IJBC 国际期刊的乳腺癌 2090 - 3189 2090 - 3170 Hindawi出版公司 628697年 10.1155 / 2012/628697 628697年 研究文章 溶瘤细胞的临床前评价Δ γ 134.5单纯疱疹病毒表达Interleukin-12乳腺癌脑转移的治疗 科迪 詹姆斯·J。 1 Scaturro 彼得罗 2 康托尔 Alan B。 3 燕西Gillespie G。 2、4、5所示 帕克 杰奎琳·N。 1 Markert James M。 1、2、5、6 Montemurro 菲利波 1 传染病部门的 儿科,在伯明翰阿拉巴马大学的 2号大街1720号南 伯明翰 AL 35294 美国 uab.edu 2 神经外科的 外科学系,在伯明翰阿拉巴马大学的 2号大街1720号南 伯明翰 AL 35294 美国 uab.edu 3 预防医学的部门 医学系,在伯明翰阿拉巴马大学的 2号大街1720号南 伯明翰 AL 35294 美国 uab.edu 4 微生物学系 伯明翰阿拉巴马大学 2号大街1720号南 伯明翰 AL 35294 美国 uab.edu 5 细胞生物学系 伯明翰阿拉巴马大学 2号大街1720号南 伯明翰 AL 35294 美国 uab.edu 6 生理学和生物物理学系 伯明翰阿拉巴马大学 2号大街1720号南 伯明翰 AL 35294 美国 uab.edu 2012年 31日 12 2012年 2012年 22 07年 2012年 22 11 2012年 22 11 2012年 2012年 版权©2012年詹姆斯·j·科迪et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

乳腺癌的转移到大脑和中枢神经系统(CNS)是一个越来越重要的问题。提高治疗继续延长病人生存,中枢神经系统转移乳腺癌的发病率正在上升。新的治疗方法是必要的,因为目前的治疗受到有害的副作用,通常姑息。我们以前描述一个溶瘤单纯疱疹病毒(HSV),指定M002,缺少的两个副本 γ134.5神经毒性基因和带有小鼠白介素12 (il - 12)表达盒,并验证其抗肿瘤疗效的临床前模型原发性脑瘤。然而,M002尚未被评估使用大脑对转移性肿瘤。这里,我们证明了:人类乳腺癌细胞和小鼠乳腺癌从M002支持病毒复制和表达il - 12;M002复制,破坏从各种各样的组织学亚型乳腺癌细胞,包括“三阴”和HER2 overexpressing;M002改善生存在一个免疫活性的模型更有效地比non-cytokine控制病毒。因此,我们从本原理研究得出 γ134.5删除白介素表达溶瘤细胞的HSV可能是一个潜在的新治疗乳腺癌脑转移。

 1。介绍

乳腺癌,女性最常见的癌症,折磨一生大约八分之一。当前治疗策略可能治愈,如果申请早,但更有效的对转移性疾病,占大多数的死亡。15%到20%的乳腺癌患者最终诊断为颅内转移,与解剖数据表明30%或更多可能会承担这些病变( 1, 2]。治疗改善noncranial转移、脑转移的频率正在增加。例如,多与代理赫赛汀治疗取得成功,单克隆抗体针对人类表皮生长因子受体2 (HER2) [ 3, 4]。然而,赫赛汀和常用化疗不穿过血脑屏障( 5, 6)在治疗有效的水平,从而保持大脑的“保护区网站”系统管理无法到达肿瘤细胞疗法( 6]。因此,控制系统性疾病患者的神经系统并发症越来越屈从于中枢神经系统(CNS)转移。大脑中建立治疗转移通常是缓和( 7, 8)和总生存期的患者这一诊断是很少超过一年( 2]。手术可以有效对抗孤独的病变,但患者通常表现为多发性病灶,可以使这种方法不切实际,和肿瘤复发频繁。放射治疗和放射治疗的治疗方法也被用于治疗脑转移与适度的成功,但这些方法都有局限性,包括不良副作用的可能性( 9),突出“化疗脑”的神经毒性 10)以及无法有效地治疗病人,更广泛的颅内疾病。很明显,新的创新的治疗需要战斗颅内转移的乳腺癌。

