IJCB 国际细胞生物学杂志》上 1687 - 8884 1687 - 8876 Hindawi出版公司 10.1155 / 2016/9032181 9032181 研究文章 碳水化合物和半个Cytoenzymatic表征通过姬氏的股白肿虾 方面对虾 http://orcid.org/0000 - 0003 - 4254 - 9627 埃斯特拉达 诺玛 1 委拉斯凯兹 埃德温 2 Rodriguez-Jaramillo 卡门 3 Ascencio 菲利普 2 Desantis 塞尔瓦托 1 而Catedras CONACyT Centro de Investigaciones Biologicas del Noroeste 南卡罗莱纳州(CIBNOR) 23090年拉巴斯 BCS 墨西哥 cibnor.mx 2 Laboratorio de Patogenesis Microbiana Centro de Investigaciones Biologicas del Noroeste 南卡罗莱纳州 23090年拉巴斯 BCS 墨西哥 cibnor.mx 3 Laboratorio de Histologia e Histoquimica Centro de Investigaciones Biologicas del Noroeste 南卡罗莱纳州 23090年拉巴斯 BCS 墨西哥 cibnor.mx 2016年 19 10 2016年 2016年 11 05年 2016年 01 08年 2016年 2016年 版权©2016诺玛埃斯特拉达et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

通过姬氏代表最重要的防御机制对外国材料甲壳纲动物和其他也参与各种生理反应。荧光lectin-binding化验和细胞化学的反应被用来识别特异性和碳水化合物根的分布和存在的水解酶,在通过姬氏股白肿虾 方面对虾。两个一般类的循环通过姬氏(粒状和agranular)存在 l .对虾,表达碳水化合物残留FITC-conjugated凝集素编剧,LEA和机构;东安格利亚大学和一个没有观察到。酶的研究表明,酸性磷酸酶、非特异性酯酶和特定的酯酶在场;碱性磷酸酶没有观察到。酶和碳水化合物都是有用的工具在血细胞分类和细胞防御机制研究。

 CIBNOR 3.0交流 1。介绍

在甲壳纲动物十足类,防御系统依赖于体液和细胞机制,与细胞防御协调循环通过姬氏[ 1]。通过姬氏在甲壳类动物也被认为与快速封闭伤口,防止血淋巴和防止感染的损失( 2, 3]。许多研究的形态、结构、功能和分类通过姬氏的十足类显示三个基本类型,根据颗粒的大小和数量:透明细胞,小颗粒细胞,large-granule细胞( 4]。描述这些类型的penaeid虾( 5, 6)和淡水小龙虾( 7, 8]。通过姬氏可以识别和消除或隔离入侵病原体通过吞噬作用、封装、和溶酶体酶的分泌、抑菌物质 9, 10]。总之,颗粒通过姬氏吞没小外国粒子进行吞噬作用。颗粒含有许多酶,如溶菌酶、酯酶、磷酸酯酶,磷脂酶,氧化物酶、蛋白酶和氧化的酶,有助于消除异物( 11- - - - - - 14]。通过姬氏发挥重要作用在生产和放电凝集素,如凝集素( 15)和抗菌肽( 16]。无脊椎动物通过姬氏作为受体也有一些碳水化合物根入侵的病原体,绑定的凝集素和碳水化合物会导致复杂的结构变化,从而诱导激活通过姬氏[ 17, 18]。

太平洋股白肿虾, 方面对虾(布恩,1931年),是世界上最重要的养殖品种之一。养殖虾类疾病造成的经济损失的增加我们的知识很有必要无脊椎动物的免疫系统。酶细胞化学经常被用于通过姬氏的功能描述( 9]。区分通过姬氏研究特异性凝集素和碳水化合物的分布在分类有用的半个通过姬氏和定义自己的函数 18]。研究通过姬氏 l .对虾在基底状态全面描述通过姬氏的结构和功能,我们使用显微分析,酶活性细胞化学,glycoconjugates细胞凝集素探针。

