IJCB 国际细胞生物学杂志》上 1687 - 8884 1687 - 8876 Hindawi出版公司 10.1155 / 2015/481493 481493年 研究文章 细胞外囊泡从Caveolin-Enriched Microdomains调节Hyaluronan-Mediated持续血管的完整性 Mirzapoiazova 塔玛拉 1 列侬 弗朗西丝·E。 2 Mambetsariev Bolot 1 艾伦 迈克尔 1 Riehm 雅各 1 Poroyko Valeriy。 3 单例 帕特里克。 1、4 格迪斯 汉斯·赫尔曼 1 医学系的 部分肺和急救护理 普利兹克医学院 芝加哥大学的 芝加哥, 美国 uchicago.edu 2 医学系的 部分血液学/肿瘤学 普利兹克医学院 芝加哥大学的 芝加哥, 美国 uchicago.edu 3 外科学系 普利兹克医学院 芝加哥大学的 芝加哥, 美国 uchicago.edu 4 麻醉和重症监护 普利兹克医学院 芝加哥大学的 芝加哥, 美国 uchicago.edu 2015年 10 9 2015年 2015年 05年 09年 2014年 08年 12 2014年 10 9 2015年 2015年 版权©2015 Tamara Mirzapoiazova et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

缺陷血管完整性是几种疾病过程的启动因素。我们曾报道称,高分子量透明质酸(HMW-HA),主要的粘多糖在体内,促进快速信号转导在人类肺微血管内皮细胞(HPMVEC)增强导致障碍。相比之下,低分子量透明质酸(LMW-HA),产生的疾病通过透明质酸酶和活性氧(ROS),诱发HPMVEC屏障破坏。然而,障碍持续监管的机制(s)哈差定义。我们的结果表明,长期(6日到24日小时)暴露HMW-HA诱导释放一种小说类型的细胞外囊泡从HLMVEC叫enlargeosomes(特点是AHNAK表达式),而LMW-HA长期接触促进释放液(CD9、CD63,研究表达式)。这些影响被抑制caveolin-enriched microdomain (CEM)的形成。进一步,抑制enlargeosome释放膜联蛋白ⅱsiRNA减毒持续障碍HMW-HA增强的影响。最后,暴露的孤立enlargeosomes HPMVEC增强层生成障碍而液导致屏障破坏。总的来说,这些结果表明微分CEM细胞外囊泡的释放调节持续监管HMW-HA和LMW-HA HPMVEC障碍。HMW-HA-induced专业enlargeosomes疾病可能是一个潜在的治疗策略包括受损血管的完整性。

 1。介绍

(即血管完整性。,the maintenance of blood vessel continuity) is required for normal cardiovascular homeostasis [ 1, 2]。几种机制调节基底血管内皮和信息完整性包括内皮glycocalyx和连接由紧密连接,控制,粘合连接处并且和caveolin-enriched microdomains (CEM)的一个子集包含支架蛋白脂质筏caveolin-1 [ 1, 3- - - - - - 7]。某些疾病,包括动脉粥样硬化、败血症、缺血/再灌注,急性肺损伤,糖尿病和癌症转移,诱导glycocalyx退化和破坏EC-EC连接导致泄漏的液体和蛋白质为基础组织( 1, 2, 4, 8, 9]。因此,理解电子商务障碍的机制(s)监管可以有重要的临床效用。

主要nonsulfated粘多糖在大多数组织中,透明质酸(HA),在维护中起着基础性作用血管完整性( 4, 8, 10- - - - - - 17]。我们曾表明,HA及其主要的细胞表面受体,CD44,调节肺血管完整性和HMW-HA可能被利用作为缺陷治疗血管完整性( 5, 18, 19]。具体来说,HMW-HA(~ 100万Da)跨膜受体结合,cd44(标准格式),在杰姆发起一个快速信号转导级联。cd44 transactivates障碍提高S1P1受体在杰姆的丝氨酸/苏氨酸激酶,Akt-mediated Rac1鸟嘌呤核苷酸交换因子激活,Tiam1, Rac1-GTP导致大脑皮层形成肌动蛋白形成和加强EC-EC联系人。此外,HMW-HA招募其他肌动蛋白调控蛋白杰姆包括蛋白质S100-A10 filamin-A, filamin-B增强皮质肌动蛋白形成和血管的完整性。HMW-HA相比,LMW-HA (~ 2500 Da)结合并激活受体,CD44v10 CEM(变种10)。CD44v10然后transactivates屏障破坏S1P3受体。这些事件促进RhoA鸟嘌呤核苷酸交换因子(RhoGEF)激活和RhoA-GTP形成刺激丝氨酸/苏氨酸激酶,ρ激酶(岩石)。这导致压力纤维肌动蛋白形成和EC屏障破坏。然而,长期持续肺EC屏障(s)的监管机制定义得很糟糕。

