IJBC 国际期刊的乳腺癌 2090 - 3189 2090 - 3170 Hindawi 10.1155 / 2017/9619734 9619734 研究文章 3 Semaphorin增加FAK磷酸化在调节焦点粘连mda - mb - 231细胞迁移和扩散浓度在不同的基础上 http://orcid.org/0000 - 0002 - 5381 - 3967 格尔 斯科特 主持人 弗朗西丝·V。 米勒 亚历克斯·M。 Luparello 克劳迪奥。 生物系 奥古斯塔纳学院 岩岛 伊尔61201 美国 augie.edu 2017年 15 01 2017年 2017年 31日 08年 2016年 11 12 2016年 12 12 2016年 15 01 2017年 2017年 版权©2017斯科特·格尔et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

integrin-mediated粘连之间的相互作用和细胞外基质(ECM)是重要的监管机构的细胞迁移和扩散。然而,细胞外配体调控细胞迁移和扩散机制在下层的浓度变化而不清楚。Semaphorin 3 (Sema3A)已被证明能够抑制细胞活性和改变各细胞信号转导。我们建议Sema3A改变焦点粘连调节乳腺癌细胞迁移和扩散与不同浓度的ECM下层涂布。我们证明Sema3A抑制mda - mb - 231细胞迁移和扩散上下层涂有高浓度的胶原蛋白和纤连蛋白可增强胶原蛋白、纤粘连蛋白的低浓度的迁移和扩散所造成的。Sema3A增加粘着斑激酶磷酸化酪氨酸397 (pFAK<年代up>397年)焦粘连在所有下层胶原、纤粘连蛋白的浓度,但pFAK下降<年代up>397年层粘连蛋白水平。Rho-associated蛋白激酶(岩石)抑制块Sema3A-mediated影响细胞迁移、扩散和pFAK<年代up>397年在焦粘连培养浓度的胶原蛋白。这些结果表明,Sema3A变化的最优水平cell-matrix粘连nonoptimal ECM涂料浓度,特别是胶原蛋白,产生最大可能介导细胞迁移和扩散通过ROCK-dependent机制。

 1。介绍

细胞迁移是至关重要的正常和病理过程,包括胚胎发育、伤口愈合、血管生成和肿瘤转移( 1]。细胞迁移涉及一系列协调过程,包括前缘突出、附件的前缘基质环境通过cell-substratum附件,和收缩的后缘细胞通过减少cell-substratum附件为了促进易位( 2]。整合蛋白跨膜受体形成cell-substratum粘连的链接通过各种脚手架ECM底层细胞骨架蛋白( 3]。整合蛋白上的化学和机械性能有关的细胞外环境改变信号转导途径影响多种细胞反应,如细胞形状、迁移、增殖,基因转录 4]。尽管在调节各种细胞反应信号转导的作用已被广泛研究,它不容易理解如何改变integrin-cytoskeletal联系ECM不同属性的变化。

研究表明,细胞表现出一种两相的细胞迁移速度和提高粘附强度之间的关系,表明细胞经历一个最佳水平的cell-substratum粘附强度促进最大细胞迁移( 5, 6]。例如,如果cell-substratum粘连的强度太低,细胞没有表现出足够的牵引来有效地移动,导致减少的能动性。然而,如果cell-substratum粘连的强度过高,cell-substratum附件细胞克服太强,导致减少的能动性。各种研究产生了成效,支持粘附强度之间的关系通过调节底物浓度和细胞活性,整合素的表达,或integrin-ECM绑定关联 5- - - - - - 8]。此外,其他研究已经证明的粘附强度和细胞之间的关系是双向的传播( 9, 10),而下层浓度的变化可以改变细胞形态( 11]。这些发现表明,粘附强度调节各种细胞反应依赖肌动蛋白细胞骨架的变化。在两相的粘附强度和细胞形状之间的关系,能动性,和传播支持,细胞外配体调节变化cell-substratum粘合度改变细胞反应还不是很清楚。

Semaphorins因素,最初是在神经轴突寻路发展特征的作用[ 12]。然而,semaphorins在其他生理过程发挥着重要作用,如参与免疫反应,血管生成和癌症( 13]。例如,semaphorins已被证明能够抑制肿瘤进展和转移的各种类型的癌症( 12]。特别是,semaphorin 3 (Sema3A)显示肿瘤抑制效果对前列腺癌和乳腺癌细胞迁移和入侵体外( 14, 15]。此外,过度Sema3A体内抑制肿瘤的生长和转移使用异种移植小鼠模型( 16- - - - - - 18]。抑制的Sema3A coreceptor neuropilin-1,阻碍了Sema3A-mediated对肿瘤转移的影响( 18]。的确,减少Sema3A的表达与乳腺癌和黑色素瘤的发展在人类 17, 19]。总的来说,这些发现表明Sema3A在肿瘤进展中具有重要的病理生理学作用。

Sema3A增加整合素表达和细胞粘附在乳腺上皮细胞癌治疗的 α2 β1对细胞粘附增加抗体块Sema3A-induced [ 20.]。Semaphorins调节整合素功能通过各种信号和目标细胞骨架变化机制( 12]。例如,Sema3A刺激海马树突的生长通过integrin-dependent磷酸化的粘着斑激酶(FAK) [ 21]。消融FAK块Sema3A-induced组装integrin-mediated粘连和海马神经元的轴突重建 22]。提高轴突生长Semaphorin 7通过integrin-dependent激活MAPK的 23]。Toyofuku et al。 24],Sema3A抑制神经突生长显示背根神经节神经元在integrin-dependent差别通过对这些细胞粘连。这些研究涉及一个重要的角色在调解semaphorin-induced integrin-dependent信号在神经细胞反应,细胞癌。