 2。材料和方法 2.1。提取血淋巴

少年虾(平均长度= 10.3 ± 2。0 厘米)。在实验之前,虾在实验室控制条件下在1500年一个循环系统与1 L玻璃纤维坦克 μm过滤海水pH值在35事业单位和25°C,在恒定的曝气,每天和美联储商业颗粒饲料。血淋巴中提取了27-gauge注射器交界处之间的基础和坐骨第五行走的腿。出血之前,样地与70%乙醇擦拭。注射器包含同等体积的柠檬酸/ EDTA抗凝剂由氯化钠0.45米,0.1米的葡萄糖,30毫米柠檬酸钠,柠檬酸26毫米,10毫米EDTA在pH值5.4和搁置 19]。

 2.2。通过姬氏的类型,和微分总数

总通过姬氏计数测量与电子粒子计数器(Multisizer,贝克曼库尔特,沥青,CA)。细胞生存能力的每个样本估计纽鲍尔室用荧光显微镜,添加propidium碘溶液之后,通常不是膜渗透性和排除在可行的细胞。是常用的标签死细胞和多色荧光的复染色技术。通过姬氏超过90%是可行的。确定通过姬氏的类型,我们计算类型通过姬氏的组织学部分。这个过程,我们汇集了血淋巴混合1:1与Karnovsky固定剂[ 20.]24小时在4°C,洗了几个变化Karnovsky的缓冲区,通过乙醇脱水系列,嵌入在催化丙烯酸单体(JB-4 +嵌入工具包,Polysciences沃灵顿,PA)。组织样本,1 μm和染色和hematoxylin-eosin May-Grunwald染色。永久的幻灯片是在显微镜下检查,数码照片。数字图像被用来分析至少500通过姬氏40 x(10随机的10个领域里的照片/幻灯片)(Image-Pro + v4,媒体控制论,马里兰州贝塞斯达,美国),确定小颗粒细胞(国网公司),large-granule细胞(LGC)和透明细胞(HC),根据恒和雷( 21]。每种类型的细胞的百分比计算,基于细胞的总数。数据进行了方差分析 事后图基测试测试差异血细胞类型和染色方法。数值数据被表示为±SD,使用SPSS 16.0软件(IBM SPSS,阿蒙克,纽约)。结果被认为是重要的 P < 0.05 。

 2.3。Lectin-Binding化验

血细胞低聚糖的分布上的差异进行了研究使用五异硫氰酸荧光素(FITC)标记凝集素。表列出了凝集素 1。100年整除 μ血淋巴池L ( 1 × 10 6 细胞毫升−1)被放置在0.7 μL聚丙烯管一式三份,5 μL甲醛添加到每个管30分钟。凝集素的解决方案准备在100年各自的缓冲区的浓度,50岁,25岁和10毫克凝集素毫升−1。每个管100 μL凝集素的解决方案是添加和孵化在黑暗中在室温下为1.5 h。同样的程序进行凝集素。孵化后标记凝集素,通过姬氏清洗和resuspended在100年 μL在pH值7.2进行分析过滤PBS纽鲍尔室荧光显微镜数字化,使用适当的过滤器(奥林巴斯BX41、东京、日本)40 x。控制,每个糖凝集素是孵化的适当的竞争最终浓度(见表0.2 1在室温下)30分钟。这个解决方案然后离心机在16000×15分钟g和通过姬氏孵化在上层清液在室温下为1.5 h。然后,组织在PBS冲洗含有糖和准备竞争荧光显微镜,如下所述。其他控制幻灯片没有凝集素与PBS孵化。对于每一个治疗,分析了数字图像(至少500通过姬氏,10图片在10个随机小纽鲍尔室广场/样本),计数荧光和nonfluorescent通过姬氏。荧光强度和覆盖面积的确定与图像分析仪(Image-Pro + v4,媒体控制论,马里兰州贝塞斯达)在40 x。积极的百分比(荧光)细胞/示例计算,总血细胞数中定义的引用。多个独立样本进行分析,以确保再现性。数据进行了方差分析 事后图基测试,测试不同凝集素之间的差异。数值数据被表示为±SD,使用SPSS 16.0软件。结果被认为是重要的 P < 0.05 。

