6周大的雄性C57BL / 6小鼠(在18到22岁的g)购买动物中心的医学研究所,军事科学院(中国,北京)。自由的老鼠在SPF实验室在光明与黑暗的12小时的循环。实验过程都是按照动物管理规定执行中国卫生部和我们医院医学伦理委员会批准。研究结束后,所有的动物都是由戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(80毫克/公斤),然后牺牲颈椎错位。

成立于UC模型小鼠喂食3% ( w / v 美国圣安娜)DSS (MP生物医学)每2天1周。老鼠在对照组有同等体积的生理盐水( N = 20. )。UC小鼠被分为两组:DSS集团和DSS + JWSYD集团( N = 20. 每组)。UC小鼠DSS + JWSYD组与JWSYD美联储(22克/公斤)每天1周。JWSYD得到的中医医院,和浓度是由我们的实验经历(22克/公斤没有毒性小鼠)。UC小鼠DSS组喂养同等体积的生理盐水。体重、疾病活动指数(DAI),结肠长度、和脾脏重量记录。结肠组织在液态氮冷冻,用于后续实验。

结肠组织在5%福尔马林固定,脱水和嵌入在蜡,然后在5 μm和苏木精和伊红染色(他)。部分是一个可选的显微镜下观察(奥林巴斯CKX53、东京、日本)。组织病理学评分是根据评估报告的评分系统Rachmilewitz et al。 18]。

小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7细胞# TCM13)从细胞中心购买上海(上海,中国)。rpmi - 1640年RAW264.7细胞培养介质(美国大岛屿Gibco)与10%的边后卫(Gibco)和1%链霉素/青霉素(Gibco) 37°C公司为5%₂。细胞被分为三组:模拟组,LPS组和JWSYD + LPS组。细胞有限合伙人和有限合伙人(2组治疗 μ为4 h g / ml)。细胞JWSYD +有限合伙人和有限合伙人(2组治疗 μg / ml)和JWSYD(8毫克/毫升)4 h。没有治疗被认为是模拟组细胞。

的组织/细胞总RNA提取试剂盒(美国卡尔斯巴德表达载体)。互补脱氧核糖核酸合成的reverse-transcribed工具包(转基因,北京)。然后,存在由SYBR rt - pcr试剂盒(豆类,北京)LightCycler®480(罗氏、巴塞尔、瑞士)下列条件:最初的10分钟在95°C,紧随其后的是40 95°C的周期10年代,60°C 20 s, 72°C 34 s。GAPDH是作为内部控制。使用2相对表达式计算^{− ΔΔCT}方法。本研究中使用的引物序列如下:il - 6(前锋):5 ′ -TACCACTTCACAAGTCGGAGGC-3 ′ ,il - 6(反向):5 ′ -CTGCAAGTGCATCATCGTTGTTC-3 ′ ;il - 1 β(前锋):5 ′ -TTGTTGATGTGCTGCTGTGA-3 ′ ,il - 1 β(反向):5 ′ -TGTGAAATGCCACCTTTTGA-3 ′ ;肿瘤坏死因子- α(前锋):5 ′ -GGTCTGGGCCATAGAACTGA-3 ′ 肿瘤坏死因子- α(反向):5 ′ -CAGCCTCTTCTATTCCTGC-3 ′ ;和GAPDH(前锋):5 ′ -AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3 ′ GAPDH(反向):5 ′ -TGTAGACCATGTAGTTGAGTCA-3 ′ 。

组织和细胞的蛋白质提取•瑞帕裂解缓冲和sds - page分离。随后,蛋白质被转移到PVDF膜和孵化主要抗体(GAPDH、NLRP3 caspase-1裂解,箴caspase-1,裂解il - 1 β导出, κB α,我 κB αp-NF - κB p65, NF - κ中科B p65(1: 1000年,波士顿,美国)和ASC1 (Abcam 1: 1000年,剑桥,美国))在一夜之间在4°C。膜被孵化与辣根peroxidase-conjugated二级抗体(anti-rabbit免疫球蛋白g, 1: 10000年,σ,圣路易斯,美国)1 h。最后,乐队的蛋白质检测的ECL装备和量化的使用数量一个一维分析软件(美国大力神Bio-Rad)。

