GRP 胃肠病学研究和实践 1687 - 630 x 1687 - 6121 Hindawi出版公司 10.1155 / 2016/9638963 9638963 研究文章 脱氧胆酸能诱导细胞凋亡并引发胃致癌作用于胃上皮细胞定量蛋白质组学分析 http://orcid.org/0000 - 0003 - 0247 - 371 x 史 Yanyan 1 魏 应 2 http://orcid.org/0000 - 0002 - 2862 - 7644 张 停 3 张 京 2 王 叶 2 http://orcid.org/0000 - 0002 - 0831 - 0965 丁 石岗 2 风扇 达因 1 临床流行病学研究中心 北京大学第三医院 北京100191年 中国 puh3.net.cn 2 美国胃肠病学 北京大学第三医院 北京100191年 中国 puh3.net.cn 3 微生物学系 北京大学健康科学中心 北京100191年 中国 bjmu.edu.cn 2016年 14 12 2016年 2016年 02 08年 2016年 10 10 2016年 23 10 2016年 2016年 版权©2016 Yanyan史等。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

背景。病理duodenogastric回流可以诱发或加重胃炎由于胆汁酸的存在。胆汁返流通常被认为与肠上皮化生和胃癌。然而,致病机制的胆汁酸对胃黏膜的影响仍然未知。<我t一个lic> 方法。探索胆汁酸诱发胃粘膜病变的机制,我们研究了细胞凋亡在胃上皮细胞行GES-1和调查GES-1细胞的蛋白质变化资料的胆汁酸脱氧胆酸用蛋白质组学方法。更改配置文件的不同表达的蛋白质进行了分析使用大卫和字符串的程序。<我t一个lic> 结果。我们发现细胞凋亡显著诱导GES-1细胞脱氧胆酸。使用液相色谱/串联质谱(质/ MS)的方法,调节蛋白质的134和214下调蛋白质识别在胆汁酸GES-1细胞治疗。生物信息学分析发现这些差异表达蛋白质的相互作用和信号网络。<我t一个lic> 结论。这些发现可能会改善致病性的分子机制的理解胆汁酸在胃粘膜上。

 北京重点实验室 BZ0371 中国国家自然科学基金 81270475 1。介绍

胆汁返流是一种病理生理过程的主要病因因素导致慢性胃炎患者胃粘膜病变( 1]。胆汁返流性胃炎(BRG)已经被公认是一个化学胃病由于过度duodenogastric反胃。生理duodenogastric refluxate不包含胆汁酸但只包含<我nline-formula> H C O 3 - - - - - - IgA,可能对胃黏膜保护功能 2]。然而,病理duodenogastric回流可以由许多因素,如幽门解剖结构异常和antropyloric十二指肠蠕动障碍与连续胆汁酸分泌。病理duodenogastric回流可以诱发或加重胃炎由于胆汁酸的存在,和高胆汁酸的浓度可能发挥关键作用的诱导肠上皮化生(IM)的腹部。此外,胆汁返流也认为函数作为发起者胃致癌作用[ 3]。

一些研究发现,胆汁酸和其他十二指肠内容发展的协同作用与胃酸和慢性胃炎<我t一个lic> 幽门螺杆菌感染( 4, 5]。细胞凋亡和氧化还原反应与胆汁段有关胃炎已报告( 6, 7]。胆汁返流引起的胃化生胃adenocarcinomal被认为是一种癌前病变,与感应cyclooxygenase-2 (cox - 2)。然而,胆汁酸的具体致病机制影响胃粘膜仍不清楚。

在这项研究中,我们评估的影响胆汁酸脱氧胆酸在胃上皮细胞行GES-1,和蛋白质组学分析用来确定脱氧胆酸的生物过程和分子途径发挥其对胃粘膜致病性的影响。

 2。材料和方法 2.1。细胞、培养条件和脱氧胆酸治疗

GES-1细胞和AGS细胞都在RPMI1640培养生长培养基补充10% (v / v)胎牛血清(美国Hyclone,洛根,UT) 37°C湿润孵化器在5% (v / v)有限公司2。10毫米脱氧胆酸(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)股票在PBS溶液制备,孵化在37°C水浴每次使用前30分钟。