细胞外囊泡(EVs)在几种类型包括微泡,exosome-like囊泡、液、膜粒子( 20., 26- - - - - - 29日]。每个类型都有特定的蛋白质标记和由萌芽的质膜或释放细胞内多泡核内体( 20.]。电动汽车的大小范围从20到1000海里,释放各种细胞包括欧共体( 20.]。电动汽车被认为是一种信息交流的手段,可以运输蛋白mRNA, microrna的靶细胞( 20., 30.]。Enlargeosomes专业泡富含AHNAK被观察到细胞和膜联蛋白II,融合到质膜和质膜的脱落 21- - - - - - 23]。然而,电动汽车的角色(s) HA-mediated持续血管完整性是未知的。

在目前的研究中,我们调查了HA-mediated长期EC屏障的调控机制。我们已经确定了,哈哈~ 6小时后,人类EC不同释放包含caveolin-1 EVs和由杰姆。利用一些新技术包括原子力显微镜和nanosight纳米粒子跟踪分析(NTA),我们为这些EVs液(用于LMW-HA)和enlargeosomes (HMW-HA)。重要的是,孤立LMW-HA-induced液促进电子商务障碍中断而孤立HMW-HA-induced enlargeosomes诱导增强电子商务障碍。抑制HMW-HA-induced enlargeosome释放减少持续障碍提高HMW-HA的属性。这些电动汽车不同表达哈哈结合蛋白,和微rna可能有助于其微分EC屏障的监管效果。我们的发现证明HA-induced持续血管完整性的一个重要机制通过微分EV从人类EC的释放。进一步,利用孤立HMW-HA-induced专业enlargeosomes和/或其生物活性成分可能是一个潜在的疾病治疗策略包括受损血管的完整性。

 2。材料和方法 2.1。抗体和试剂

抗体用于这项研究包括anti-CD9(圣克鲁斯生物技术有限公司、达拉斯、TX), anti-CD63 (Abcam、剑桥、马),anti-CD81 (GeneTex Inc .,欧文,CA) anti-AHNAK 1(热科学、沃尔瑟姆,MA), anti-HABP2 (Abnova,核桃,CA) anti-CD44 (IM7克隆)(BD生物科学),anti-CD44v10(罗福斯生物制品)和anti-actin(σ)。透明质酸(钠盐 链球菌zooepidemicus),有限合伙人、ATP和ionomycin买来σ。了sds - page电泳试剂购自Bio-Rad (CA)里士满和Immobilon-P转移膜购买微孔(微孔Corp .)、贝德福德,MA)。

 2.2。人肺微血管内皮细胞(HPMVEC)文化

主要从Lonza购买和维护人类肺微血管细胞EBM-2增长媒体补充EGM-2-MV Bulletkit和10%胎牛血清。细胞被维持在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司2-95%的空气和用于实验在章节3 - 6。

 2.3。制备LMW-HA

LMW-HA准备类似我们之前的描述( 9, 31日]。短暂的500毫克的透明质酸钠盐 链球菌zooepidemicus消化了20000单位牛睾丸透明质酸酶(类型VI-S、冻干粉3000 - 15000单位/毫克(σ,H3631)消化缓冲区(0.1醋酸钠,pH值5.4,0.15 M氯化钠)24 h),并与10%三氯乙酸反应停止。最终的解决方案是离心机的Ultrafree-MC微孔5 kDa MW截止滤光片,主要材料对蒸馏水透析24小时500年在4°C Da截止Spectra-Por油管(Pierce-Warriner,切斯特,英国)。LMW-HA量化使用ELISA-like竞争结合试验与一个已知的固定HA和生物素化的HA绑定肽(HABP)作为指标(雁行Inc .)。通过0.22过滤LMW-HA解决方案 μm过滤器和保存在无菌管。在某些情况下,低和高MW HA都沸腾,蛋白酶K (50 μg / mL)消化、透明质酸酶SD消化( 链球菌dysgalactiae科德角Inc .的北极星Bioproducts Associates,东法尔茅斯,马(100741 - 1),利用100亩/毫升),或添加煮(灭活)透明质酸酶SD检测可能的蛋白质/脂质污染物。HA检测内毒素污染,脂多糖(LPS)生物测定酶联免疫试剂盒(USBiological生命科学)是利用。LMW-HA HA标准(σ和恩佐生命科学)上运行4 - 20%硼酸三羟甲基氨基甲烷/液/ EDTA(此种)凝胶和染色染料(σ)或阿尔新蓝确认LMW-HA纯洁和大小。

