞附件和/或一个epithelial-mesenchymal过渡(EMT) [
35 ,
36 ]。关于EMT在OTSCC入侵的可能性方面,应该注意的是,我们的RGB颜色分割取决于癌细胞的免疫反应性的鸡尾酒anti-CK抗体,所以分段癌细胞进行单细胞入侵没有经历一个完整的EMT保留其上皮表型。显然,重要的是描述的表型变化伴随discohesive入侵鳞状细胞癌的发生和发展的细胞,这未来的工作可能调查额外假定immunolabels如钙粘蛋白、波形蛋白和蜗牛。
简介中所述,二预测结果患者早期OTSCC一直强烈的研究。的临界深度渗透与原发肿瘤的淋巴结的转移已经被估计为4毫米左右(
5 ,
9 ,
10 ]。在目前的研究中,我们调查了14例OTSCC展示一系列的渗透深度从1.9到10.6毫米。我们首先研究了渗透的深度是否显著预测神秘颈部转移但拒绝这个假设基础上,两个浅浸润患者(2.4和2.5毫米)隐匿性转移。接下来,我们批判性地评估的频率之间的关系discohesive癌症病灶和渗透的深度。表
3 显示的频率和大小discohesive癌症病灶与渗透的深度增加;这一趋势最突出的deep-infiltrating OTSCC例扩散蔓延和特殊形式。更重要的病理诊断,然而,是超然的发现一个或几个癌细胞发生在浅浸润组无论神秘颈部转移的肿瘤结构和类型与所有类型的肿瘤三维架构和入侵模式,案例B作为例证,划定了边界和只有两个discohesive癌症病灶的三维空间分析。虽然机制的能力shallow-infiltrating OTSCCs通过淋巴管转移尚未完全阐明,甚至是中肯的指出,大规模OTSCC与推动边界具有很大表面积与基质接触的环境,包括血液/淋巴管。Ohno et al。
37 之前报道,OTSCC细胞团联系已有的扩张淋巴管和突破薄壁淋巴管进入腔体。在我们的3 d重建结合immunolabels肿瘤和血管内皮细胞,我们也观察到的原发肿瘤的质量经常OTSCC穿透薄壁淋巴管进入腔体,腔导致肿瘤栓子。综上所述,我们认为通过淋巴管传播肿瘤细胞可能发生在OTSCC发展的早期阶段没有转移性增长的新环境的表现。