肿瘤坏死因子-的浓度 α,il - 1 β和血清中il - 6和细胞上清液检测到使用特定ELISA试剂盒(热费希尔)。吸光度是衡量标(BioTek时代2日,佛蒙特州,美国)。

美国GraphPad棱镜6软件(La Jolla)和SPSS 22.0统计软件(美国芝加哥)是采用统计分析。数据了 的意思是 ± 标准 偏差 。两组之间的差异被学生的分析 t 以及。多个组之间的差异是由单向方差分析图基的事后测试紧随其后。所有数据被重复三次。 P < 0.05 被认为是明显不同的。

JWSYD DSS-induced UC是评估的影响在老鼠身上。体重下降,戴得分增加DSS组与对照组相比 P < 0.01 )。与JWSYD接受治疗后,体重明显增加,戴得分下降( P < 0.05 )(数据 1(一)和 1 (b))。同时,结肠的长度短,脾脏的重量更大的DSS组比对照组( P < 0.01 )。JWSYD有明显保护影响结肠缩短和脾肿大( P < 0.05 )(数据 1 (c)和 1 (d))。如图 1 (e),他透露,DSS组的组织病理学评分与对照组相比显著增加,而JWSYD组织病理学评分明显降低( P < 0.05 )。上述数据表明,JWSYD可以保护DSS-induced加州大学。

在小鼠的血清炎性细胞因子的水平被ELISA检测。如数据所示 2(一个)- - - - - - 2 (c),肿瘤坏死因子的水平 α,il - 1 β,il - 6在DSS组明显高于对照组( P < 0.01 )。肿瘤坏死因子的水平 α,il - 1 β,il - 6在DSS + JWSYD组明显低于DSS集团( P < 0.01 )。我们进一步探讨TNF -的mRNA水平 α,il - 1 β使用中存在,在结肠组织中il - 6。与血清水平的数据一致,TNF -的mrna水平 α,il - 1 β,il - 6在DSS + JWSYD组显著下降与DSS集团( P < 0.01 )(数据 2 (d)- - - - - - 2 (f))。这些结果表明,JWSYD可以减少炎性细胞因子在DSS-induced加州大学的水平。

蛋白质的表达NLRP3 inflammasome-associated被免疫印迹检测。NLRP3的蛋白质含量,ASC1、Procaspase-1 caspase-1裂解,裂解和il - 1 βDSS组显著增加( P < 0.01 )。JWSYD减少上述蛋白的水平与DSS组( P < 0.01 )(图 3)。这些数据表明,JWSYD可以抑制NLRP3 inflammasome DSS-induced加州大学。

我们选择LPS-induced RAW264.7细胞进一步探索JWSYD的影响 在体外。与模拟组相比,相对蛋白质含量NLRP3, ASC1, caspase-1裂解,裂解il - 1 β,Procaspase-1有限合伙人+ ATP组明显升高( P < 0.01 )。JWSYD显著减少上述因素的蛋白质含量在有限合伙人+ ATP + JWSYD组相比,有限合伙人+ ATP组( P < 0.01 )(图 4(一))。同样,ELISA结果显示JWSYD显著降低LPS-induced分泌TNF - α,il - 1 β和RAW264.7细胞上清液中il - 6 ( P < 0.01 )(数据 4 (b)- - - - - - 4 (d))。

免疫印迹显示p-NF的蛋白质含量 κB p65和导出 κB α在DSS组高于对照组( P < 0.01 )。p-NF——的蛋白质含量 κB p65和导出 κB αDSS + JWSYD组明显减少与DSS组( P < 0.01 )。蛋白质含量没有显著差异的NF - κ我和B p65 κB α在每组( P > 0.05 )(图 5(一个))。同样,p-NF的蛋白质含量 κB p65和导出 κB α在有限合伙人+ ATP组相比明显增加与模拟。JWSYD减少LPS-induced upregulation p-NF - κB p65和导出 κB α有限合伙人+ ATP + JWSYD组相比,有限合伙人+ ATP组( P < 0.01 )(图 5 (b))。上述数据表明,JWSYD可以抑制NF - κB通路DSS-induced加州大学和LPS-stimulated RAW264.7细胞。