 2.4。抑制蛋白表达在人类EC利用核

人肺微血管EC与核转染对人类第二膜联蛋白mRNA(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA)使用siPORT胺作为转染试剂(Ambion, TX)根据协议由Ambion提供。汇合的细胞(~ 40%)serum-starved 1小时后跟孵化250海里的小干扰rna小干扰rna或没有核(或争夺目标6小时血清媒体。血清媒体被添加(血清最终浓度10%)42 h在生化实验和/或功能进行了分析。有效压制靶蛋白表达的决心与免疫印迹分析siRNA-transfected EC溶解产物使用特定抗体。

 2.5。细胞外囊泡(EV)隔离

EVs隔绝媒体对待EC游离了0,1,2,3,6、12、24小时。条件媒体离心机在300 g×15分钟,2000 g×30分钟,12000×g整整45分钟去除细胞和碎片。结果上层清液是通过0.22毫米过滤消毒Steritop(美国微孔,Billerica的)然后离心机在75分钟100000×g(热费希尔科学Ins。美国阿什维尔,数控,Sorvall SureSpin 630/36,固定角转子)。颗粒在PBS resuspended, pH = 7.4,洗,recentrifuged (100000×g、75分钟)。颗粒resuspended在PBS和显示在不连续OptiPrep梯度(10 40岁,20日,OptiPrep溶液和5%蔗糖0.25米,10毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.5)和离心机在100000 g×16 h。EVs漂浮在密度1.10 - -1.12 g / mL OptiPrep。收集分数的梯度,与10毫米三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释,离心机在100000 g×3小时;随后小球在PBS resuspended, pH = 7.4,并受EV表征( 32, 33]。

 2.6。免疫印迹

细胞外囊泡从治疗或治疗HPMVEC孵化了IP缓冲区(50毫米玫瑰(pH值7.5),150毫米氯化钠,MgCl 20毫米2,1%诺乃清洁剂p 40 (NP-40), 0.4毫米Na3签证官4,氟化钠40毫米,50 μ冈田酸,0.2毫米phenylmethylsulfonyl氟化物,1:250稀释样本Calbiochem蛋白酶抑制剂混合物3)。然后运行在sds - page 4 - 15%聚丙烯酰胺凝胶,转移到止动剂膜,与特定的初级和二级抗体和发达。免疫反应性的乐队的可视化是通过使用增强化学发光(Amersham生物科学)。在某些情况下,计算机辅助测密度术是利用量化免疫反应性的。

 2.7。隔离Exosomal RNA, RNA分析

Exosomal小球从RNA被溶解在裂解缓冲隔离工具包mirVana (Ambion /生活技术,卡尔斯巴德,CA)和加工小RNA隔离使用基于列的方法根据生产的指令。exosomal提取小分子RNA的检测和分析,我们使用了一个安捷伦2100生物分析仪小RNA芯片工具包(安捷伦科技)。

 2.8。Transendothelial电阻(TER)

EC屏障功能,人类肺微血管内皮细胞成长为融合在聚碳酸酯含有蒸发金井微电极(表面积,三厘米2)系列大型黄金反电极(1厘米2)连接到一个相敏锁定放大器如前所述。测量transendothelial电阻(TER)进行了使用电子细胞基质阻抗传感系统通性(应用生物物理学Inc .)。短暂,目前应用在电极由一个4000 hz交流电压源的振幅1 V系列的1 M Ω 阻力近似恒流源(1 μ)。作为细胞粘附和传播微电极,后增加(最大融合),而细胞收缩,舍入或附着力损失反映在下降。这些测量提供一个高度敏感的生物物理分析,表明细胞形状和粘着斑的状态。值从每个微电极是集中在离散时间点和策划与时间均值±SE的意思 34- - - - - - 37]。