细胞被播种在生长介质的前一天脱氧胆酸治疗。coculturing细胞和脱氧胆酸,细胞与PBS冲洗一次新鲜的生长介质之前补充道。浓度的200<我t一个lic> μ米和400<我t一个lic> μ米的脱氧胆酸用于初步实验(补充图所示在网上补充材料 http://dx.doi.org/10.1155/2016/9638963),400年<我t一个lic> μ米被选在以下研究。脱氧胆酸添加到单元格中400年的最终浓度<我t一个lic> μM,细胞维持正常生长条件下10 h。未经处理的GES-1细胞被用作控制。

 2.2。细胞凋亡检测

GES-1细胞和AGS细胞都播种在6-well板(1.2×10的密度5细胞)。孵化后的细胞有或没有脱氧胆酸10 h,一个膜联蛋白V-FITC /πdouble-staining凋亡检测工具(美国新泽西州,正欲富兰克林湖)是用来标记细胞根据制造商的指示。未经处理的GES-1细胞被用作消极的控制。细胞被洗冷PBS和200<我t一个lic> μL的膜联蛋白V-Binding缓冲了。细胞被染色后10<我t一个lic> μL (FITC-labeled膜联蛋白V和5<我t一个lic> μL(π,他们立即通过流式细胞术分析。

 2.3。蛋白质的提取和sds - page

GES-1细胞培养有或没有脱氧胆酸是收获。蛋白质提取,细胞悬浮在细胞裂解缓冲含有蛋白酶抑制剂混合物和动摇在冰上30分钟。细胞溶解产物是离心机在4°C 15000×g 10分钟,和上层的收集。布拉德福德的总蛋白浓度测定方法采用BCA蛋白质化验设备(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。蛋白质(200<我t一个lic> μg) 15% (w / v) sds - page分离。凝胶被沾染了考马斯亮蓝g - 250(美国Bio-Rad实验室、大力神、CA)检查差异GES-1细胞的总蛋白,没有脱氧胆酸。

 2.4。NanoLC-MS /女士和数据分析

在这项研究中,一个非常特殊的和敏感的液相色谱/串联质谱(质/ MS)方法用于识别不同的表达蛋白质有或没有GES-1细胞培养中胆汁酸。凝胶被分成15等份根据蛋白质的分子量。然后用胰蛋白酶消化,蛋白质肽应用于EASY-nLC系统(Proxeon生物系统,热费希尔科学)耦合网络的ESI-LTQ-OrbitrapVelos质谱仪(热费希尔科学)主要是如前所述 8]。肽筛选了通过一个陷阱列和一个分析列挤满了C-18 ReproSil 3<我t一个lic> μm树脂使用梯度从100%阶段(0.1%甲酸水)35%阶段B(0.1%甲酸乙腈)为150分钟。质谱中获得积极的模式使用视自动扫描女士(DDA)调查和串联质谱(MS / MS)收购。推动世界贸易组织多哈回合谈判达成具有调查扫描的<我t一个lic> m / z范围350 - 2000和60000号决议的目标值1×10−6离子。调查扫描之后,MS / MS的15个最强烈的离子LTQ使用collision-induced离解(CID),和以前分散离子对30年代动态被排除在外。原始数据是对使用MaxQuant Swiss-Prot人类蛋白质组数据库搜索软件(版本1.2.2.5)。搜索进行以下参数:胰蛋白酶水解、两个错过了分裂,氧化的蛋氨酸变量修改,carbamidomethylation固定的修改,和肽10 ppm的宽容。搜索结果随后被加工/过滤搜索引擎处理器工具( 9使用1%错误发现率(罗斯福)。

确定蛋白质被爆炸搜索与NCBI nonredundant数据库。本体论分析差异表达的蛋白质进行了使用搜索工具大卫( http://david.abcc.ncifcrf.gov/)。字符串( http://string.embl.de)被用作预测信号网络数据库和蛋白质相互作用(如前所述)( 10]。