凝集素用于调查细胞表面低聚糖域通过姬氏糖用作lectin-binding控制及其竞争力。

植物血凝素 拉丁名字 源 再悬浮的解决方案 特异性糖 抑制 ∗
一个 Canavalia ensiformis (C7642σ) 洋刀豆 用5毫米CaCl氯化钠0.9% pH值6.52 a-D-Mannose, a-D-glucose 葡萄糖
编剧 小麦属植物寻常的 (L4895σ) 小麦胚芽 PBS pH值7.4 (D-GlcNAc) NeuNAc N-Acetylglucosamine
机构 落花生hypogaea (L7381σ) 花生 PBS pH值7.4 β 半乳糖galNAc (1 - 3) 半乳糖胺
UEA-I Ulex europaeus (L9006σ) 金雀花,荆豆 氯化钠0.9% a-L-Fucose 海藻糖
LEA Lycopersicon esculentum (L0401σ) 番茄 ∗ ∗ (glcNAc)3 N-Acetylglucosamine

GalNAc = N-acetyl-galactosamine GlcNAc = N-acetyl-glucosamine NeuNAc = N-acetylneuraminic酸。

∗ 竞争糖用于研究0.2。

∗ ∗ 消息灵通的10毫米,0.15 M氯化钠,0.1毫米2 +叠氮化钠,0.08%,5毫克毫升−1 β环糊精。

 2.4。酶细胞化学

通过姬氏是由细胞粘附的酶组织化学。在150年撤出血淋巴 μL是放在玻璃幻灯片的密度 5 × 10 6 细胞毫升−1并允许遵守1 h消毒湿室条件下25°C。幻灯片被小心翼翼地清洗与PBS pH值7.2和沾染了试剂的溶酶体酶。根据每个酶测试坚持细胞被固定。诊断工具被用来测试四水解酶,进行根据制造商的指示:(1)酸性磷酸酶(萘酚是双磷酸衬底,# 386 - a,σ,圣路易斯,密苏里州),(2)碱性磷酸酶(萘酚是双碱性衬底,# 86 - c,σ),(3)非特异性酯酶( α萘乙酸衬底,# 91 -σ),(4)特定的酯酶(氯乙酸萘酚为d, # 91 - c,σ)。酸性磷酸酶,复制电影接受L (+) -tartrate-containing衬底;细胞含有酒石酸acid-sensitive酸性磷酸酶是活动的缺乏。幻灯片在去离子水冲洗,晾干,并研究了显微镜下,使用油浸物镜。对于每个处理,数字图像被用来分析至少500通过姬氏(10随机的10个领域里的照片/幻灯片),识别正面和负的细胞。所有酶阳性细胞的百分比计算,基于细胞的总数。在缓冲控制幻灯片只孵化;所有解决方案都是立即使用前。在这之后,用光学显微镜观察。多个独立样本进行分析,以确保再现性( n = 9 从三个独立的幻灯片,汇集样品每个技术)。数据进行了方差分析 事后图基测试来测试不同的酶之间的区别。数值数据被表示为±SD,使用SPSS 16.0软件。结果被认为是重要的 P < 0.05 。

 3所示。结果

通过姬氏染色组织学部分,hematoxylin-eosin和May-Grunwald染色染料,显示许多大小不一的细胞质颗粒,以及无颗粒细胞(数字 1(一)和 1 (b))。描述血细胞类型使用形态学标准之前开发的虾( 21)显示了三个基本的细胞类型:小颗粒细胞(国网公司),large-granule细胞(LGC)和透明细胞(HC)。图 1 (c)显示不同的血细胞类型的百分比/样本,计算参照通过姬氏的总数。