最大细胞运动性和传播是由cell-substratum胶粘剂互动依赖于整合素的表达,integrin-ECM亲和力和底物的浓度。然而,目前尚不清楚不同ECM分子或下层浓度的变化可以调节Sema3A-mediated细胞活性的变化和蔓延。因此,我们评估是否Sema3A改变的能动性和传播mda - mb - 231乳腺癌细胞下层涂以不同浓度的ECM cell-substratum粘附动力学的变化。如果Sema3A增加病灶粘连在mda - mb - 231细胞,然后我们预测Sema3A治疗会抑制细胞的能动性和传播与高浓度的ECM下层涂布。然而,在nonoptimal下层的浓度,我们预期增强细胞活性和传播通过增加局部粘连。我们的发现证明Sema3A抑制细胞活性和传播上下层涂有高浓度的胶原蛋白或纤连蛋白,但增强了能动性和传播时胶原蛋白或纤连蛋白涂层浓度降低。此外,Sema3A提高pFAK<年代up>397年水平焦粘连在所有胶原、纤粘连蛋白的含量,但降低了pFAK<年代up>397年水平在焦粘连层粘连蛋白,这表明Sema3A调节焦点粘连在回应改变底物浓度。抑制Rho-associated激酶(岩石)阻塞Sema3A-mediated细胞活性的变化,传播,pFAK<年代up>397年在焦粘连胶原蛋白。这些发现表明,Sema3A音乐细胞反应nonoptimal ECM涂料浓度通过增加局部粘连,可能涉及ROCK-dependent机制。这些观察潜在的肿瘤转移的治疗注意事项整合素表达的变化,ECM沉积,Sema3A表达在肿瘤进展。

 2。材料和方法 2.1。试剂

鼠尾胶原蛋白I型(# 354236)和人类纤连蛋白(# 354008)从康宁。鼠标层粘连蛋白我从Trevigen(# 3400-010-01)购买,公司重组人类IgG1 Fc (# 110 - hg)和重组人类3 semaphorin Fc嵌合体(# 1250 - s3)从研发系统购买。一块石头抑制剂(y - 27632;# 688000)从EMD密理博公司购买。鼠标反FAK (pY397;# 611806)购买的BD转导实验室。异硫氰酸Phalloidin-Tetramethylrhodamine B (# P1951)从Sigma-Aldrich获得。Alexa488山羊anti-mouse免疫球蛋白(# 115-545-003)来自杰克逊ImmunoResearch实验室,Inc . CellTiter 96®AQueus一个解决方案(# G3580)从Promega公司购买。胎牛血清(# SH30071.03)和penicillin-streptomycin HyClone (# SV30010)获得。所有文化媒体康宁。

 2.2。细胞系,细胞培养

mda - mb - 231乳腺癌细胞被慷慨地提供的帕特里夏·j·基尔博士(大学麦迪逊分校)。细胞在DMEM培养包含10%的边后卫+ penicillin-streptomycin。对所有实验中,“低”涂料浓度是1 - 3 μg / mL,“中间”涂料浓度是10 μg / mL,“高”涂料浓度是50 - 100 μ克/毫升的胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白。

 2.3。划痕检测

16小时前细胞播种,井12-well细胞培养板涂有不同浓度的胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白。所有井都阻塞10毫克/毫升脂肪无酸的牛血清白蛋白在PBS细胞镀前1小时在室温下。800年 μmda - mb - 231细胞的L(250000细胞/毫升)悬浮在完成媒体(含10%的边后卫)镀到每个。24小时后,细胞被冲洗和serum-starved 18个小时之前形成。生产后伤口使用200 μL移液管,分离细胞冲洗和新鲜血清媒体包含100 ng / mL IgG1 Fc或Sema3A被添加到细胞和被允许迁移18小时37°C / 5%的股份有限公司<年代ub>2。伤口获得使用10倍的图像目标在一个奥林巴斯IX-51倒置显微镜配有打印大师CCD相机。图像是获得使用打印大师q capture Pro。细胞迁移(%区域关闭)被测量伤口面积量化后伤口形成和24小时后使用ImageJ分析软件( https://imagej.nih.gov/ij)。

 2.4。延时视频显微镜

35毫米组织培养盘是涂有不同浓度的胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白。细胞播种之前,ECM摘除和盘子被封锁10毫克/毫升脂肪无酸的BSA在PBS在室温下30分钟。块后,细胞在无血清DMEM resuspended含有抗生素和2毫升的细胞悬液(25000细胞/毫升)被添加到这道菜,并且允许附加16小时37°C / 5%的股份有限公司<年代ub>2。第二天,媒体增长从每道菜,取而代之的是新鲜血清包含50 mM消息灵通的媒体。30分钟前成像,100 ng / mL IgG1 Fc或Sema3A添加到细胞和培养皿放置在加热显微镜阶段。相衬显微镜的图像捕获使用10倍的目标在一个奥林巴斯IX-51倒置显微镜配有打印大师QIClick cooled-CCD相机。图像捕获每1分钟60分钟使用打印大师q capture Pro。细胞的速度和方向持久性使用MTrackJ量化( https://www.imagescience.org)。

 2.5。细胞扩散分析

16小时前细胞播种,22×22毫米玻璃盖玻片被涂上一层200 uL的不同浓度的胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白。所有的盖玻片与200年被封锁 μL 10毫克/毫升fatty-acid-free牛血清白蛋白在室温下30分钟前细胞板。200年 μL细胞(500000细胞/毫升)包含100 ng / mL IgG1 Fc或采用无血清Sema3A媒体被添加到每个盖玻片。细胞被允许连接和传播30分钟37°C / 5%的股份有限公司<年代ub>2。30分钟后,细胞与200 uL 0.25%戊二醛固定10分钟。盖玻片都用PBS的前两次200 μL的0.5 μM TRITC-phalloidin含有0.5% Trition x - 100。在室温下盖玻片是孵化了45分钟,然后冲洗和安装延长不变色(分子探针)。使用40 x目标图像捕获蔡司Axiovert直立荧光显微镜配有AxioCam MRm相机。细胞面积使用ImageJ量化。