 2.9。原子力显微镜(AFM)

AFM是利用类似于我们之前的描述( 34]。简而言之,AFM提供了一种新颖的方法来分析电动汽车的形态和大小( 38]。隔离EVs在PBS稀释,pH = 7.4,镀和云母。AFM(轻敲模式)是利用在迪多模AFM(数字仪器,圣芭芭拉分校,CA)使用v型oxide-sharpened氮化硅悬臂的光学扫描速度~ 1.0 Hz获得表面拓扑地图。

 2.10。Nanosight纳米粒子跟踪分析(NTA)

EVs如上所述受到NTA分析如前所述[ 39]。NTA利用光散射和布朗运动的性质,以预测稀释样品的粒度分布在液体悬浮。波长635纳米的激光光束经过prism-edged玻璃持平在超薄样品室。激光的入射角和玻璃的折射率是为了照亮的样品室,样品中粒子和光线折射的解决方案。样品的散射光束光电动车在PBS稀释,pH = 7.4,是可视化使用20 x放大显微镜物镜安装传统的光学显微镜。高灵敏度互补金属氧化物半导体相机记录每秒30帧视频的散射光。60年代的一式三份视频文件被记录为每个样本,推进样品溶液到新的100年 μm×80 μm×10 μ为每个记录m的视野。Nanosight软件(v3.0)被用来识别和跟踪单个粒子在一帧一帧的基础上。每个跟踪粒子的二维位移均方记录,加上温度,粘度悬挂的媒体,和Stokes-Einstein方程,用于估计等效水力半径范围。软件跟踪多个电动汽车,参数设定的用户,提供一个样品的粒度分布和浓度。

 2.11。统计分析

结果表示为三个独立实验的平均值±标准偏差。进行数据分析,实验样本相比,控制未配对的学生的 t 以及。多集团比较,单向方差分析(方差分析)和事后多重比较测试使用。组之间的差异被认为是显著时 P 值小于0.05。所有统计分析使用GraphPad棱镜程序(GraphPad软件有限公司、美国)。

 3所示。结果

为了识别潜在的机制(s)的透明质酸(HA)介导的持续人类内皮细胞(EC)屏障功能,我们首先确定了动力学HA-induced细胞外囊泡(EV)释放。人肺微血管EC (HPMVEC)发展到融合和无血清培养系统放置在媒体,也没有哈(控制),100 nm HMW-HA,或添加了100海里LMW-HA 0, 1, 2, 3, 6、12、24小时。对待媒体被收集和分析使用nanosight纳米粒子跟踪分析(NTA)来确定EV浓度(见部分 2)。的结果图 1(一)表明HPMVEC分泌基础水平的电动汽车。然而,有一个显著增加电动汽车释放HPMVEC LMW-HA或HMW-HA之外开始~ 6小时。

测定细胞外囊泡(EV)释放动力学和caveolin-enriched microdomain (CEM)在人类内皮细胞(EC)的依赖。面板(a):图形化表示的动力学HA-induced EV释放人类肺微血管内皮细胞(HPMVEC)。人类EC层无血清培养系统被安置在媒体和由此产生的媒体收集包含电动汽车(0,1,2,3,6、12、24小时。电动汽车的浓度测定利用nanosight纳米粒子跟踪分析(NTA)。HPMVEC展览基底的分泌EV(控制)。然而,添加100海里HMW-HA或100海里LMW-HA大幅度增加电动汽车的生产开始~ 6小时后处理。 N = 3 每组和误差=标准差。面板(b):图形表示的作用从人类EC CEM HA-mediated电动车生产。HPMVEC单层膜都是未经处理或处理甲基- 5毫米 β环糊精(M βCD,杰姆扰乱剂)或不添加100 nM LMW-HA或100海里HMW-HA(24小时)。分析了电动汽车面板(a)。抑制所述杰姆形成显著抑制LMW-HA和HMW-HA-mediated EV分泌 n = 3 每组和误差=标准差。

caveolin-1以来涉及电动汽车释放( 40]和我们以前证明caveolin-enriched microdomains (CEM)是电子商务的关键屏障功能( 5- - - - - - 7, 41, 42),我们下一个检查是否杰姆调节HA-induced EV HPMVEC分泌。图 1 (b)表明抑制杰姆形成methyl-beta-cyclodextrin (M βCD)抑制LMW-HA和HMW-HA-induced EV HLMVEC(24小时治疗)表明这个专门的质膜的重要作用microdomain HA-induced EV分泌。