通过姬氏 方面对虾。(一)显微图通过姬氏染色hematoxylin-eosin树脂组织学部分和(b)通过姬氏染色与May-Grunwald染色,显示通过姬氏的三种类型:小颗粒细胞(国网公司),large-granule细胞(LGC),透明细胞(HC)。比例尺= 5 μm。(c)微分血球计数(DHC)在组织学树脂部分沾hematoxylin-eosin和May-Grunwald染色。本公司的相对百分比计算通过观察分析至少500通过姬氏数字图像。数据代表平均数±标准差。字母表示显著差异( P < 0.05 血细胞类型之间的)。n =核。

绑定5个凝集素与不同碳水化合物通过姬氏的特异性 l .对虾研究了使用FITC-labeled凝集素(表吗 1)。循环通过姬氏隔绝 l .对虾能够绑定到编剧、机构和LEA(数据吗 2(一个), 2 (b), 2 (c));碳水化合物半个东安格利亚大学和一个没有观察到。表 2显示是否有荧光团细胞或单个细胞,显示了标记分析最佳浓度的外源凝集素。每个样本的阳性细胞百分比是计算,定义参照通过姬氏的总数,以及透明的百分比,小颗粒,large-granule通过姬氏(图 2 (d))。没有统计学差异的表达通过姬氏的碳水化合物。数据 2(一个)和 2 (c)和表 2表明,编剧和LEA和通过姬氏的反应 l .对虾凝集和单个细胞,明确不同大小与编剧的虚线染色,和LEA也点缀结构被观察到,随着统一标签模式在许多细胞似乎标签表面。机构出现在高百分比 l .对虾通过姬氏点缀结构(图 2 (b))。已知的抑制碳水化合物残留被用来抑制标签lectin-treated通过姬氏。控制与抑制糖类证明FITC-lectin是特定的绑定,自从在孵化中适当的haptenic糖(表 1)取消或明显降低荧光。

荧光lectin-binding。

植物血凝素 方面对虾
Lectin-binding 最佳浓度 ∗ ( μ 克毫升−1)
一个 - - - - - - One hundred.
编剧 C,年代 25
机构 年代 50
UEA-I - - - - - - One hundred.
LEA C,年代 25

∗ 最佳浓度绑定化验。C =团。S =单个细胞。

标签的固定模式通过姬氏隔绝 方面对虾孵化后FITC-conjugated凝集素。许多通过姬氏配体不同:麦胚凝集素(WGA), (b)花生凝集素(机构)和(c) Lycopersicon esculentum凝集素(LEA)。通过姬氏被干涉对比显微镜和显微数字化评估。比例尺= 5 μm。(d)通过姬氏总额的百分比和细胞类型的阳性细胞标记FITC-conjugated凝集素。对于每一个治疗,数字图像通过姬氏用于分析至少有500。积极的百分比(即。,fluorescing) cells per sample was calculated, as defined with reference to the total hemocyte number. Data represent mean ± SD.

通过姬氏从 l .对虾分析细胞粘附数水解酶。我们研究的四种酶,只有三个在场:酸性磷酸酶, α萘乙酸(非特异性酯酶)和氯乙酸萘酚为d(特定的酯酶)(数据 3(一个), 3 (b), 3 (c))。这些酶的分布和位置通过姬氏不均匀;然而,观察当积极的强烈反应。酸性磷酸酶显然是本地化为大小不一的片状结构,和非特异性和特异性酯酶活动中还发现点结构,与酸性磷酸酶活性类似发现。图 3 (d)显示与积极的酶活性,虾通过姬氏的透明的百分比,小颗粒,large-granule通过姬氏。很大一部分通过姬氏酸性磷酸酶阳性;许多通过姬氏抗酒石酸。高的比例 l .对虾通过姬氏非特异性酯酶阳性,也通过姬氏的很大一部分特定酯酶阳性。反应网站展示水解酶不太丰富的透明细胞和粒细胞更加丰富。