 2.6。免疫荧光

mda - mb - 231细胞被镀上22×22毫米盖玻片涂以不同浓度的胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白。细胞分离和使用100 ng / mL Fc控制或Sema3A和10 μy - 27632(或控制),适用时,电镀前30分钟到盖玻片。在37°C /小时孵化后5%的股份有限公司<年代ub>2,细胞与冷的4%多聚甲醛固定15分钟。细胞被冲洗与PBS和淬火0.15甘氨酸在室温下10分钟。冲洗后,0.1% Triton x - 100 (PBS)添加到细胞在室温下10分钟。细胞被封锁10%正常山羊血清(杰克逊ImmunoResearch实验室,Inc .)在室温下1小时。细胞在湿润孵化室一夜之间在4°C 1: 100鼠标反FAK (pY397)血清抗体在10%正常的驴。冲洗后,细胞被孵化1:800 Alexa488山羊anti-mouse免疫球蛋白g + 0.5 μM TRITC-phalloidin (Sigma-Aldrich)在室温下1小时。广泛的清洗后,盖玻片安装了延长不变色。图像使用100 x客观分析了蔡司Axiovert直立荧光显微镜配有AxioCam MRm相机,和图片是使用AxioVision 4.7软件。

 2.7。量化的pFAK <一口> 397 < /一口>染色

焦粘连是量化使用两种方法。平均总表面积被焦粘连是量化如前所述 25]。简而言之,图像进行了二值化和pFAK的阈值<年代up>397年染色。总表面积被pFAK占领<年代up>397年对于每个单元格,使用量化分析粒子ImageJ的函数。平均总表面积被pFAK占领<年代up>397年为每个细胞是细胞面积归一化由TRITC-phalloidin决定。这种方法占平均细胞面积的变化不同处理条件下的结果。

 2.8。扩散分析

16小时前细胞播种,井的96孔板涂有不同浓度的胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白。所有井都阻塞10毫克/毫升脂肪无酸的牛血清白蛋白在PBS细胞镀前30分钟在室温下。100年 μL细胞(50000细胞/毫升)悬浮在完成媒体(含10%的边后卫)镀到每个好,37°C / 5%孵化有限公司<年代ub>2。24小时后,媒体被拆除,代之以100年完成 μL无血清媒体包含100 ng / mL IgG1 Fc或Sema3A。细胞培养24小时37°C / 5% / CO<年代ub>2。24小时后,20 μL 96年CellTiter 一个 问 u e o u 年代 一个解试剂添加到每个好,板在37°C / 5%孵化有限公司<年代ub>21小时。细胞增殖为每个条件决定通过测量吸光度在490 nm使用VersaMax标(分子设备)。

 2.9。细胞形状分析

循环和长宽比是用来测量细胞形状如前所述[ 26]。细胞循环和长宽比都是用来测量细胞的圆度。细胞图像捕获的细胞扩散试验分析了循环和长宽比。ImageJ是用来测量每个细胞和圆的面积和周长是由(4 π×面积/周长<年代up>2)。长宽比描述细胞的伸长长轴的长度除以细胞的短轴的长度(长轴/短轴)使用ImageJ来衡量。

 2.10。生产数字图像

数字图像处理和生产使用Adobe Photoshop CS5 (Adobe Systems,圣何塞,CA)。

 3所示。结果 3.1。Sema3A抑制mda - mb - 231细胞活性在高基础但浓度提高运动性下层浓度较低

研究表明,细胞最大速度是由cell-substratum粘附强度是影响下层浓度( 5, 6]。Sema3A被发现增加整合素受体表达和细胞粘附在乳腺癌细胞,抑制乳腺癌细胞的能动性( 15, 20.]。然而,细胞外信号的手段,如Sema3A、调节变化cell-substratum粘附强度改变癌细胞迁移速度并不清楚地阐明。因此,我们决定是否Sema3A改变的运动性反应mda - mb - 231乳腺癌细胞增加涂料的I型胶原浓度、纤连蛋白、层粘连蛋白和I . mda - mb - 231细胞癌表达Sema3A coreceptors, plexin A1和neuropilin-1,使它成为适合本研究的细胞系( 16]。细胞活性评估使用的划痕试验培养mda - mb - 231乳腺癌细胞与胶原蛋白浓度增加下层涂布在IgG1 Fc控制或Sema3A(数字 1(一)和 1 (b))。IgG1 Fc控制条件,mda - mb - 231细胞迁移表现出两相的反应增加涂料胶原、纤粘连蛋白的浓度,这是与以前公布的结果(数据一致 1 (c)和 1 (d))[ 5, 6]。上下层涂有低浓度的胶原蛋白(0.1 -10 μg / mL), Sema3A增强区域关闭了50 - 78% IgG1 Fc控制(图 1 (c))。然而,在下层涂有高浓度的胶原蛋白(100 μg / mL), Sema3A抑制活性40%。Sema3A高胶原蛋白涂层浓度的抑制作用是与先前的研究一致 15, 20.]。然而,Sema3A增强活性反应的观察低浓度的胶原蛋白没有被记录到我们的知识。有趣的是,Sema3A没有纤连蛋白的抑制对细胞培养的影响但运动性增强45%下层涂有5 μg / mL纤连蛋白相比IgG1 Fc控制(图 1 (d))。总的来说,Sema3A没有任何重大影响mda - mb - 231细胞迁移在镀层粘连蛋白(图 1 (e))。在所有下层Sema3A浓度的影响并没有改变细胞增殖的结果(补充图 1 在网上补充材料 https://doi.org/10.1155/2017/9619734)。