 2.5。免疫印迹分析

蛋白质样品的两组进行免疫印迹验证差异表达蛋白质。蛋白质提取,细胞悬浮在细胞裂解缓冲含有蛋白酶抑制剂混合物和动摇在冰上30分钟。细胞溶解产物在4°C离心机15000×克10分钟,和上层的收集。布拉德福德的总蛋白浓度测定方法采用BCA蛋白质化验设备。蛋白(70毫克)分离为12% (w / v) sds - page凝胶和electrophoretically转移到PVDF膜。膜被封锁在5% (w / v)无脂牛奶Tris-buffered盐水,0.5% (v / v) Tween-20,室温下1 h和孵化一夜之间在4°C抗体SOS1 (Flarebio,中国;1:500),PTK2 (Flarebio;1:500),ATP12P (Flarebio;1:500),H2AFY (Flarebio;1:500)和<我t一个lic> α微管蛋白(MBL、日本;1:2000)。在PBS补充三个洗后0.1% (v / v) Tween-20 15分钟,与二次抗体膜被孵化,山羊anti-Rabbit IRDye 680或山羊anti-Mouse IRDye 800连续波(LICOR;1:5000),在室温下1 h。蛋白质被扫描识别膜使用的奥德赛成像仪(LI-COR生物科学)。

 2.6。统计分析

两组之间的差异进行了分析使用学生的<我t一个lic> t以及。提出了数据的平均数±标准差三个独立的实验。所有使用SPSS 21.0软件进行统计分析。<我nline-formula> P 值< 0.05被认为是具有统计学意义。

 3所示。结果 3.1。脱氧胆酸在GES-1细胞诱导细胞凋亡

细胞凋亡检测工具被用来检测400诱导细胞凋亡<我t一个lic> μ米决赛GES-1细胞中脱氧胆酸的浓度。结果(图 1(一)在GES-1)表示,脱氧胆酸诱导细胞凋亡细胞(<我nline-formula> P < 0.05 )。AGS细胞以相同的方式GES-1细胞(图 1 (b))。

膜联蛋白(a)代表实验V-FITC /πdouble-staining GES-1细胞治疗10 h。膜联蛋白V阳性细胞的比例(AV +:凋亡细胞)的控制和治疗组,分别为10.25%和73.11%。(b)的代表性的实验膜联蛋白V-FITC /πdouble-staining AGS细胞治疗10 h。膜联蛋白V阳性细胞的比例控制和治疗组,分别为4.54%和34.9%。提出了数据的平均数±标准差三个独立的实验。<我nline-formula> W h e n ∗ 与对照组相比,<我nline-formula> P 值< 0.05被认为是具有统计学意义。

 3.2。蛋白质纯化和鉴定

GES-1细胞的蛋白质组分析使用sds - page和考马斯亮蓝染色法和质/女士。如果蛋白质的比例是2.0 >或< 0.5细胞治疗胆汁酸相对于负控制细胞,被认为是差异表达的蛋白质。总共348个差异表达的蛋白质,包括214年下调蛋白质和134年调节蛋白(补充数据所示)。14种不同蛋白质的比率是5.0 >或< 0.2,包括6个表达下调蛋白质(表 1(表8)和调节蛋白质 2),这表明它们是高度管制和特别感兴趣的。