我们下一个HA-induced电动车使用生物标志物特征分析和原子力显微镜(AFM)。的结果图 2(一个)表明LMW-HA诱发电动车与生物标记符合液(CD9、CD63、和研究)。相比之下,HMW-HA诱发EV和生物标志物与小说泡称为enlargeosome一致。Enlargeosomes专业泡富含AHNAK被观察到细胞和膜联蛋白II,融合到质膜和质膜的脱落 21- - - - - - 23]。对这些结果,我们进一步分析了HA-induced EV AFM。图 2 (b)显示控制电动和液是圆形的,有一个相对光滑的表面。相比之下,enlargeosomes相对圆形的但有粗糙粗糙表面拓扑结构。控制电动和液~ 50 nm直径符合公认的外来体尺寸范围30 - 100海里的 20.]。液HMW-HA-induced enlargeosomes相比显得略大。

识别LMW-HA人类EC和HMW-HA-induced EV。面板(a):生物标志物分析HA-induced EV。HPMVEC种植融合和无血清培养系统切换到媒体和没有公顷(控制),100海里HMW-HA或100海里LMW-HA 24小时。电动汽车被孤立的、运行在sds - page和免疫印迹和anti-CD9 (a), anti-CD63 (b), anti-CD81 (c), anti-AHNAK (d), antiannexin II (e),或anti-caveolin-1 (f)抗体。LMW-HA-induced EV外来体标记而HMW-HA-induced EV表达enlargeosome标记。电动车也表达了caveolin-1,一个至关重要的组成部分caveolin-enriched microdomains (CEM)。面板(b): HA-induced EV的地形图像使用原子力显微镜(AFM)。孤立HA-induced EVs面板(a)所述镀在云母和受到AFM分析(见部分 2)。囊泡是从来不干,显示为缓冲下成像。控制电动和液是圆形的,有一个相对光滑的表面。相比之下,enlargeosomes相对圆形的,但一个粗略的粗糙表面拓扑结构。控制电动和液~ 50 nm直径符合公认的外来体尺寸范围30 - 100海里的 20.]。HMW-HA-induced enlargeosomes出现液相比略大。

进一步调查HMW-HA-induced enlargeosome HLMVEC动力学,汇合的单层膜HMW-HA治疗,疗程6个小时。ATP和ionomycin被用作控制由于他们之前报道能力刺激enlargeosome胞外分泌[ 21- - - - - - 24]。样本然后固定,进行采用免疫分析使用AHNAK抗体(绿色)。等离子体膜贴上Alexa萤石594麦芽凝集素(红色)和核沾染了赫斯特33342年(蓝色)。的结果图 3表明控制HPMVEC展览分散细胞质AHNAK染色。当与HMW-HA刺激时,细胞内AHNAK重新分配“水泡”模式,类似于与ATP和ionomycin治疗。

在人类EC分析HMW-HA-induced AHNAK再分配。HPMVEC渐渐融合在玻璃盖玻片和处理100海里HMW-HA 6小时。50 μM ATP(6小时)和3 μM ionomycin(10分钟)被用作控制由于他们之前报道能力刺激enlargeosome胞外分泌[ 21- - - - - - 24]。样品被固定在4%多聚甲醛和接受采用免疫分析使用AHNAK抗体(绿色)。等离子体膜贴上Alexa萤石594麦芽凝集素(红色)和核沾染了赫斯特33342年(蓝色)。控制HPMVEC表现出扩散细胞质AHNAK染色。当与HMW-HA刺激时,细胞内AHNAK分配给一个类似“水泡”模式与ATP和ionomycin治疗。