免疫疗法是一种相对较新的方法来治疗乳腺癌。虽然乳腺癌表达各种潜在的肿瘤抗原,给定的肿瘤可能只能表达一个或没有。此外,因为他们的异构特性,肿瘤可能逃脱免疫疗法基于单个抗原。因此,它不太可能针对单一多肽疫苗将普遍成功。相比之下,cytokine-based免疫疗法有可能刺激病人肿瘤特异性免疫反应。脑瘤患者的免疫治疗方法已经尝试但迄今为止被无效的系统性免疫有限,使用同种异体抗原,或足够数量的激活效应细胞无法穿透的中枢神经系统固有的防御机制。

另一个新颖的抗癌策略是使用溶瘤病毒治疗。溶瘤细胞的病毒,包括那些天然(如呼肠孤病毒)和那些很容易转基因(单纯疱疹病毒,腺病毒),病毒能够感染,复制,和溶解肿瘤细胞,随后扩散到邻近的细胞( 20.]。理论上,溶瘤病毒有可能消除整个肿瘤。临床前研究表明溶瘤细胞的病毒可以感染和溶解各种恶性肿瘤,包括乳腺癌,其安全性已被证明在临床试验中。至少有三个不同的溶瘤病毒表明潜在的功效在乳腺癌脑转移的模型,包括呼肠孤病毒( 21),脊髓灰质炎病毒( 22转基因,G207,有条件地replication-competent单纯疱疹病毒(HSV) [ 23),建立这种方法的可行性。然而,抗肿瘤功效的溶瘤病毒在一定程度上取决于肿瘤细胞转导的程度后最初的管理。肿瘤是恶性和非恶性的细胞组成的,包括细胞外基质屏障,可以限制瘤内传播,最终这些代理的有效性( 24]。

在此背景下,我们提出一个策略,结合上述方法。在这种情况下,病毒复制的溶瘤细胞的效果增强免疫治疗通过减少肿瘤负荷和释放潜在肿瘤抗原;同样,免疫疗法提高病毒的免疫反应的激活与肿瘤细胞无毒性。之前我们已经描述了一个cytokine-expressing HSV,其中包含删除HSV神经毒性基因的两个副本 γ134.5 [ 25]。这种病毒,指定M002并不在正常细胞中复制,但有效地杀死肿瘤细胞。M002 HSV还携带一个插入基因小鼠interleukin-12 (il - 12),具有额外的抗血管新生属性的促炎细胞因子( 26, 27]。il - 12的生产从而延伸M002未感染细胞的抗肿瘤活性。我们先前已经表明M002可以诱导抗肿瘤免疫反应,显著提高生存在原发性脑瘤的小鼠模型 25, 28, 29日]。然而,这种病毒还没有之前评估作为治疗乳腺癌。我们的假设是,抗肿瘤活性M002并非原发性脑瘤,独有,它将对来自其他组织的肿瘤有效,包括乳腺癌。这个假设是由其他描述溶瘤细胞的病毒已经证明活动的观察与多种肿瘤类型,并通过我们的初步实验结果利用多个肿瘤细胞系。

来测试假设这IL-12-expressing溶瘤细胞的HSV可能适合使用预防乳腺癌病灶转移性中枢神经系统,我们评估人类小鼠乳房癌和乳腺癌细胞系病毒il - 12水平生产,对病毒感染的易感性和瘤细胞溶解,随着时间的推移和病毒传播。此外,一个免疫活性的 在活的有机体内模型开发和治疗效果在这个模型中被检查。这些实验的结果如下:(i)对人类乳腺癌细胞和小鼠乳腺癌有效感染M002时产生il - 12;(2)M002复制强劲的乳腺癌细胞小组代表脑转移和调节直接细胞毒性效应在人类和小鼠细胞;(3)颅内注射SCK细胞可以作为一个适当的和可靠的免疫活性的模型对乳腺癌脑转移;(iv) M002扩展更有效地治疗小鼠的生存比non-cytokine控制病毒或模拟治疗。总的来说,这些结果表明,一个IL-12-expressing γ134.5删除HSV可能是一种有效的治疗与乳腺癌脑转移,并提供进一步检测的基本原理。