Sema3A增强细胞迁移涂层较低浓度的胶原蛋白,但抑制迁移在高涂层浓度的胶原蛋白。((a)和(b))代表图像的mda - mb - 231细胞培养上下层涂有低(1.0 μ中间(10 g / mL) μg / mL),高(100 μg / mL)在100年的胶原蛋白的浓度 μg / mL IgG1 Fc控制或Sema3A。比例尺= 100 μm。((c) - (e))细胞迁移以平均面积百分比关闭从细胞培养在不同涂料浓度的胶原蛋白(c),纤连蛋白(d)和层粘连蛋白(e)的IgG1 Fc控制或Sema3A。Sema3A增强胶原蛋白的迁移和中间涂层浓度较低59%和58%,分别,但是抑制移民40%高涂层浓度的胶原蛋白。然而,尽管Sema3A增强涂层较低浓度的纤连蛋白迁移45%,没有显著减少迁移在高涂层纤连蛋白的浓度。总的来说,对层粘连蛋白Sema3A没有任何重大影响。数据提出了平均%区域关闭±SEM从至少三个独立的实验。 p ∗ < 0.001 , p ∗ ∗ < 0.005 , p ∗ ∗ ∗ < 0.01 , p # < 0.05 显示统计学意义相对于IgG1 Fc控制;两个示例 t 以及。

Sema3A是否具有明显的影响mda - mb - 231细胞的能动性动力学镀上胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白,我们执行延时视频显微镜。一般来说,迁移路径上培养的细胞胶原蛋白、纤粘连蛋白的比那些培养更持久层粘连蛋白(数字 2(一个)- - - - - - 2 (c))。Sema3A-treated细胞镀上下层涂上中间的胶原蛋白浓度表现出增强的迁移速度大约2倍IgG1 Fc控制,而细胞下层涂有高浓度的胶原蛋白有经验~ 33%减少细胞与Sema3A治疗后(图速度 2 (d))。相对于IgG1 Fc控制、定向镀持久性的细胞在胶原蛋白Sema3A治疗(图后并没有改变 2 (e))。Sema3A增强细胞速度~ 52%在下层涂有低浓度的纤连蛋白但抑制细胞中间(~ 22%)和高速度涂料浓度(~ 23%)的纤连蛋白相比IgG1 Fc控制(图 2 (f))。定向持久性之间类似的控制和Sema3A治疗纤连蛋白的浓度(图 2 (g))。这些观察胶原蛋白和纤连蛋白符合从划痕试验(图中观察到的趋势 1)。而产生的划痕试验类似的趋势随着延时结果,数据并不总是具有统计学意义。这可能是由于贡献和信息交互的划痕试验和单细胞分析延时视频显微镜。与图中给出的结果一致 1在下层,Sema3A没有影响细胞的速度涂有低,高浓度的层粘连蛋白但抑制细胞中间涂料层粘连蛋白的浓度(图速度 2 (h))。有趣的是,Sema3A增加定向持久性与高浓度的下层涂布层粘连蛋白但没有影响下层涂布层粘连蛋白浓度较低(图 2(我))。缺乏任何观察到的影响Sema3A中间涂料层粘连蛋白浓度在划痕试验可能是由于细胞的定向低持久性轨迹。总的来说,这些结果表明,Sema3A运动性曲线变化,特别是胶原、纤连蛋白,在低和中间底物浓度,Sema3A增强mda - mb - 231细胞活性,而在较高的底物浓度,Sema3A抑制对细胞活性的影响。

Sema3A调节细胞的速度,但不是持久性、胶原蛋白、纤粘连蛋白改变运动动力学,但不是层粘连蛋白。((a) - (c))上升情节显示10代表曲目迁移轨迹的胶原蛋白(a),纤连蛋白(b)和层粘连蛋白(c)根基上涂有低,中间,和ECM的高浓度。比例尺= 10 μm。胶原蛋白的平均细胞测量速度和方向的持久性((d)和(e)),纤连蛋白((f)和(g))和层粘连蛋白(h)和(i)。Sema3A增强两种胶原、纤粘连蛋白的活性涂层浓度较低但抑制活性涂层胶原、纤粘连蛋白的浓度更高。有趣的是,Sema3A抑制活性在中间涂料层粘连蛋白的浓度。画数据代表均值±SEM至少30个细胞从四个独立的实验。 p ∗ < 0.001 , p ∗ ∗ < 0.005 , p ∗ ∗ ∗ < 0.01 显示统计差异相对于IgG1 Fc控制;两个示例 t 以及。