考虑到数据的结果 2和 3中,我们进一步研究了这些HA-induced EVs来确定潜在的生物活性因子的存在与否。有趣的是,阿尔新蓝染色此种凝胶显示纯化enlargeosomes含有HA ~ 100万Da(见箭头)符合HMW-HA之前我们已经证明是障碍提高( 4, 5, 7, 8]。相比之下,控制、LMW-HA或LPS-induced EV含有HA(图可以忽略不计 4(一))。考虑到HA受体表达CD44,曾被报道在液 43, 44),我们下一个分析HA结合蛋白表达纯化HA-induced EV。图 4 (b)表明HMW-HA-induced enlargeosomes EC表达障碍提高CD44同种型,CD44(标准格式) 4, 7]。相比之下,LMW-HA-induced液表达EC屏障破坏哈结合蛋白,CD44异构体CD44v10和细胞外的丝氨酸蛋白酶,HABP2 [ 7, 25]。基底分泌EVs(控制)低表达的分子。此外,电动汽车被认为作为运营商的rna ( 27, 28]。图 4 (c)表明,控制电动汽车相比,LMW-HA-induced EVs少总RNA和microRNA在HMW-HA-induced enlargeosomes ~ 2倍水平的总RNA和microRNA。

在HA-induced EV表征潜在的生物活性成分。面板(a): HPMVEC成长为融合和无血清培养系统切换到媒体和没有公顷(控制),100 nM HMW-HA, 100 nM LMW-HA 500 ng / mL有限合伙人为24小时。电动汽车被孤立的,运行在4 - 20%此种凝胶,并与阿尔新蓝染色。纯化enlargeosomes包含哈~ 100万Da(见箭头)符合HMW-HA之前我们已经证明是障碍提高( 4, 5, 7, 8]。相比之下,控制、LMW-HA或LPS-induced EV包含可以忽略哈。人血浆被用作控制。面板(b): HPMVEC成长为融合和无血清培养系统切换到媒体和没有公顷(控制),100海里HMW-HA或100海里LMW-HA 24小时。电动汽车被孤立的、运行在sds - page和免疫印迹和anti-CD44 (IM-7) (a), anti-CD44v10 (b), anti-HABP2 (c), anti-CD63 (d),或anti-AHNAK (e)抗体。HMW-HA-induced enlargeosomes EC障碍提高CD44表达同种型,CD44(标准格式) 4, 7]。相比之下,LMW-HA-induced液表达了EC屏障破坏哈结合蛋白,CD44异构体CD44v10和细胞外的丝氨酸蛋白酶,HABP2 [ 7, 25]。基底分泌EV(控制)低表达的分子。面板(c):孤立EVs面板(b)中描述受到RNA分离和分析(见部分 2)。LMW-HA-induced控制电动汽车相比,电动汽车减少了总RNA和microRNA在HMW-HA-induced enlargeosomes ~ 2倍水平的总RNA, microRNA。

因为我们观察到生物活性制剂的EV图微分表达式 4可以影响血管的完整性,我们下一个确定的角色(s)孤立HA-induced电动汽车在人类EC屏障功能。HPMVEC镀在transendothelial电阻(TER)电极,融合发展,转向无血清媒体和孤立LMW-HA-induced液囊或孤立HMW-HA-induced enlargeosomes随后补充道。图 5(一个)表明添加隔离LMW-HA-induced人类EC单层膜液剂量依赖性地促进屏障的破坏。相比之下,图 5 (b)表明添加隔离HMW-HA-induced enlargeosomes人类EC层增强剂量依赖性的方式产生障碍。

孤立的LMW-HA和HMW-HA-induced电动汽车对人类的影响电子商务功能的障碍。面板(a): HPMVEC镀在transendothelial电阻(TER)电极,渐渐融合,无血清培养系统和转向媒体和0,0.1,1或10 μg / mL孤立LMW-HA-induced液随后补充道。人类EC的孤立LMW-HA-induced液层剂量依赖性地促进屏障的破坏。面板(b): HPMVEC镀在transendothelial电阻(TER)电极,渐渐融合,无血清培养系统和转向媒体和0,0.1,1或10 μg / mL孤立HMW-HA-induced enlargeosomes随后补充道。单层的孤立HMW-HA-induced enlargeosomes人类EC诱发屏障增强剂量依赖性的方式。

确定HMW-HA-induced enlargeosomes影响持续人类EC屏障功能,我们沉默膜联蛋白2的表达也曾被报道为enlargeosome至关重要的胞外分泌[ 23]。图 6(一)表明我们能成功地抑制膜联蛋白2表达人类EC与核。沉默的膜联蛋白ⅱ显著减少HMW-HA,但不是LMW-HA,介导EV分泌物人类EC(图 6 (b))。重要的是,沉默的膜联蛋白II并不影响持续人类EC LMW-HA屏障破坏的影响(图 6 (c)),但几乎完全抑制持续HMW-HA障碍提高效果(图 6 (d))。