 2。材料和方法 2.1。细胞

维洛细胞从美国获得类型文化集合(写明ATCC,罗克维尔市,医学博士,美国),并在基本培养基培养(MEM;Cellgro Mediatech Inc .,美国弗吉尼亚州赫恩登),含7% heat-inactivated胎牛血清(的边后卫;美国Hyclone,洛根,UT)。4 t1小鼠乳腺癌细胞系(来自BALB / c小鼠)写明ATCC的购买。SCK小鼠细胞系被隔离从自发的乳房癌的女性/ J博士提供了鼠标和c·w·歌(明尼苏达大学医学院,明尼阿波利斯,美国)( 30.]。线都是维护在RPMI包含10%的边后卫。人类乳腺癌细胞株mda - mb - 361, mda - mb - 231, zr - 75 - 1, SK-BR-3,写明ATCC和维护和bt - 474获得50:50混合物杜尔贝科的修改鹰介质和火腿的营养混合物F-12 (DMEM / F12)与2.6毫米补充谷酰胺和10%的边后卫。bt - 474细胞是来源于固体浸润性导管癌;它们在形态和上皮在裸小鼠建立结节( 11]。mda - mb - 231是一个腺癌细胞系来自胸腔积液( 15, 31日]。mda - mb - 361细胞腺癌是源自脑部转移( 15, 31日],建立生长缓慢的颅内肿瘤在小鼠由intracarotid注入( 32]。SK-BR-3是腺癌细胞系( 18]。zr - 75 - 1来自一个腹水的积液,浸润性导管癌患者( 19]。所有细胞都维护在康宁plasticware组织文化。

 2.2。病毒

1型单纯疱疹病毒(F)的压力,作为一个原型为所有突变体在这些研究hsv,低段临床孤立,先前描述( 33, 34]。R3659是一个 γ134.5删除病毒也在前面描述的和被用作控制( 35]。M002是一个 γ134.5删除溶瘤细胞的HSV,携带两个副本的小鼠白介素(mIL-12)表达式磁带转录控制下的小鼠早期增长response-1 (EGR-1)启动子,前面描述的 25]。

 2.3。细胞因子的表达

4 t1、SCK和mda - mb - 361细胞被播种在6-well板块4×105细胞感染M002 /好然后在感染复数(MOI) 1点状单位(PFU)每个细胞。在24、48和72 h,上清液是收获。il - 12的浓度的样品被评估使用酶联免疫吸附试验(ELISA)设备特定p70亚基的小鼠白介素(R & D系统,明尼阿波利斯,美国)。盘子和厄尔读x808超微型板块读者(Winooski Bio-Tek仪器公司,VT,美国)。

 2.4。病毒复制

单步和多步进行了病毒复制化验如前所述[ 36]。评估病毒复制一个单步复制试验的效率,乳腺癌细胞小组(mda - mb - 361, mda - mb - 231,锆- 75 - 1、bt - 474和SK-BR-3)在6-well盘子被播种,然后感染1型单纯疱疹病毒(F), R3659或M002 MOI 5微升/细胞。48小时后,亮场显微照片(100 x放大),然后细胞收获并受三轮的冻结/解冻声波降解法。上清液被连续稀释和效价层的维洛细胞。评估病毒复制和传播的效率随着时间的推移,层的维罗,mda - mb - 361, SCK,或4 t1细胞感染1型单纯疱疹病毒(F), M002或R3659 MOI 0.1微升/细胞。细胞收获定期(12、24、48、72和96 h感染后),和子代病毒效价。

 2.5。溶瘤细胞的能力

M002在乳腺癌细胞的溶瘤细胞的能力是评估如下。乳腺癌mda - mb - 361人类和小鼠SCK 4 t1乳房癌的细胞被播种在96 -孔板,然后感染1型单纯疱疹病毒(F)或M002在1到10月微升/细胞。定期感染后(24、48、72和96 h),细胞生存能力评估是由3 - 4,5-dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyl溴化四唑(MTT)试验(σ,圣路易斯,密苏里州,美国),按照制造商的说明。板块与厄尔读x808年超微型板块读者(Bio-Tek仪器Inc .) 570海里(690 nm背景)。