表达下调蛋白质GES-1细胞脱氧胆酸处理(比< 0.2)。

数量 蛋白质的名字 R 一个 t 我 o ∗ p<我t一个lic> 我 名义上的质量 蛋白质功能
1 组蛋白核心macro-H2A.1 0.176 9.8 39617年 扮演着中心角色在转录调控、DNA修复DNA复制,染色体的稳定性
2 Cytospin-B 0.126 6.29 118585年 不清楚
3 CREB-regulated转录coactivator-3 0.133 6.35 66959年 CREB1转录辅激活,激活转录通过共识和变体营地响应元件(CRE)网站
4 bcl - 2拮抗剂的细胞死亡 0.196 6.6 18392年 促进细胞死亡和成功争夺绑定Bcl-X (L)、bcl - 2,和Bcl-W,从而影响这些蛋白质的heterodimerization伯灵顿
5 Vacuolar-sorting蛋白质SNF8 0.139 6.2 28864年 运输所需组件endosomal排序的复杂II (ESCRT-II),这需要多泡体(多功能车辆总线)的形成和分类endosomal货物蛋白质成多功能车辆总线
6 E3 ubiquitin-protein连接酶UHRF1 0.169 7.66 89813年 多区域蛋白作为关键后生调节器通过桥接DNA甲基化和染色质的修改

R 一个 t 我 o ∗ 特定值的细胞内蛋白质的表达强度有或没有脱氧胆酸治疗。

调节蛋白质GES-1细胞脱氧胆酸处理(比率> 5)。

数量 蛋白质的名字 R 一个 t 我 o ∗ p<我t一个lic> 我 名义上的质量 蛋白质功能
1 细胞周期控制蛋白质50 5.917 8.81 40683年 不清楚
2 UPF0428蛋白质CXorf56 11.628 8.94 25624年 不清楚
3 ATP合酶线粒体F1复杂装配因素2 7.092 6.62 32772年 可能发挥作用在F1的装配组件的线粒体ATP合酶(ATP酶)
4 snRNA-activating蛋白质复合体亚基4 8.547 8.51 159432年 所需的一部分SNAPc复杂的转录RNA聚合酶II和RNA聚合酶III小型核基因
5 N-chimaerin 6.098 6.51 53172年 GTPase-activating p21-rac和佛波醇酯受体蛋白质,参与神经运动回路的装配在轴突引导EPHA4的直接效应
6 的儿子sevenless同族体1 5.155 6.38 152464年 三磷酸鸟苷促进交换Ras-bound GDP,催化的三聚物的复杂组件参与信号转导从Ras Rac通过促进Rac-specific鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)活动
7 粘着斑激酶1 5.952 6.19 119233年 Nonreceptor酪氨酸蛋白激酶中扮演着重要的角色在调节细胞迁移、粘附、蔓延,肌动蛋白细胞骨架重组,焦的形成和分解粘连和细胞突起,细胞周期进展,细胞增殖和细胞凋亡
8 蛋白质运输Sec61α亚基同种型1 7.143 8.3 52264年 起着关键作用的分泌和膜多肽插入ER

R 一个 t 我 o ∗ 特定值的细胞内蛋白质的表达强度有或没有脱氧胆酸治疗。

 3.3。聚类分析的胆汁Acid-Regulated蛋白质

热图是由348年获得的数据差异表达蛋白质。差异表达蛋白的聚类分析胆汁酸洗细胞提供了证据表明基因编码这些蛋白质是由脱氧胆酸(图 2)。

348年特异表达蛋白质的表达水平一个热图所示。红色的集群代表调节蛋白质和才集群代表表达下调的蛋白质。

 3.4。功能分类和浓缩的胆汁Acid-Regulated蛋白质

识别差异表达的蛋白质功能分类如图 3,参与蛋白质磷酸化和乙酰化作用是比例最高的。更有趣的是,研究表明,线粒体蛋白质占大约6%的蛋白质,这可能在细胞凋亡中发挥作用。进一步阐明生物过程受胆汁酸,这些特异表达蛋白质注释为富集分析大卫数据库在生物过程方面,细胞组件,和分子功能(图 4)。

特异表达蛋白的功能类别所示一个馅饼。这表明磷蛋白质和乙酰化蛋白质贡献最特异表达蛋白质的比例。

348年根据基因本体术语特异表达蛋白进行了分析。所有的特异表达蛋白进行了分析通过搜索大卫数据库,<我nline-formula> P < 0.05 。直方图显示前10项分子功能,细胞成分和生物过程。