酶细胞化学坚持通过姬氏隔绝 方面对虾。细胞显微图的第一列对应于控制孵化酶底物和第二列显示了酶的活动。(一)酸性磷酸酶(b)非特异性酯酶(alpha-naphthyl酯酶)和(c)特定的酯酶(d)氯醋酸盐酯酶)。比例尺= 5 μm。(d)粘通过姬氏的百分比 l .对虾与不同酶的底物反应,随着阳性细胞的细胞类型。数据代表平均数±标准差。字母表示显著差异( P < 0.05 )阳性细胞百分比。

 4所示。讨论

有许多的研究形态、结构、功能、和分类通过姬氏的节肢动物十足类显示两个基本类型的血淋巴中通过姬氏:颗粒和透明类型( 5, 9, 21, 22]。软管等。 23)和近藤et al。 24]表明,通过姬氏Penaeidae虾包括透明细胞(HC)、小颗粒细胞(国网公司),和large-granule细胞(LGC)。在我们的结果与hematoxylin-eosin, 45%是HC, 27%是国网公司,28%是LGC,而May-Grunwald染色38%是HC, 24%是国网公司,35%是LGC。这些结果是不同的研究 l .对虾虾和其他物种,最丰富的细胞是国网公司、~ (40 - 60% 5, 21, 25]。小颗粒细胞是唯一血细胞类型参与所有的四种已知的生物功能(吞噬作用、封装、细胞毒性和prophenoloxidase活动),而透明和large-granule细胞只涉及到其中的一些功能( 1]。通常使用其他的分类方案,如细胞的大小和形状。这些方案有不足。通过姬氏分离在这项研究中使用树脂组织学部分是一个适当的方法,因为我们可以数超过500通过姬氏,清楚地识别经典hematoxylin-eosin或May-Grunwald染色染色,一个简单的方法来避免单调乏味的技术由于脆弱的细胞。不同计数记录通过姬氏的相对比例在不同十足类动物物种有许多变化。软管等。 26)发现, Sicyonia ingentis有50 - 60% HC, LGC国网公司的30%和10%。Kakoolaki et al。 27)发现, f . indicus有10 - 15% HC,国网公司LGC 20 - 25%, 60 - 65%。此外,在我们的研究中血细胞总数(THC)大约是6 - 10 × 10 6 细胞毫升−1,类似于其他作品Penaeidae虾( 5, 27, 28]。然而THC的变化也有被研究人员通常报道。道达尔和微分血球计数可以在应对感染差异很大,环境压力,和内分泌活动在蜕皮周期( 29日- - - - - - 31日]。

我们通过姬氏特征 l .对虾与细胞化学的测试。许多的结合细胞化学的测试建议虾通过姬氏的分类 9]。区分通过姬氏利用凝集素识别glycoconjugates和各种水解酶的活动可以用于不同的细胞类型的分类。该方法提供的信息功能和细胞类型之间的关系。通过姬氏甲壳类动物的结合位点的凝集素的成分糖蛋白和糖脂细胞( 18, 32]。我们的研究结果证实,循环通过姬氏表达配体(碳水化合物)lectin-binding非常异构的方式。的百分比lectin-labeled通过姬氏 l .对虾和LEA却相似。WGA凝集素选择性结合N-acetyl-glucosamine (GlcNAc)和N-acetylneuraminic酸(唾液酸)残留的糖蛋白和糖脂。标签模式与WGA的作为点缀出现胞质结构对应于颗粒存在于细胞质中许多通过姬氏十足类这些颗粒通过姬氏[ 18, 32),不同于透明通过姬氏较少或没有颗粒。LEA显示均匀分布在细胞表面;虽然这番茄外源凝集素是特定的寡聚物 β-(1,4)联系N-acetyl-D-glucosamine,绑定网站能够容纳4碳水化合物单位,也LEA结合sialoglycoproteins的膜。比较了几个凝集素之间共享一个相似的特异性,包括编剧,表明他们与糖蛋白反应也有所不同。番茄外源凝集素似乎并没有要求GlcNAc残留是连续的,这一发现却没有提到。