 2.6。肿瘤生存研究

所有动物实验协议是经过仔细审查和批准的伯明翰阿拉巴马大学(UAB)机构的动物保健和使用委员会一直保持认证的评估和认证实验动物保健协会国际(AAALAC)自1971年以来。阿拉巴马大学是美国农业部(USDA)许可的动物研究设施和一个动物福利保障与实验室动物福利办公室的文件。因此,所有协议都是按照美国农业部动物福利法规,以及公共卫生服务政策的人道关怀和使用实验动物和国家研究委员会指导实验室动物保健和使用的。

的颅内注射肿瘤细胞之前已经详细( 37这里简要总结。女/ J小鼠,4 - 6周大,来自国家癌症Institute-Frederick(美国马里兰州弗雷德里克)和允许前至少一个星期适应开始实验。建立颅内肿瘤,与胰蛋白酶SCK细胞收获,水洗,然后resuspended在两个浓度:5%甲基纤维素在MEM 2×106和1×107细胞/毫升。这些细胞被加载到一个250 μL汉密尔顿注射器和保存在冰。小鼠的体重,麻醉与腹腔内注射(IP)的克他命(10毫克/ 100克)/甲苯噻嗪(1.5毫克/ 100克)混合物,和手术部位。八两组小鼠( n = 4 ,每个)然后stereotactically注入正确的尾状核( 36, 38与1×10]4或5×104细胞/ 5 μL,分别和老鼠生存的监控。六(5×10天4队列)和9 (1×104每个队列)post-injection,所有老鼠已经被安乐死了由于出现神经症状,按照机构的指导方针。在福尔马林固定和石蜡包埋,大脑和部分组织10 μ米厚的苏木精和伊红染色组织学分析。

治疗实验,SCK细胞准备在5×105细胞/毫升,然后2.5×103在5 μL stereotactically注入如上所述。四天后,M002或R3659 ( n = 10 每一个;1.5×107空斑形成单位在10 μL)或车辆只( n = 9 ;无菌生理盐水)注射在同一坐标(瘤内),和老鼠生存的监控。在所有生存实验,log-rank kaplan meier情节的比较计算每组是成对的基础上进行的。

 3所示。结果 3.1。乳腺癌细胞感染M002产生il - 12

在开始之前 在活的有机体内研究中,il - 12的验证转基因表达在乳腺癌细胞生理相关水平感染M002是必要的。为此,乳腺癌细胞株mda - mb - 361,原本孤立的从大脑转移,被选为代表人类的研究。此外,两个小鼠乳腺癌细胞系(SCK和4 t1)也化验,因为这些细胞免疫活性的小鼠模型的同系的两个用于我们的实验室(A / J和BALB / c,分别地,)。6-well组织培养的细胞被播种盘,然后感染M002在感染复数(MOI) 0.1和1点状单位(PFU)细胞。定期感染后(24小时、48小时和72小时)培养介质样本收获,然后进行酶联免疫吸附试验(ELISA)具体p70亚基的小鼠il - 12。三行,没有发现内源性il - 12的生产从细胞无毒性。相比之下,被感染的细胞产生了高水平的il - 12在所有三个时间点,生产有轻微趋势最大生产48 h(图 1)。大量的il - 12范围从约100 pg / mL大于1000 pg / mL,从小鼠行获得更高水平。SCK和4 t1细胞,感染的莫伊白介素1产生了大约10倍比感染的莫伊0.1。mda - mb - 361细胞的il - 12水平表达类似的在两个月测试(0.1)。总的来说,这些数据证实,人类小鼠乳房癌和乳腺癌细胞支持白介素感染M002后生产。

从乳腺癌细胞感染M002白介素来生产。4×105人类乳腺癌细胞(mda - mb - 361)或小鼠乳腺细胞癌(SCK 4 t1)感染的莫伊M002 1或0.1微升/细胞。24、48和72 h感染后,媒体是收获和受到的ELISA特定p70小鼠il - 12的亚基。没有检测到未受感染的细胞il - 12。