 3.2。Sema3A抑制mda - mb - 231细胞在高传播基础但浓度提高传播基础浓度较低

细胞扩散需要整合蛋白形成cell-substratum粘连链接ECM的肌动蛋白细胞骨架,以调节细胞大小和形状并启动细胞迁移( 10, 27- - - - - - 29日]。类似于活性,细胞已被证明具有两相的扩散反应表面密度增加胶原蛋白( 9]。鉴于观察Sema3A增加整合素表达在乳腺癌细胞( 20.),以及我们的观察对于Sema3A对细胞活性的影响在不同的底物浓度,我们试图确定Sema3A改变mda - mb - 231细胞的扩散反应增加涂层各种ECM的浓度。细胞扩散是通过测量评估细胞区域与不同浓度对下层涂布后的ECM Sema3A的存在与否。在所有测试的下层,下层涂料浓度和细胞之间的正相关区(图 3)。这些数据与先前的研究一致显示类似的ECM涂层密度和细胞扩散之间的关系( 10, 27, 28]。在下层涂层较低(0.1 -10 μg / mL)胶原蛋白浓度,Sema3A增加细胞但抑制细胞在高传播地区涂料浓度的胶原蛋白(数字 3(一个)和 3 (b))。例如,在下层涂有胶原蛋白1.0 ug /毫升、Sema3A增加细胞面积相比IgG1 Fc控制(平均细胞面积= 816.7 ± 357.82 u 米 2 对于IgG1 Fc和控制 1013.8 ± 363.52 u 米 2 Sema3A)。然而,在下层涂有高浓度的胶原蛋白,Sema3A抑制细胞传播(平均细胞面积= 1088.7 ± 363.2 u 米 2 对于IgG1 Fc和控制 957.0 ± 324.0 u 米 2 Sema3A)。相似,但不健壮,Sema3A治疗观察对纤连蛋白的影响(图 3 (c))。Sema3A抑制细胞下层涂布在中间传播和高浓度的层粘连蛋白,但没有表现出任何刺激影响层粘连蛋白(图 3 (d))。符合我们观察细胞活性,Sema3A增强细胞传播低和中间下层胶原、纤粘连蛋白的浓度,但不是层粘连蛋白,而抑制传播基础涂料浓度很高。

Sema3A增加细胞传播低和中间涂层胶原、纤粘连蛋白的浓度,但抑制扩散涂层胶原、纤粘连蛋白的浓度很高。(一)代表图像的细胞附着在下层涂有低(1.0 μ中间(10 g / mL) μg / mL),高(100 μg / mL)的胶原蛋白浓度使用TRITC-phalloidin染色。比例尺= 20 μm。平均面积细胞暴露于浓度增加下层胶原蛋白(b),纤连蛋白(c)和层粘连蛋白(d)。Sema3A增强胶原蛋白、纤粘连蛋白的细胞扩散涂料浓度较低但抑制扩散涂层胶原、纤粘连蛋白的浓度很高。Sema3A抑制扩散在不同涂料层粘连蛋白浓度,但没有任何刺激影响细胞扩散。数据提出了平均细胞面积±SEM为每个条件至少100个细胞。 p ∗ < 0.001 , p ∗ ∗ < 0.005 , p # < 0.05 显示统计学意义相对于IgG1 Fc控制;两个示例 t 以及。

除了测量细胞面积作为integrin-based细胞扩散的迹象,我们评估细胞形态学的变化使用循环和长宽比的测量。细胞形态,除了能动性和传播,是由integrin-mediated变化cell-substratum粘连,ECM链接到肌动蛋白细胞骨架 10, 28, 30.]。细胞循环和长宽比的圆度测量单元使用不同的测量参数。细胞循环性接近于1,比例较低(接近1)更圆,而细胞循环接近0和高纵横比(大于1)更细长(图 4(一))。细胞治疗Sema3A更细长的所有涂层的胶原蛋白的浓度减少循环和宽高比的增加(数据 4 (b)和 4 (c))。虽然对循环的影响更多的变量,增加比例建议更细长的细胞形态学处理Sema3A纤连蛋白(数字 4 (d)和 4 (e))。Sema3A没有任何一致的影响细胞形态学在层粘连蛋白循环和长宽比测量变量(数字 4 (f)和 4 (g))。例如,在下层涂有5.0 μSema3A循环增加,g / mL层粘连蛋白,但Sema3A循环根基上涂上100年有所下降 μ克/毫升层粘连蛋白。有趣的是,增加涂层的所有测试ECM分子浓度提升更细长的形态(数字 4 (b)- - - - - - 4 (g))。这些观察结果与先前的研究一致证明ECM的密度制约的效应细胞形态( 31日]。整体而言,这些结果表明,Sema3A促进胶原、纤粘连蛋白更细长的形态,而Sema3A对层粘连蛋白的影响变量。集体,Sema3A-induced mda - mb - 231细胞传播的变化和形态,以及细胞活性,表明Sema3A调节cell-substratum粘连的变化。

Sema3A改变细胞形态上对层粘连蛋白胶原、纤粘连蛋白,但最小的影响。(一)细胞沾TRITC-phalloidin示例图像。圆形的细胞显示循环接近1和低纵横比(接近1),而更多的细长细胞循环接近0和高纵横比(大于1)。酒吧= 20 μm。细胞循环和长宽比测量从细胞暴露于下层涂以增加胶原蛋白的浓度((b)和(c)),纤连蛋白((d)和(e)和层粘连蛋白((f)和(g))。Sema3A持续减少循环和增加下层长宽比涂上增加胶原蛋白的浓度,而Sema3A对纤连蛋白、层粘连蛋白等的影响不一致。画数据代表均值±SEM为每个条件至少80个细胞。 p ∗ < 0.001 , p ∗ ∗ < 0.005 , p # < 0.05 显示统计差异相对于IgG1 Fc控制;两个示例 t 以及。