 3.5。分析信号的网络

胆汁酸治疗后差异表达蛋白然后对字符串搜索数据库,和341年蛋白质数据库中匹配。选择置信度得分(字符串)是0.4。合并后的网络图所示 5。实质性的重要功能蛋白质网络的RNA绑定,核糖体的结构组成、核酸绑定和蛋白激酶监管机构的活动。ACIN1、AKAP17A Clorf52, CID重要的RNA结合蛋白和核酸绑定。MRPL10、MRPL16 MRPL17是核糖体的重要蛋白质的结构组成。ANKRD54、CALM2 CDKN2A是重要的蛋白激酶监管机构活动的蛋白质。程序预测关联特定组蛋白。

差异表达的蛋白质被用来搜索字符串数据库来预测蛋白质相互作用的细胞脱氧胆酸治疗。在网络中,节点是蛋白质和线表示预测的功能关联。的行数表示的强度预测功能的蛋白质的相互作用。

 3.6。验证四个鉴定蛋白质

支持以上结果,进行免疫印迹分析监测水平的变化四个确定蛋白质与DNA修复和细胞周期(图 6)。与消极控制相比,组蛋白macro-H2A核心。1(H2AFY) was downregulated after being treated by deoxycholic acid. Son of sevenless homolog 1 (SOS1), focal adhesion kinase 1 (PTK2), and ATP synthase mitochondrial F1 complex assembly factor 2 (ATP12P) were upregulated. These were consistent with the results of quantitative proteomic analysis.

蛋白表达分析四个关键蛋白质包括SOS1 PTK2, ATP12P, H2AFY GES-1细胞免疫印迹。GES-1细胞与脱氧胆酸治疗。免疫印迹分析使用的提取细胞脱氧胆酸处理。<我t一个lic> α微管蛋白是作为内生参考。

 4所示。讨论

之间有一个强大的协会中胆汁酸的浓度duodenogastric refluxate和胃食管反流病(GERD)的程度和胆汁反流的一个主要风险因素巴雷特食管( 11, 12]。胆汁酸暴露会加剧胃粘膜病变如活性或慢性炎症引起的。此外,胆汁酸接触的时间长度与病变的严重程度在胃粘膜 1]。此外,胆汁酸直接诱发肠上皮化生和食道和胃肿瘤的进展 5, 13, 14]。

尽管胆汁酸被认为是胃粘膜疾病的发病机理的关键,胆汁酸的机制诱导转换在胃里仍不清楚( 15]。与胃黏膜的研究相比,有更多的研究集中在胆汁酸引起的食管粘膜疾病的机制。最近的研究表明,免疫反应和/或信号通路调节细胞增殖和细胞表型可能导致损坏、化生的食管上皮细胞( 16]。在体外/体外研究中,胆汁酸刺激食管细胞产生炎症介质(例如,引发和cox - 2)和导致氧化应激,DNA损伤和细胞凋亡。胆汁酸也诱发鳞状细胞改变他们的基因表达模式类似于肠胃型细胞和巴雷特引起的细胞增加肠胃型基因的表达( 17]。然而,在胃粘膜,有腺上皮细胞,与食管黏膜鳞状细胞不同。