 3.2。M002复制人类乳腺癌细胞和小鼠乳腺细胞癌

许多研究乳腺癌患者已经确定,以下因素与风险增加有关脑转移(审查这里( 39, 40):年轻的年龄,绝经前状态,浸润性导管癌(IDC)组织学类型、雌激素受体- (ER−)、p53突变和表皮生长因子受体超表达。此外,有很强的关联与HER2 overexpressing和“三重阴性”(ER−孕激素受体阴性,HER2−)肿瘤类型和脑转移 41, 42]。评估M002显示溶瘤细胞的活动是否对乳腺癌脑转移,病毒复制是评估 在体外在人类乳腺癌细胞系代表小组的上述特征(表 1)。在单步复制实验,细胞被镀如上所述,然后感染M002 MOI 5微升/细胞。在感染后48 h,显微照片拍摄,然后细胞和媒体收获并受三轮的冻结/解冻和声波降解法。连续稀释溶解产物被效价层的维罗细胞系宽容。如图 2,所有的细胞系表现出明显的细胞病变效应和生产产生了强劲的子代病毒。在大多数行,复制M002是类似于野生1型单纯疱疹病毒(F),并在1 - 2个数量级的水平控制维洛细胞。这个结果证实 γ134.5删除hsv M002等能够有效地复制在这些乳腺癌细胞系。

关键特性的人类乳腺癌细胞株用于这项研究。几行可以分为多个亚型。ER和PR的表达和放大/超表达HER2的(+)表示。

细胞系 癌症类型 分子亚型 供体的年龄 网站的隔离 受体状态 引用
呃 公关 HER2
bt - 474 国际数据公司(IDC) 腔的A / B 60 原发肿瘤 − + + ( 11- - - - - - 14]
mda - mb - 361 交流 鲁米那一个 40 大脑 + + + ( 12, 13, 15- - - - - - 17]
mda - mb - 231 交流 基底 51 胸腔积液 − − − ( 13- - - - - - 17]
SK-BR-3 交流 腔的B / HER2 43 胸腔积液 − − + ( 12- - - - - - 14, 18]
zr - 75 - 1 直流 鲁米那一个 63年 腹水 + + + ( 12- - - - - - 14, 19]

AC:腺癌,DC:导管癌,呃:雌激素受体,HER2:人类表皮生长因子受体2,IDC:浸润性导管癌,和公关:孕激素受体。

细胞系包括宽容的维洛细胞和小组5人乳腺癌细胞系,mda - mb - 361 (M361)、bt - 474, SK-BR-3 (SKBR), mda - mb - 231 (M231)和zr - 75 - 1 (ZR75)感染M002 MOI 5微升/细胞。(a)亮场显微照片(100 x放大)的病毒细胞病变效应由M002所示的感染细胞与健康细胞无毒性。细胞病理效应由1型单纯疱疹病毒(F)和R3659 M002(未显示)是相同的。(b)复制的野生1型单纯疱疹病毒(F), IL-12-expressing HSV M002或non-cytokine-expressing控制病毒R3659面板的人类乳腺癌细胞在感染后48 h。显示是重复的平均值和标准差决定,从三个实验的代表。

为了进一步分析病毒复制,一个多步复制试验来评估病毒性传播的效率。在这个实验中,复制在mda - mb - 361细胞相比,在SCK和4 t1,以及维洛细胞作为对照。细胞被感染的莫伊0.1,然后子代病毒的效价是超过12、24、48、72和96 h感染后。总的来说,健壮的复制在所有的细胞系,观察到的后代从12 - 48小时浓度迅速增加,然后下降96 h(图 3)。最大浓度达到在感染后48 h细胞系。观察到病毒复制在mda - mb - 361细胞在一个日志在维洛细胞,表明这些细胞也高度宽容HSV复制。类似的复制水平的SCK细胞。相比之下,4 t1细胞抗复制,与后代的最大效价M002小于其他行不止一个日志在感染后48 h。这4 t1的相对阻力线报道了HSV复制他人( 43]。

随着时间的推移M002复制。多步复制化验,HSV复制在以下行:化验的宽容州立细胞系(a),人类乳腺癌mda - mb - 361 (b),和小鼠乳腺癌行SCK (c)和4 t1 (d)。细胞被感染1型单纯疱疹病毒(F)(三角形),R3659(钻石),和M002(盒)0.1微升/细胞的莫伊。在多个时间点,细胞和媒体是收获,病毒复制在维洛细胞单层膜上被滴定化验。