 3.3。Sema3A增强pFAK <一口> 397 < /一口>焦点粘连Substrate-Specific的方式

通过integrin-mediated粘连细胞附着在ECM链接ECM肌动蛋白细胞骨架,以调节各种细胞反应,如细胞迁移和转移,粘附和增殖 3]。整合素与ECM的接触后,各种适配器蛋白质和细胞内信号分子被雇来整合素受体的胞质域作为支架之间ECM和肌动蛋白细胞骨架 29日]。例如,整合素结合ECM诱发粘着斑激酶(FAK)成为磷酸化酪氨酸397 (pFAK<年代up>397年),激活下游目标调节焦点粘连和其他细胞反应( 32]。此外,FAK磷酸化和局部病灶粘连在细胞粘附到ECM ( 32]。因此,我们评估使用pFAK焦粘连<年代up>397年抗体测定的影响Sema3A下层细胞镀上涂上增加胶原蛋白的浓度,纤连蛋白、层粘连蛋白。增加涂层浓度产生的所有测试下层pFAK的平均面积的增加<年代up>397年含有焦粘连(数字 5(一个)和 5 (b))。此外,Sema3A增强pFAK平均<年代up>397年地区根基涂敷胶原蛋白和中间浓度较低的但没有产生进一步影响胶原蛋白涂层浓度高(图 5 (b))。Sema3A对纤连蛋白的影响并不强劲,平均pFAK Sema3A增强<年代up>397年区域上下层涂有低浓度纤连蛋白,但没有显著的影响在中间,涂层的纤连蛋白浓度高。有趣的是,平均pFAK Sema3A减少<年代up>397年区域上下层涂有中间,层粘连蛋白的浓度高。占的影响Sema3A增加细胞(图蔓延 3),相对pFAK<年代up>397年面积是计算平均pFAK正常化<年代up>397年面积的平均细胞面积(使用TRITC-phalloidin)为每个条件。类似的趋势相对pFAK观察<年代up>397年面积在所有三个下层为平均pFAK观察<年代up>397年区域(图 5 (c))。此外,类似的结果病灶粘连测量时使用vinculin抗体(数据显示)。这些结果表明,Sema3A增强mda - mb - 231细胞迁移和扩散nonoptimal涂层通过增加pFAK胶原、纤粘连蛋白的浓度<年代up>397年水平局部粘连。

Sema3A增加pFAK<年代up>397年水平镀在焦粘连细胞的胶原蛋白、纤粘连蛋白,但不是层粘连蛋白。(a)代表图像的细胞生长在下层涂有低,中间,高浓度的胶原蛋白。间接免疫荧光法的局部粘连使用磷酸化FAK的抗体<年代up>397年(绿色)和复染色phalloidin(红色)。比例尺= 10 μm。(b) Sema3A pFAK平均总表面积的增加<年代up>397年~ 74%在下层涂层和中间浓度较低的胶原蛋白,而Sema3A生产增长127%在下层涂布纤连蛋白浓度较低。pFAK<年代up>397年染色不是统计不同涂料浓度很高的胶原蛋白或纤连蛋白。有趣的是,Sema3A pFAK平均总表面面积的减少<年代up>397年11 - 29%在所有涂料层粘连蛋白的浓度。相对pFAK (c)<年代up>397年区域分析的平均总表面积被pFAK占领<年代up>397年归一化由TRITC-phalloidin细胞总面积。数据提出了平均±SEM为每个条件至少50个细胞。 p ∗ < 0.001 , p ∗ ∗ < 0.005 , p # < 0.05 显示统计学意义相对于IgG1 Fc控制;两个示例 t 以及。

 3.4。Sema3A-Mediated mda - mb - 231细胞迁移的变化,蔓延,pFAK <一口> 397 < /一口>水平焦粘连涉及岩石信号

ρ家族gtpase焦粘连(有重要的调控作用 33- - - - - - 35]。例如,RhoA稳定病灶粘连通过ρ激酶(岩石)依赖激活肌凝蛋白II ( 29日, 36]。此外,integrin-mediated粘附ECM调节ρgtpase的活动,这改变myosin-induced收缩和肌动蛋白细胞骨架动力学( 29日]。Sema3A信号改变细胞骨架动力学通过改变ρGTPase信号( 37]。虽然整合素和Sema3A信号通路调节RhoA活动,目前尚不清楚Sema3A需要RhoA-dependent机制来改变焦点粘连调节细胞活性和扩散涂层基质浓度的变化。因此,我们评估RhoA效应的抑制剂的影响,岩石,Sema3A-induced细胞活性的变化,传播和焦粘连。Sema3A产生以来最具戏剧性的影响细胞迁移,细胞扩散,pFAK<年代up>397年胶原蛋白水平局部粘连,我们测试了岩石抑制剂的影响,y - 27632细胞反应的变化,增加涂层的胶原蛋白浓度。上下层涂层和中间浓度较低的胶原蛋白,y - 27632完全封锁了Sema3A-enhanced变化区域关闭(数字 6(一)和 6 (b))。然而,在下层涂有高浓度的胶原蛋白,y - 27632部分中断Sema3A-induced抑制细胞迁移,表明Sema3A可能利用额外的信号通路如胶原蛋白涂层浓度增加。y - 27632完全封锁了Sema3A-induced增加细胞区和中间涂层浓度低的胶原蛋白(图 6 (c))。然而,在下层涂有高浓度的胶原蛋白,y - 27632仅产生了类似的效果作为Sema3A独自细胞区域。但是,y - 27632没有额外的影响,结合Sema3A细胞区。由于观察到的影响Sema3A和y - 27632没有添加剂表明Sema3A信号通过岩石调节细胞扩散。有趣的是,y - 27632仅在细胞形态学变化,产生类似的单独Sema3A(数字 6 (d)和 6 (e))。然而,y - 27632生产没有额外加上Sema3A时细胞形态学的变化。最后,y - 27632阻塞Sema3A-induced增加平均pFAK<年代up>397年区域和相对pFAK<年代up>397年面积在所有浓度的胶原蛋白(数字 6 (f)- - - - - - 6 (h))。在一起,这些数据表明,Sema3A可能需要ROCK-dependent调解机制对mda - mb - 231细胞迁移的影响和传播,可能通过调节pFAK<年代up>397年水平局部粘连。

