从发育不良/癌症和正常组织四微米厚的组织切片置于载玻片上并用苏木精和曙红染色。组织样品的诊断是由两个不同的组织病理学家确认。之前DNA提取，所有的肿瘤位点检查肿瘤细胞内容≥70使用立体显微镜一个×40放大倍率下％。为了deparaffinize，我们利用在二甲苯和醇的标准系列洗涤。使用30号针头和一个尖外科刀片，病理学家同时期待通过显微镜进行显微解剖。组织碎片沉积到所述收集管。

如先前所描述的LOH进行了分析[ 19， 20]。通过标准方法提取DNA后，七基因座与肿瘤抑制基因来鉴定显著结构性染色体畸变。的DNA，通过PCR在基因座链接到腺瘤性结肠息肉病（APC）位点在5q21（D5S505），可能的肿瘤抑制/衰老基因座扩增在10p15（D10S501和D10S602），在17p13（TP53）的p53的基因座中，BRCA1在17q21上（D17S855）位点，和在18q21的DCC基因座（D18S58和D18S61）。

In brief, 4 mL 30% acrylamide (29 : 1) solution, 2.4 mL 5 × TBE solution, 5.6 mL ddH2O, 200  μ微升10％过硫酸铵，和10  μ大号TEMED得到充分混合，倾入凝胶中，然后浇注混凝土在室温下1小时。十  μL的PCR产物，2 μL of loading buffer (95% formamide, 10 mM NaOH, 0.1% bromophenol blue, 0.1% xylene cyanol) were mixed. The mixture was centrifuged for 15 seconds, denatured at 93°C for 3 minutes, bathed in ice for 10 minutes, placed onto a 10% nondenaturation polyacrylamide gel, and separated with 0.5 × TBE buffer for 2 hours at RT and 100 V.

电泳后，将凝胶用Bio-Rad公司银染试剂盒（Bio-Rad公司，费城，PA，USA）染色。简要地说，将凝胶固定，用40％甲醇30分钟，氧化5分钟，漂洗5分钟三次，银染色20分钟，冲洗30秒，显影1分钟三次，并用5％乙酸停止酸15分钟。用凝胶DocXR（Bio-Rad公司）染色结果进行分析。当肿瘤等位基因显示出相对强度至少50％的增益或还原（杂合度（LOH）的损失的评估被分配图 1)。

DNA样品用两种不同的寡核苷酸对特异于推荐的微卫星基因座和BAT25 BAT26扩增。引物序列（集成DNA技术，爱荷华州，USA）分别为：BAT25（前进59 TCGCCTCCAAGAATGTAA GT-39和反向59 TCTGCATTTTAACTATGGCTC-39），和BAT26（前进59 TGACTACTTTTGACTTCAGCC-39和反向59 ACCATTCAACATTTTTAACCC-39）。如先前所述进行PCR反应。PCR products were run on 8% denaturing polyacrylamide gels at 180 V for 18 hours, and visualized by silver staining (Figure 1)。

采用改良的长穿插核苷酸元素联合亚硫酸氢盐限制性分析(COBRA LINE-1)方法分析癌症的LINE-1甲基化状态[ 17， 21， 22]。该方法基于的原理是，在胞嘧啶的DNA被转化为尿嘧啶当DNA与亚硫酸氢钠处理，而甲基化胞嘧啶从转换保护。因此，甲基化和非甲基化胞嘧啶可以通过消化用识别含CpG序列的限制酶区分开来。所提取的DNA用亚硫酸氢钠处理，使用EZ DNA甲基化试剂盒（ZYMO RESEARCH，橙，CA，USA）分离。亚硫酸氢盐处理的DNA进行PCR 40个循环的扩增两个引物，第3行（5V-GYGTAAGGGGTTAGGGAGTTTTT）和LINE 4（5V-AACRTAAAACCCTCCRAACCAAATATAAA），在50℃的退火温度。将PCR产物用限制性内的TaqI酶，其在65℃下识别TCGA，消化1小时，然后通过电泳在2％的分离的琼脂糖凝胶。消化和未消化的条带的密度通过扫描用Gel Doc凝胶XR（Bio-Rad公司，费城，USA）和得分与获得 数量一个软件(美国费城Bio-Rad)。来自甲基化DNA的已消化片段(80 bp)除以来自未甲基化DNA的已消化片段和未消化片段(160 bp)之和，表示TaqI线位点的部分甲基化(以百分比表示)(图) 2)。

对于定量变量，计算其平均值及其标准差。对于定性变量，计算其百分比及其95%置信区间(95% CI)。我们使用了 χ²测试分析两者之间的联系 幽门螺旋杆菌状态和其它基线特征。对于年龄比较和LINE-1甲基化水平，我们采用独立样本 Ť测试。我们使用SPSS统计软件包(版本12.0.1)进行所有分析。

LOH的发生率在GED 83％（83/100），和LOH的频率分别为34％对APC（D5S505），上10便士（D10S501）40％，10便士上（D10S602）48％，对p53的14％（TP 53），在BRCA1 40％（D17S855），在DCC（D18S58 51％），并在DCC（D18S61 45％），分别。根据染色体缺失的先前所描述的分类，GED分为负（LOH阴性），低电平（LOH-L; 3点或更少的损失）和高级别（LOH-H; 4点或更多的损失）。LOH-L的发生率为47％（47/100），而LOH-H为36％（100分之36）。LOH的与频率 幽门螺旋杆菌感染为76.5％（13/17），48.9％（23/47），并在LOH阴性，LOH-L，和LOH-H病变，分别为50.0％（18/36）。有间无显著差异 幽门螺旋杆菌感染及缺氧情况( P = 0.06 )。病变LOH阴性的LINE-1甲基化水平不从LOH阳性的显著不同。此外，LINE-1病变LOH-L的甲基化程度不会从LOH-H的显著不同（表 1)。在病变中 幽门螺旋杆菌感染后，LOH-L与LOH-H的LINE-1甲基化水平无差异(图) 2)。

微卫星不稳定(MSI)的频率为36%(36/100)，不稳定率为BAT25和BAT26分别为19%和29%。BAT25(+)的频率与 幽门螺旋杆菌感染率为11%，BAT26(+)伴 幽门螺旋杆菌感染为22％。

MSI的LINE-1的甲基化水平是不从微稳定（MSS）病变（表显著不同 1)。MSI的频率 幽门螺旋杆菌感染61.1%(22/36)，与MSS病变50.0%(32/64)无显著差异( P = 0.28 )。在与GED 幽门螺旋杆菌MSI病灶感染、LINE-1甲基化水平明显低于MSS病灶( 40.23 ± 4.47 ， 43.90 ± 4.81 ， P < 0.01 ）（图 3)。

根据修订的维也纳分级将组织标本分为两组:低级别发育不良(3类)和高级别发育不良/粘膜内癌(4类) 幽门螺旋杆菌感染 （ P = 0.68 )。4类病变有LINE-1的甲基化比3类病变的较低的水平（ 38.95 ± 4.28 与 44.93 ± 4.29 ％， 分别， P < 0 。 01 )。在第3和第4类中，LOH-H出现的频率差异不显著(30.0%，15/50对42.0%，21/50; P = 0.21 )。在第3和第4类中，MSI阳性的频率分别为30%和42.0%(22/51)(见表) 2)。在3类病灶中，MSI的LINE-1甲基化水平明显低于MSS ( 43.18 ± 3.66 与 45.68 ± 4.41 ％， 分别， P = 0 。 0 五 ）（图 4)。