 3.3。在乳腺癌细胞M002展品溶瘤细胞的能力

在乳腺癌细胞的溶瘤细胞的潜力M002评估如下。人类(mda - mb - 361)和小鼠(SCK 4 t1)维罗控制癌症细胞或细胞被播种在多井盘子,然后感染野生1型单纯疱疹病毒(F)或M002用1到10月。细胞生存能力评估通过MTT试验在多个时间点。在控制允许细胞(维罗;未显示),感染M002或1型单纯疱疹病毒(F)野生型菌株细胞生存能力下降大约30%相对于细胞无毒性,24 h, h效果持续到96年。在mda - mb - 361细胞,生存能力在24小时的影响较小,但对这两种病毒,细胞生存能力降低超过50%在48 h(图 4)和96 h拒绝进一步的大约20%。相比之下,SCK细胞表现出小减少可行性48 h,尽管生存能力拒绝不到20%到96年M002-infected井h。依照我们的复制数据,4 t1细胞不容易HSV-mediated细胞毒性。可行性降低只有大约30% (MOI = 10)通过病毒在48 - 72 h和没有进一步减少96 h。总的来说,这些镜像复制的实验结果,表明感染M002乳腺癌细胞直接细胞毒性。

在人类和小鼠肿瘤细胞细胞毒性的M002感染后48 h。盘子的人类乳腺癌细胞mda - mb - 361 (a)或小鼠乳腺癌细胞SCK (b),和4 t1 (c)是表示病毒感染的莫伊1(黑条)或10(灰条)/微升的细胞。在感染后48 h,细胞生存能力被MTT分析化验。显示是一式四份的平均值决定,规范化的未感染的细胞和表达为可行的细胞比例。

 3.4。M002治疗延长生存在一个小说的乳腺癌脑转移模式

建立了从M002乳腺癌细胞支持白介素生产,病毒复制,易受M002-mediated细胞死亡,我们下一个评估潜在的M002作为乳腺癌脑转移的治疗在临床前模型中。M002对原发性脑瘤证明疗效的临床前模型( 25, 28, 29日, 44, 45],但它尚未测试对转移性脑瘤。现有模型的乳腺癌脑转移通常涉及使用转基因或 在活的有机体内通过人类细胞株接种免疫缺陷小鼠( 46, 47]。因为M002表达小鼠il - 12,最高抗肿瘤效应的上下文中只实现一个完整的免疫系统。出于这个原因,我们决定检查的有效性M002免疫活性的小鼠模型。A / J小鼠应变之前已经被我们用来评估M002模型神经母细胞瘤( 25, 29日, 44),从安全角度来说尤其有用,由于灵敏度/ J小鼠的野生型疱疹病毒复制。此外,SCK细胞更类似于人类细胞系的放纵M002复制和细胞死亡。模型脑转移,SCK细胞注射到老鼠的大脑在两个不同剂量(1×104, n = 4 ;5×104, n = 4 ),老鼠生存的监控。我们观察颅内肿瘤的快速增长 在活的有机体内,要求给予高剂量的小鼠的euthanization post-injection 6天,考虑到低剂量的post-injection 9天。老鼠的大脑收获和组织学检查。如图 5一般,肿瘤是相对较好的限制。遥远的瘤巢,特别是心室,经常被提到。这些巢往往更侵入大脑实质比的主要肿瘤。这些肿瘤与出血有关,表明肿瘤脉管系统的“泄漏”。

发展的免疫活性的颅内的乳腺癌脑转移模式。女性在两组/ J小鼠( n = 4 ,每个)颅内注射1×104或5×104细胞/ 5 μ6 (5×10 l .由天4队列)和9 (1×104每个队列)post-injection,所有老鼠已经被安乐死了由于出现神经症状。大脑被收割的组织学检查。显示是苏木精和eosin-stained部分代表性的标本。注意的巨大肿瘤注射部位在第一个面板中(40 x放大)与出血有关。Insets (400 x)显示了相对较好的限制边界的主要肿瘤(a)和遥远的更多侵入性肿瘤巢(b)。