抑制的岩石挡住了Sema3A-mediated对细胞迁移的影响,传播,pFAK<年代up>397年水平局部粘连。(一)代表相衬显微镜的图像从根基上培养的细胞的划痕试验涂有10 μ在100年的存在g / mL胶原蛋白 μg / mL IgG1 Fc控制或Sema3A有无10 μy - 27632 M。比例尺= 100 μm。(b) y - 27632封锁了Sema3A-mediated影响所有涂层的胶原蛋白浓度测量使用%区域关闭。数据提出了平均%区域关闭±SEM从四个独立的实验。(c)平均细胞面积细胞培养下层涂有低,中间,高浓度的胶原蛋白。细胞治疗IgG1 Fc控制或Sema3A缺席或y - 27632的存在。y - 27632阻塞Sema3A所有涂料的胶原蛋白浓度的影响。画数据代表均值±SEM为每个条件至少120个细胞。((d)和(e)) y - 27632控制的影响和Sema3A-treated细胞评估使用细胞循环(d)和纵横比(e), Sema3A仅减少循环的次数,增加比例上下层涂层和中间浓度较低的胶原蛋白,y - 27632仅产生了类似的效果。数据提出了均值±SEM为每个条件从至少120个细胞。y - 27632抑制pFAK (f)<年代up>397年染色水平(绿色)在IgG1 Fc控制焦粘连,Sema3A-treated条件。细胞复染色使用TRITC-phalloidin(红色)。比例尺= 10 μm。((g)和(h)) pFAK的平均总表面积<年代up>397年(g)和相对pFAK<年代up>397年归一化细胞总面积(h)为控制和Sema3A-treated细胞暴露于下层涂有低,中间,高浓度的胶原蛋白的存在与否y - 27632。画数据代表均值±SEM为每个条件至少50个细胞。 p ∗ < 0.001 , p ∗ ∗ < 0.005 , p ∗ ∗ ∗ < 0.01 显示统计学意义相对IgG1 Fc控制所有画数据;两个示例 t 以及。

 4所示。讨论

细胞外基质以及其他细胞外配体,在肿瘤细胞浸润和转移中起着至关重要的作用。然而,细胞的方式整合众多细胞外信号诱导细胞反应的变化是不清楚。这项研究表明Sema3A是一个重要的监管机构的mda - mb - 231细胞迁移,蔓延,FAK信号病灶粘连在应对ECM底物浓度的增加。首先,我们表明,Sema3A变化的响应曲线mda - mb - 231细胞运动性和传播,这样Sema3A增强细胞迁移和扩散在下层胶原、纤粘连蛋白的涂布和中间浓度较低,但不是层粘连蛋白。然而,在下层涂有高浓度的胶原蛋白、纤粘连蛋白,Sema3A抑制细胞迁移和扩散。据我们所知,这是第一次Sema3A一直记录都刺激抑制对细胞活性的影响和传播反应底物浓度的变化。此外,Sema3A改变胶原、纤粘连蛋白的细胞形状在所有涂料浓度但没有实质性影响层粘连蛋白。第二,Sema3A提高pFAK<年代up>397年在焦点但胶原、纤粘连蛋白减少pFAK粘连<年代up>397年焦粘连在层粘连蛋白水平。最后,初步结果表明,抑制岩石块Sema3A-induced变化在细胞迁移,细胞扩散,pFAK<年代up>397年水平焦粘连在回应增加底物浓度的胶原蛋白。这些结果支持Sema3A的作用在调节细胞反应通过调制pFAK下层浓度的变化<年代up>397年水平焦粘连可能包括ROCK-dependent通路。

的力量cell-substratum粘连受到下层的浓度的影响,整合素的表达水平,integrin-ligand亲和力,或integrin-cytoskeletal交互( 5- - - - - - 8]。细胞迁移和扩散的程度影响的强度cell-substratum粘连,支持最大迁移和扩散的最适底物浓度( 5- - - - - - 9]。我们的观察,增加下层浓度增强迁移速度和传播(数字 1- - - - - - 3)与已发表的研究是一致的。有趣的是,Sema3A治疗转移的最大能动性和扩散反应mda - mb - 231细胞胶原蛋白、纤粘连蛋白的浓度降低涂层,但不是层粘连蛋白,而抑制细胞活性在高底物浓度(数据和传播 1- - - - - - 3)。此外,我们的研究结果表明,Sema3A-mediated能动性和扩散反应可能pFAK增加的结果<年代up>397年在焦粘连(图水平 5)。事实上,Sema3A治疗细胞胶原蛋白产生最大的能动性和传播响应(数据的转变 1- - - - - - 4),同时也生产对pFAK最健壮的影响<年代up>397年在焦粘连(图水平 5)。研究表明,最大细胞迁移是由底物浓度之间的相互关系和整合素表达( 6, 8]。例如,减少integrin-ligand亲和力增强细胞迁移在高底物浓度,同时增加integrin-ligand亲和力促进最大细胞迁移在低浓度的基础( 6, 8]。此外,中断integrin-cytoskeletal摄动CHO细胞的迁移和扩散的联系,提供了额外的证据表明cell-substratum粘连的强度是重要的对下层的浓度变化来调节细胞反应( 8]。虽然研究已经证明,Sema3A上调 α2 β镀1整合素表达在乳腺癌肿瘤细胞在胶原蛋白 20.),这项研究的未来方向是衡量整合素表达水平细胞上镀上不同浓度的ECM为了充分理解之间的关系cell-substratum粘附强度和细胞迁移和回应Sema3A蔓延。根据这一点,我们的研究表明,Sema3A音乐细胞反应nonoptimal ECM涂料浓度通过增加局部粘连。

