人胰腺癌细胞株BxPC-3、Capan-1、pan-1和AsPC-1分别从美国ATCC (Rockville, MD, USA)获得，在含10%胎牛血清的RPMI 1640中，37℃，5% CO的潮湿培养箱中培养₂。16例胰腺腺癌标本均来自中国医科大学盛京医院，患者均知情同意，手术切除后立即冷冻于液氮中。本研究经中国医科大学伦理委员会批准进行。

总RNA从组织和细胞系通过Trizol试剂（宝，大连，中国）根据由生产商提供的方案分离。然后，1  μRNA的克来合成第一链cDNA。RT-PCR法由Takara RNA PCR 3.0试剂盒（Takara，大连，中国）进行。实时PCR使用的LightCycler系统与所述的LightCycler DNA万事达的SYBR Green I试剂盒（Roche Diagnostics）上一起进行。管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）用作内部对照。基因表达通过比较CT法进行定量，标准化CT值，以GAPDH和计算相对表达值。引物序列如下：COX-2正向，5'-ACAATGCTGACTATGGCTAC-3'，反向，5'-CTGATGCGTGAAGTGCTG-3';MMP-9前进，5'- AGGACGGCAATGCTGATG-3'，反向，5'-TCGTAGTTGGCGGTGGTG-3';GAPDH正向，5'-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3'，反向，5'-AAAGGTGGAGGAGTGGGT-3'。

Cell lysates were prepared with sample buffer (50 mmol/L Tris-HCl (pH 6.8), 100 mmol/L DTT, 2% SDS, 0.1% bromophenol blue, and 10% glycerol) and were subjected to a 12% sodium dodecyl sulfate (SDS)/acrylamide gel. The proteins on acrylamide gel were transferred to a nylon membrane, which was blocked overnight (4°C in PBS with 0.1% Tween and 10% milk powder). Primary antibodies for COX-2 and MMP-9 (Santa Cruz, CA, America), and the corresponding secondary antibodies (Santa Cruz, CA, America) were applied before immunoblotting. The human gene β-actin（圣克鲁斯，CA，美国）用作内部对照。印迹可视化与FX亲Plus系统（Bio-Rad公司），并使用接穗图像4.03软件定量。

COX-2基因的siRNA质粒和非沉默对照siRNA质粒从Takala先生（大连，中国）。细胞在孔的密度接种到24孔板 2 × 10 5 。第二天，根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen，英国)转染COX-2 siRNA或对照siRNA。

铂族元素的浓度₂在细胞是根据制造商的说明书使用的Quantikine ELISA试剂盒（博士德，武汉，中国）测定培养物上清液。The sensitivity of the assay was 2 pg/mL.

培养的细胞的迁移，使用基质胶侵袭室（24孔格式中，8测定  μ米孔;BD pharmingen)。细胞( 5 × 10 5 )被加到上室。在37℃和5% CO下24小时后₂，在其下表面的迁移细胞使用用100％甲醇固定后1％甲苯胺蓝染色。对于每个转孔，在10个视野（×200）迁移的细胞的数目进行计数。

使用Spearman秩相关检验分析在胰腺癌标本COX-2的表达和MMP-9的表达之间的相关性。由学生相比mRNA的表达 t-胰腺细胞系试验采用SPSS 11.0版本(SPSS，芝加哥，IL, USA)进行统计分析。当 P - 值是<0.05。

COX-2和MMP-9 mRNA最初在16个胰腺癌中通过RT-PCR检测，发现其在这些胰腺癌中的表达存在差异(图) 1)。为了评估COX-2 mRNA表达与MMP-9的推测相关性，我们进一步使用实时PCR测定了它们的mRNA水平，并如假设的那样，Spearman的秩相关检验在16种胰腺癌中验证了一个阳性( P < 0 。 01 ，图 1)。

Western blotting was used to examine COX-2 and MMP-9 expression in pancreatic cell lines BxPC-3, Capan-1, PANC-1, and AsPC-1, and the examination showed COX-2 (72 kDa) and MMP-9 (92 kDa) expression varied in these cells. Both BxPC-3 and Capan-1 cells had strong expression of COX-2 and MMP-9, both of which, however, presented a weak expression in PANC-1 cells. No COX-2 expression was found in AsPC-1 cells (Figure 2)。用ELISA我们进一步揭示PGE₂蛋白质在的BxPC-3和CAPAN-1细胞的培养上清（图 2)。

在试图探索COX-2在MMP-9的上调参与，我们处理的特别的BxPC-3和CAPAN-1细胞的选择性COX-2抑制剂NS398（西格玛，100  μ摩尔/升）中24小时，并且我们发现MMP-9的表达在这些细胞中下调显著（ P < 0 。 01 ，RESP，图 3.)。Similar results were observed when a nonselective COX-2 inhibitor indomethacin (Sigma, 100 mmol/L) was employed following the same procedure ( P < 0 。 01 ，RESP，图 3.)。此外，发现二者的BxPC-3和CAPAN-1分泌的PGE少₂NS398处理12小时后的蛋白( P < 0 。 01 ，RESP）或24小时（ P < 0 。 01 ，RESP，图 3.)。

COX-2的siRNA的质粒用来转染的BxPC-3和CAPAN-1细胞，并在对方作为对照物使用相应的siRNA非沉默质粒。据观察，COX-2的表达在胰腺癌BxPC-3和CAPAN-1是缺席与COX-2的siRNA的质粒转染后（图 4)。然后通过Western blot和real-time PCR检测MMP-9的表达，检测发现转染COX-2 siRNA质粒后，与对照siRNA细胞相比，BxPC-3和capan -1细胞中MMP-9的表达显著下调( P < 0.001 或无siRNA的细胞( P < 0.001 ，RESP。）（图 4)。

BxPC-3细胞用TNF-α处理的 α(Sigma, 100 ng/mL) or LPS (Sigma, 100 ng/mL) for 6 hours in attempt to further explore the role of COX-2 in the upregulation of MMP-9 expression, and real time-PCR and Western blotting detection revealed that both COX-2 ( P < 0 。 01 和MMP-9 ( P < 0 。 01 ， resp.)显著上调(图 5)。TNF-上调MMP-9 α或LPS可以通过NS398（显著抑制 P < 0 。 01 然而，COX-2的上调不能被NS398抑制(图) 5)。

探讨PGE是否₂是否参与COX-2上调MMP-9表达，BxPC-3细胞用10、50或100处理 μ摩尔/ L PGE₂6小时。Real-time PCR和Western blotting检测显示MMP-9在50处理的BxPC-3细胞中显著上调 μ摩尔/ L（ P < 0 。 01 ，图 6）或100  μ摩尔/ L（ P < 0 。 01 ，图 6)。

使用，以试图将基质胶侵袭室调查上调MMP-9是否官能进行迁移分析。有在BxPC-3细胞与TNF-α的迁移显著上升 α( P < 0.001 ），LPS（ P < 0.001 )或铂族元素₂( P < 0.001 与未处理的对照组细胞比较(图) 7)。然而，后来TNF-引起的增加 α或者加入NS398后，LPS被显著抑制( P < 0.01 ，RESP，图 7)。造成PGE增加₂不变。