建立了一个免疫活性的,乳腺癌脑转移的颅内模型,然后使用该模型的评估M002功效 在活的有机体内。颅内肿瘤的SCK细胞建立在/ J小鼠以前,虽然使用低剂量(2.5×103)。四天之后,肿瘤注射1.5×107空斑形成单位的M002 ( n = 10 )或R3659 ( n = 10 用无菌盐水),或者只( n = 9 )作为控制。然后监测小鼠神经症状,此时他们安乐死。小鼠给予生理盐水只表现出一个值(图10天的生存 6)。通过log-rank分析,R3659和M002-treated治疗小鼠存活的时间大大超过mock-treated老鼠,平均生存时间12天(R3659, P = 0.0004 )和13.5 (M002 P = 0.0012 )天。此外,M002-treated小鼠存活超过R3659-treated老鼠( P = 0.0333 )。两只老鼠对待M002存活了16天,或60%超过中位数生存mock-treated展出的老鼠。这些结果在一个原理实验表明,M002治疗可以延长生存在一个乳腺癌脑转移的免疫活性的模型。

kaplan meier块M002抗肿瘤效应 在活的有机体内对颅内SCK肿瘤。肿瘤治疗四天后建立以1.5×107空斑形成单位的R3659 M002或只被给予生理盐水作为对照。通过log-rank分析R3659 - ( P = 0.0004 )和M002-treated老鼠( P = 0.0012 )幸存下来的时间大大超过mock-treated老鼠,M002-treated老鼠比R3659-treated小鼠存活时间( P = 0.0333 )。平均生存时间(mst)表示。

 4所示。讨论

在本文中,我们目前的概念验证的数据支持使用IL-12-expressing溶瘤细胞的HSV小说作为治疗乳腺癌脑转移。我们演示了一些要点。首先,我们已经证实在人类乳腺癌和小鼠乳房癌的细胞感染M002产生il - 12在生理水平。接下来,我们已经表明,各种各样的乳腺癌细胞系支持强大的复制 γ134.5删除病毒如M002,虽然复制小鼠肿瘤细胞检查更为有限。我们还表明,这些病毒调解直接对乳腺癌细胞细胞毒性的影响。最后,我们已经描述了一个乳腺癌脑转移和免疫活性的模型表明,M002改善对待动物的生存在更大程度上比复制,non-IL-12-expressing控制病毒在这个模型。

我们观察到健壮的il - 12的生产,以ELISA,在所有三个细胞系的化验。从小鼠获得水平细胞(SCK 4 t1),一般来说,从人类获得10倍高于mda - mb - 361细胞。我们推测,这可能是人类细胞中细胞死亡的结果,这条线是更容易M002复制比鼠线。快速mda - mb - 361细胞的瘤细胞溶解可能因此妨碍了构建高水平的il - 12的生产。或者,EGR-1启动子可以用来驱动的表达il - 12转基因小鼠行可能有更高的活动和人类的线,我们的非正式的观察表明,SCK和4 t1线路增殖更迅速比mda - mb - 361线。尽管如此,我们已经证实,乳腺癌细胞支持从M002白介素来生产。il - 12的数量,我们观察到的是在先前发表的研究类似M002在神经母细胞瘤( 25和神经胶质瘤 28细胞系。

我们还展示了强劲的病毒复制 γ134.5删除病毒M002面板的人类乳腺癌细胞系。这个小组被选为代表的一些关键风险因素与脑转移有关,如年轻、浸润性导管癌类型、HER2过度,“三阴受体状态。”此外,除了正常的像,每个主要的乳腺癌分子亚型在这些研究中表示出来。虽然在单个细胞线获得的结果未必是反映整个亚型,我们没有观察到任何复制效率和亚型之间的相关性,表明M002可能有效预防乳腺癌类型的范围,而脑转移不可能抵抗溶瘤细胞的HSV复制。的注意,在每一个单步执行复制实验,mda - mb - 231行中不断产生浓度最高,表明官腔/三阴性乳腺癌,尤其对常规疗法,相对宽松的溶瘤细胞的HSV复制。