抑制enlargeosome释放变弱HMW-HA-mediated持续增强人类EC障碍。面板(a):膜联蛋白2表达的抑制在HPMVEC使用核。人类EC镀在~ 50%融合和处理小干扰rna(控制),要么没有siControl或siAnnexin II有或没有100海里LMW-HA或100海里HMW-HA 48小时。EC溶解产物被获得,运行在sds - page和免疫印迹anti-annexin II (a)或anti-actin (b)抗体。面板(b):图形表示的膜联蛋白ⅱ的作用抑制HA-mediated电动车生产从人类EC。HPMVEC被视为在面板(a)和描述分析了电动汽车利用nanosight纳米粒子跟踪分析(NTA)。膜联蛋白ⅱ的沉默,曾被报道为enlargeosome至关重要的胞外分泌[ 23),可以显著减少HMW-HA -,但不是LMW-HA,介导从人类EC EV分泌 n = 3 每组和误差=标准差。面板(c): HPMVEC以前对待小干扰rna(控制),要么没有siControl,或膜联蛋白II siRNA镀在transendothelial电阻(TER)电极,融合发展,转向无血清媒体和100 nM LMW-HA随后补充道。沉默的膜联蛋白ⅱ并不影响持续人类EC屏障LMW-HA的破坏性影响 n = 3 每组和误差=标准差。面板(d): HPMVEC以前对待小干扰rna(控制),要么没有siControl,或膜联蛋白II siRNA镀在transendothelial电阻(TER)电极,融合发展,转向无血清媒体和100 nM HMW-HA随后补充道。LMW-HA相比,沉默膜联蛋白II几乎完全抑制持续障碍HMW-HA增强的影响 n = 3 每组和误差=标准差。

 4所示。讨论

由于血管完整性缺陷是几种疾病过程的启动因素,理解内皮屏障功能的机制(s)可以有重要的临床意义。我们以前确定糖胺聚糖,透明质酸(HA),启动快速内皮细胞信号转导事件导致屏障功能的变化。在这项研究中,我们调查了潜在的长期机制(s)监管HA-mediated内皮细胞(EC)的障碍。我们已经确定了,哈哈~ 6小时后,人类EC不同释放细胞外囊泡(EVs)包含caveolin-1并受caveolin-enriched microdomains (CEM)。利用一些新技术包括原子力显微镜和nanosight纳米粒子跟踪分析(NTA),我们有这些电动汽车作为一种新型的电动汽车称为特征enlargeosomes(用于HMW-HA)和液(从HMW-HA LMW-HA,疾病状态中产生透明质酸酶和ROS)。重要的是,孤立LMW-HA-induced液促进电子商务障碍中断而孤立HMW-HA-induced enlargeosomes诱导增强电子商务障碍。抑制HMW-HA-induced enlargeosome释放减少持续障碍提高HMW-HA的属性。这些发现证明HA-induced持续血管完整性的一个重要机制通过微分EV从人类EC的释放。

我们以前报道,杰姆是重要的质膜microdomains参与蛋白质快速招聘和信号转导导致内皮屏障监管( 4- - - - - - 8, 41, 45]。当前研究的结果扩大杰姆的作用,包括调节人类EC HA-induced EV释放。具体来说,我们的数据表明,抑制杰姆都变弱LMW-HA-induced外来体释放和HMW-HA-induced enlargeosome释放。此外,这些电动车包含caveolin-1, CEM(一个至关重要的组成部分 46, 47]。有趣的是,尽管基础分泌控制电动汽车还包含caveolin-1,杰姆似乎没有参与他们的分泌物。这些控制电动汽车不包含标记液或enlargeosomes表明它们属于不同的类的电动汽车,可能exosome-like囊泡或凋亡的身体 28]。进一步分析需要确定这些电动汽车的身份。