Lectin-labeled通过姬氏在 l .对虾与机构约束碳水化合物序列半乳糖胺- β(1 - 3)-N-acetyl-D-glucosamine和显示一个类似的点模式作为编剧,但机构和WGA的识别不同的碳水化合物的决定因素;因此荧光模式的相似性表明碳水化合物这两种凝集素是公认的半个共享同样的糖蛋白或发生在不同的糖蛋白是密切相关的。这表明,颗粒通过姬氏 l .对虾拥有glycoconjugates的鸡尾酒,而李承认通过姬氏的表面膜受体。凝集素被广泛用于研究的碳水化合物,蛋白质识别模型系统来理解蛋白质的分子基础识别特定的终端糖或糖组糖蛋白和糖脂,因为它们相对容易获得,并且有各种各样的糖特异性。凝集素假设一个特定的意义,因为他们作为模式识别和识别特定蛋白质碳水化合物表面半个病原体细胞引起凝集和促进外国粒子的结合,促进吞噬细胞摄取的( 15, 33, 34]。Lectin-carbohydrate绑定导致结构性变化复杂,诱发的血细胞激活( 17]。

识别和描述通过姬氏的亚种群,我们使用酶细胞化学。特定的酯酶和非特异性酯酶通过姬氏中被检测到 l .对虾,如类似生物体( 9]。 l .对虾通过姬氏没有碱性磷酸酶阳性。缺乏碱性磷酸酶是发表在其他甲壳类动物 9),但被发现在泥蟹, 锯缘青蟹( 35]。因为我们测试通过姬氏的基底状态,可以诱导酶生产的外部代理。然而,通过姬氏 l .对虾有很高比例的酸性磷酸酶阳性细胞。溶酶体的存在是通过姬氏通常与酸性磷酸酶染色证实,血清的甲壳类动物 9]。许多抗酒石酸细胞,这表明有细胞类似人类酸磷酸酶酶(Acp5)存在在许多细胞类型细胞,分泌 在体外巨噬细胞,参与吞噬的细菌( 36, 37]。在 l .对虾细胞的百分比,是积极的酯酶和酸性磷酸酶的几乎是相同的,血细胞总数的60 - 80%的人口。这可能反映了颗粒细胞的数量获得使用其他方法的检测,如WGA-binding通过姬氏的颗粒。颗粒通过姬氏的主导地位在许多甲壳类动物表明他们有能力积极防御反应和可能吞噬细胞含有丰富的水解酶和其他蛋白质( 4, 23, 38, 39]。Hyalinocytes显示有限的吞噬能力和低水平的水解酶,可能有其他功能和吞噬作用不同,如使用的营养或凝固( 27, 40]。

总之,有趣的是,大多数无脊椎动物拥有亚种群的颗粒和透明通过姬氏杰出经典染色和显微镜方法。尽管最近的研究扩大了十足类动物的生理作用,通过姬氏,扩展信息从一个物种转移到另一个是困难的,因为没有统一的分类通过姬氏两组,主要原因在于使用不同的技术和调查的目标是不同的。的免疫功能 l .对虾部分是基于糖代码,匹配多糖多样性与凝集素的存在和各种多糖抗原表位鉴定为外国生物配体破坏。Lectin-binding染色特性和溶酶体酶的存在似乎好标记血细胞形态功能特点提供有价值的信息。了解甲壳纲动物的免疫系统十足类是必要的评估环境的相对贡献,人为的,病态的压力。通过姬氏的形态和功能描述 l .对虾提供一些见解免疫系统的反应,更多的工作是需要识别标记,以促进我们对血细胞特征的理解。

 相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

 确认

作者感谢尤拉莉亚就查韦斯CIBNOR Laboratorio de Histologia e Histoquimica的技术援助。爱尔兰共和军Fogel CIBNOR提供了宝贵的编辑服务。所提供的金融支持CIBNOR(格兰特AC 3.0)。

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