是否发病机制的胆汁酸在胃里一样在食管尚未得到证实。胆汁酸引起的胃细胞死亡的机制仍有争议。在这项研究中,我们使用人类胃粘膜细胞的蛋白质组学分析线治疗胆汁酸脱氧胆酸调查机制。据报道,脱氧胆酸总胆汁酸的约27%。主要是免费的中级和初级胆汁酸的存在可能导致癌症的高发病率Billroth操作后的胃残余观察和胆汁返流的存在 18]。非结合的胆汁酸脱氧胆酸和鹅去氧胆酸能显著影响食管细胞在巴雷特食管的发展,尤其是脱氧胆酸( 19]。一些研究人员使用脱氧胆酸建立慢性胃炎动物模型( 20.]。这可能表明脱氧胆酸是一种最细胞毒性胆汁酸,以前研究胆汁胆汁酸。基于这种考虑,我们使用脱氧胆酸在这项研究中。以前的研究报道在100年应对最小的细胞损伤<我t一个lic> μ或200<我t一个lic> μM脱氧胆酸接触( 21, 22),和更高的脱氧胆酸浓度(500<我t一个lic> μm - 1毫米)已经被用来研究损伤胃细胞和肝细胞( 23]。此外,脱氧胆酸浓度在人类胃远端胃切除术后残余约370<我t一个lic> μ200 m .因此,我们使用浓度<我t一个lic> μ米和400<我t一个lic> μ10 M 5 h, h和24小时的初步实验(补充图)所示,选择了400年<我t一个lic> μ最后M 10 h。我们的研究结果表明,脱氧胆酸能诱导细胞凋亡在胃粘膜细胞系GES-1 AGS,而后者细胞系AGS是用来避免特异性效应。一些研究涉及的坏死通路脱氧胆酸对胃细胞的影响( 22, 24, 25),而另一些人建议,是由于细胞凋亡的影响( 6, 26]。目前的研究表明,细胞凋亡可能是一个脱氧胆段时间胃粘膜细胞死亡的主要机制。

然而,炎症的机制——cancer-induction胆汁酸对胃黏膜的影响尚未确定。蛋白质组学分析在这项研究显示共有348个不同的表达蛋白质,它被发现参与多样的生物过程,包括RNA绑定,核糖体的结构组成,核酸绑定和蛋白激酶监管活动。已报告的一些鉴定蛋白质参与炎症和肿瘤。组蛋白核心macro-H2A.1一个nd E3 ubiquitin-protein ligase UHRF1 were downregulated, which has been reported to be related with the obstruction of DNA repair and nucleotide metabolism and thus induction of genetic mutations or epigenetic defects [ 27, 28]。相关的膜蛋白参与细胞增殖,包括蛋白质n-chimaerin [ 29日的儿子),sevenless同族体1 ( 30., 31日),粘着斑激酶1 ( 32被调节。相比之下,Bcl2,细胞死亡的一个对手,是表达下调。我们的观察表明,细胞增殖是胆汁酸治疗后触发。细胞可能接受基因事件导致孔穴的增生,这是一个重要的返流性胃炎的组织病理学特征和对肿瘤发生[至关重要 33]。ATP合酶2也是调节线粒体F1复杂装配因素,建议增强氧化磷酸化和加速能量代谢 34, 35),这是与细胞增殖增加一致。除此之外,一些研究报道,当刺激细胞增殖,同时容易被诱导细胞凋亡。癌基因激活细胞凋亡可能同时使细胞更敏感。细胞增殖和细胞凋亡的过程是相互耦合的( 36- - - - - - 38]。胆汁返流被认为函数作为发起者胃致癌作用( 39, 40]。我们的研究结果暗示胆汁酸会驱动的开发和进展胆汁返流性胃炎甚至胃癌。

总的来说,我们的研究结果表明,胆汁返流的主要因素之一是胃粘膜病变的发病机制,应该进一步关注的焦点。胃粘膜细胞的凋亡可能是由脱氧胆酸。表达蛋白质组学分析确定了不同蛋白质GES-1细胞脱氧胆酸处理。这些发现改善我们的理解的分子机制对胃粘膜细胞脱氧胆酸的影响。未来的研究应该在患者进行进一步研究的临床关系从体外研究确定的蛋白质。

 5。结论

总之,我们的综合分析显示一个概要文件的不同表达蛋白脱氧胆酸洗胃粘膜细胞。此外,功能富集分析的结果显示,这些蛋白质可能有生物功能相关的脱氧胆酸引起的胃粘膜疾病的发展,包括RNA拼接、大分子复杂的单元组织,核小体的组织。信号网络分析可能有助于进一步了解胆汁段时间胃损伤的潜在的监管机制,包括胃癌。

 相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

 确认

这项研究是由重点实验室<我t一个lic> 幽门螺杆菌感染和上消化道疾病,北京重点实验室(没有。BZ0371),中国国家自然科学基金(批准号81270475)。

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