在这些研究过程中,我们已经开发出一种可靠的、可再生的、肤浅的乳腺癌脑转移模式。建立脑瘤SCK细胞直接注入到老鼠的大脑,据我们所知,没有被报道。从原发肿瘤脑转移的播种仍是一个理想的模型,因为这将是更多的生理相关肿瘤分布和概括转移级联的所有步骤。然而,实际问题限制了该方法的可行性。SCK肿瘤转移 在活的有机体内建立脑转移的倾向,但他们还没有为特征。同时,考虑到当前的限制系统性的溶瘤细胞的病毒,直接颅内植入肿瘤细胞仍然是一个简单而可靠的方法生成肿瘤在大脑已知位置评价溶瘤细胞的病毒 原位。此外,这种方法独立于潜在的混杂变量参与血管内病毒交付,如补绑定,病毒的中和抗体反应,或者非特异性的封存不属预定目标的组织。尽管如此,乳腺癌脑转移通常呈现为一个离散的病变(1 - 5)真皮及边界,这是访问手术( 48)或提供目标明确的立体定向放射治疗( 49),因此潜在的直接接种瘤内临床存在。

在治疗的实验中,我们已经表明,一个注入M002延长小鼠的生存mock-treated老鼠,和更有效地这样做比non-cytokine控制病毒。这一发现是在协议与我们先前的研究原发性脑瘤,尤其值得注意考虑模型的攻击性。虽然治疗M002延长小鼠的生存,这里使用的单剂量不足以根除产生肿瘤。组织学检查确诊的治疗小鼠肿瘤的持续增长是所有三个治疗组的死因。这里描述的SCK模型M002评估有一定的优势,即放任对HSV复制和真皮及脑瘤的建立 在活的有机体内。然而,这个模型的侵略性和发病率的快速出现在肿瘤小鼠是关键的缺点。我们推测,这个模型的短时间内阻止更大的被M002介导的抗肿瘤效果,因为之前的研究表明,治疗M002刺激免疫细胞的大量涌入包括CD4 +和CD8 + T细胞,巨噬细胞和NK细胞,山峰post-injection病毒(6 - 7天 25, 28生存中值附近),观察到在这个模型。可能早治疗或低输入剂量的细胞会允许更大的抗肿瘤效应。虽然我们所示本原理实验M002改善生存更有效地比non-IL-12溶瘤细胞的HSV,额外的测试来阐明的各种抗肿瘤机制(即。,病毒瘤细胞溶解、免疫细胞浸润或抗血管)主要负责改善生存在这个模型将是有价值的。

溶瘤细胞的病毒预防乳腺癌的潜在效用使用病毒系统,建立了包括HSV ( 50, 51]。然而,只有数量有限的研究已经发表的关于使用溶瘤细胞的hsv预防乳腺癌脑转移( 23, 52, 53]。其中包括一项研究中,一个IL-12-expressing突变HSV没有改善生存在一个免疫活性的模型,控制病毒( 52),尽管不同的病毒或模型系统采用之间的差异可以解释这项研究,我们的研究结果。

 5。结论

乳腺癌脑转移的临床问题是不断增加的意义之一,并为这些病变迫切需要有效的治疗方法。在这里,我们提供理由IL-12-expressing的进一步的研究 γ134.5删除HSV作为治疗乳腺癌脑转移。我们已经证明,一个IL-12-expressing γ134.5删除HSV有效地复制在乳腺癌细胞小组代表脑转移和乳腺癌细胞产生生理上的感染相关的il - 12水平。治疗颅内肿瘤的这种病毒在乳腺癌脑转移的免疫活性的模型比治疗更有效地提高生存non-cytokine控制病毒。因此,我们得出这样的结论:一个IL-12-expressing γ134.5删除病毒可能是一种有效的新的治疗这种疾病,并进一步测试是必要的。出于实际的原因,本研究进行了HSV表达小鼠白介素,类似的病毒表达人类白介素已经由我们的研究小组,和这种病毒在胶质母细胞瘤患者临床试验计划。因此,可能存在,这种病毒也可以用于乳腺癌的审判。

 确认

这项工作是支持的一个试点项目授予UAB的乳腺癌的孢子(P50 CA089019,温和KI,π)。作者也希望承认支持从一个国家卫生研究院NCI格兰特(P01 CA 071933;惠特利、RJπ)和培训项目在脑部肿瘤生物学(T32NS048039 Benveniste,恩,π)。

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