Sema3A已经被证明可以有效地整合素表达和细胞粘附在乳腺癌细胞( 20.),而我们的研究结果表明,Sema3A增加信号转导,pFAK的增加<年代up>397年在局部粘连,胶原、纤粘连蛋白(图 5)。然而,Sema3A调节整合素激活的机制或integrin-mediated信号不是很好理解。研究表明Sema3A介导通过integrin-mediated FAK磷酸化的影响。例如,Sema3A调节小鼠海马神经元的轴突重建通过FAK-dependent通路( 22]。此外,失活 β1整合素或FAK封锁了Sema3A-induced增加海马神经元的树突扩展( 21]。我们的研究结果表明,Sema3A-mediated变化在细胞迁移,扩散,pFAK<年代up>397年在焦粘连可能需要岩石信号(图 6)。我们的研究结果是一致的与其他研究显示Sema3A治疗乳腺癌细胞增加RhoA活动抑制细胞迁移( 38]。然而,我们的研究结果表明Sema3A可能需要岩石信号调节mda - mb - 231细胞迁移、扩散和pFAK<年代up>397年水平焦粘连是初步的。说完这些,是否通过FAK-dependent Sema3A调节信号转导通路,或其他信号通路,调节RhoA活动,为了增加下层浓度为未来的调查仍然是一个问题。

我们的观察表明,Sema3A刺激变化mda - mb - 231乳腺癌细胞运动性,substrate-specific方式蔓延,焦粘连。Sema3A似乎最健壮镀影响细胞在胶原蛋白或纤连蛋白,在细胞的反应镀层粘连蛋白是最小的。这些观察暗示Sema3A可以调节细胞反应integrin-specific地在乳腺癌细胞。事实上,I型胶原、纤连蛋白抑制paclitaxel-induced mda - mb - 231细胞凋亡在乳腺上皮细胞,而laminin-1没有保护作用[ 39]。此外,胶原蛋白我和纤连蛋白的保护作用是通过介导的 α2 β1, α5 β1整合蛋白,分别。这些发现表明,乳腺癌细胞可能有不同的反应Sema3A基于不同的整合蛋白表达谱。需要进一步调查来评估Sema3A的影响在不同的整合素亚单位的表达可能带来的选择性响应Sema3A ECM的不同类型。

Sema3A可以抗癌和protumorigenic对细胞的影响。例如,Sema3A抑制肿瘤生长、迁移和转移的乳腺癌和前列腺癌细胞以及黑色素瘤( 14- - - - - - 17),但促进胰腺癌和结肠癌细胞入侵( 40, 41]。此外,Sema3A对整合素活化和细胞粘附的影响似乎特异性。Sema3A抑制细胞粘附在前列腺癌细胞和背根神经节神经元( 14, 24),但促进整合素的活化和细胞粘附在乳腺癌细胞 20.]。Sema3A特异性反应的一种解释可能是由于不同的绑定状态Sema3A coreceptors, plexin A1和neuropilin-1。L1凸轮为例,微扰,直接与neuropilin-1交互,可以开关Sema3A-induced神经生长锥排斥到吸引力( 42]。事实上,大量细胞外指导线索是吸引或排斥对神经生长锥取决于细胞上下文( 43]。例如,培养的大鼠小脑轴突转过身从源stromal-derived因子1 (SDF-1)通过G protein-coupled受体激活的蛋白激酶C (PKC),同时抑制PKC SDF-1-induced突排斥转换成有吸引力的转向SDF-1[的来源 44]。根据本研究的结果,它是可行的,Sema3A可能改变FAK磷酸化在病灶粘连对ECM成分变化调节细胞反应基质的肿瘤进展。然而,Sema3A信号调节整合素的机制功能,反之亦然,开关乳腺上皮细胞的能动性和扩散反应镀在不同浓度的ECM仍未来调查的主题。

本研究可能的观测生理和病理意义,因为他们可以解释一些潜在的机制ECM成分在正常组织形态发生变化以及发病机理可能导致肿瘤的进展和转移。浸润性癌进行整合蛋白表达水平的改变以及基质沉积的变化ECM ( 2, 45]。例如, α2 β1整合素(主要是胶原蛋白)结合,并整合素亚单位,包括 α1, α6, β1,或者 β4整合素亚单位,乳腺上皮肿瘤中表达下调( 46]。胶原蛋白(我、III和V)和纤连蛋白,其他ECM成分,调节基质的浸润性乳腺癌( 45, 47]。此外,Sema3A被认为函数作为一个肿瘤抑制减少Sema3A表达与乳腺癌和黑色素瘤的发展在人类 17, 19],而过度Sema3A体内抑制肿瘤的生长和转移使用异种移植小鼠模型( 16- - - - - - 18]。事实上,研究表明,乳腺癌细胞分泌Sema3A信号通过自分泌机制移植 α2 β1整合素表达[ 26]。该研究提供了证据暗示Sema3A信号在调制cell-substratum粘连的作用整合素表达,ECM沉积,Sema3A表达改变在乳腺肿瘤的进展。然而,未来的调查应该关注识别和描述乳腺癌细胞如何整合机制的细胞外信号通过整合素和nonintegrin受体调节cell-substratum相互作用在肿瘤细胞浸润和转移。

 缩写 Sema3A:

Semaphorin 3

 ECM:

细胞外基质

 FAK:

粘着斑激酶

 石:

Rho-associated蛋白激酶。

 相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

 确认

作者感谢Drs。保罗·c·一起和苏珊·m·Ponik手稿提供宝贵的意见和讨论。这个调查是由奥古斯塔纳学院新教师研究基金(斯科特·格尔)以及一个奥古斯塔纳本科生研究奖学金(亚历克斯·m·米勒)。

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