HMW-HA治疗人类的肺微血管EC (HPAEC)导致招聘的Ca2 +端依赖磷脂和actin-binding蛋白、膜联蛋白ⅱ和支架蛋白,AHNAK,杰姆 5]。这些蛋白生物标志物的enlargeosomes专业发生细胞囊泡,融合到质膜和质膜的脱落 21- - - - - - 23]。它们涉及膜修复符合他们的角色在持续增强HMW-HA-mediated EC障碍。有趣的是表面的差异比enlargeosomes拓扑控制电动和液。控制电动和液是圆形的,有一个相对光滑的皮肤。相比之下,enlargeosomes相对圆形的但有粗糙粗糙表面拓扑可能表明更大的表面蛋白表达。控制电动和液~ 50 nm直径符合公认的外来体尺寸范围30 - 100海里的 20., 28]。HMW-HA-induced enlargeosomes相比增加了尺寸液,但不要达到较大的电动车的范围包括微粒体( 28]。此外,据报道,在星形胶质细胞眺望,有Rac1-dependent重塑enlargeosomes[与相伴胞外分泌细胞骨架的 48]。考虑我们先前公布的数据,HMW-HA诱发Rac1激活在EC ( 7),可能Rac1也可能扮演一个角色在HMW-HA介导enlargeosome胞外分泌增强EC屏障功能。在另一个细胞功能,神经突产物,enlargeosomes,另一个需要不同类型的exocytotic泡增大细胞表面( 49, 50]。因此,我们不能排除监管不同的电动汽车在电子商务的合作障碍。

本研究的另一个重要的结果是,电动汽车不同表达HA和HA结合蛋白可能有助于其微分EC屏障监管效果。控制电动汽车和电动汽车的屏障破坏代理(LMW-HA和有限合伙人)没有大量的哈。相比之下,这部小说HMW-HA-induced enlargeosomes,小成分信息,包含哈~ 100万Da的可能导致持续的paracellular传播HMW-HA内皮屏障提高响应( 5]。我们的数据表明,有微分表达CD44 EV亚型诱导LMW-HA和HMW-HA。可变剪接的CD44成绩单可以产生许多的CD44基因变异,表达一个额外的插入在细胞外膜近端域( 51]。HMW-HA-induced enlargeosomes主要表达障碍提高,cd44(标准形式,没有额外的外显子插入),而LMW-HA-induced液表达CD44v10(变种10)包含一个额外的外显子插入和参与电子商务障碍中断( 4]。微分的精确作用CD44表达同种型电动车功能目前正在调查在我们的实验室。此外,LMW-HA-induced液表达细胞外丝氨酸蛋白酶、透明质酸结合蛋白2 (HABP2)我们以前演示了通过激活促进内皮屏障破坏protease-activated受体——(PAR)受体介导的信号转导 25]。我们正在检查HABP2和HA绑定的另一个类的表达蛋白,透明质酸酶,HA-induced内皮EV函数( 25, 52]。

microrna是小非编码RNA分子(~ 22个核苷酸)这个函数在RNA沉默和转录后的调控基因表达的 53- - - - - - 55]。我们的数据表明,HA-induced EVs含有RNA与小分子核糖核酸的一个重要部分。具体来说,控制电动汽车相比,LMW-HA-induced EVs少总RNA和microRNA在HMW-HA-induced enlargeosomes ~ 2倍水平的总RNA和小分子核糖核酸的比例更高。考虑到pleotropic这些分子的影响,是合理的推测,微分表达的小分子核糖核酸LMW-HA-induced液和HMW-HA-induced enlargeosomes有助于鉴别内皮屏障功能。事实上,据报道,EC处理缺氧,tnf,高葡萄糖和甘露糖生产液改变了蛋白质和RNA含量( 56]。此外,姜黄素治疗EC产生液,促进电子商务障碍函数( 57]虽然cancer-secreted液含有mir - 105抑制EC屏障功能和促进转移( 58]。

总之,我们的研究结果证明HA-induced持续血管完整性的一个重要机制通过CEM-regulated微分EV从人类EC的释放。具体来说,LMW-HA治疗HPMVEC诱发释放内皮屏障破坏液而HMW-HA促进分泌的小说类型的电动汽车,enlargeosomes,促进内皮屏障持续增强。进一步,这些电动车包含微分表达式的哈,哈结合蛋白,microrna监管性质有助于他们的障碍。利用孤立HMW-HA-induced专业enlargeosomes和/或其生物活性成分可能是一个潜在的疾病治疗策略包括受损血管的完整性。

 利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

 确认

作者要感谢美国伊利诺理工大学生物医学工程的援助Nanosight纳米粒子跟踪分析(NTA)。这项研究受到了美国心脏协会国家科学家发展批准号0730277 n(帕特里克·a .单例),NIH NHLBI奖RO1-HL 095723(帕特里克·a .单例),和NIH R01NS067247(迈克尔·艾伦)。

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