1。背景
男性不育,男性的常见疾病,被定义为男性因素不育的夫妇试图怀孕超过一年没有成功。大约有15%的夫妻在一年内怀孕不实现,寻求医学治疗不孕症。八分之一的夫妇试图怀上第一个孩子时遇到问题,随后打算怀孕和六分之一时遇到问题的孩子。百分之三的女性正在尝试怀孕仍然不自觉地没有孩子,而6%的怀孕的女人不能有尽可能多的孩子的希望
1]。50%的不自觉地没有孩子的夫妻,找到一个男性infertility-associated因素,通常与精液参数异常(
2]。男性不育的病因是复杂的。目前,明确病因包括泌尿生殖疾病,发现内分泌疾病,基因异常,和其他系统性疾病。此外,欧洲泌尿外科协会的指南(2020年版)指出,大约30%的不孕病例特发性男性不育症(
3]。现有的治疗措施包括雌激素受体调节剂,精子促进健康的特工,抗生素,和其他症状的治疗,但药效还不清楚(
4,
5]。
男性不育的治疗与传统中药(TCM)有着悠久的历史,现在流行在西方国家(
6,
7]。治疗的目标是生殖之间的平衡能量(气),血,内脏阴阳。通常,中医不是单独使用治疗疾病,但往往多个药物的形式相互配合。
黄芪和
当归通常用作药物组合治疗男性不育症的方法。
黄芪是干的
黄芪(费)。知母。或
黄芪(费)。知母。var。
mongholicus(。)萧。(
8]。功效是补气和加强脾。
当归的根
当归(摘要)。
9]。功效是补血液和激活血液循环。两者的结合可以治疗男性不育与气、血、津液不足(
10,
11]。然而,目前尚不清楚什么是机制PAA参与治疗男性不育。
使用网络药理学是一个新的学科近年来研究中药的药理机制。通过集成现有中药药理学方法,高通量生物信息学,和高端的数据分析软件,综合分析中药的作用机制可以进行
12]。它可以预测中药的药理机制“多组分、多目标、multipathway”和提供更好的数据和理论支持后续的药理实验。目前的研究是由三个步骤,包括数据收集、数据处理、和网络建设、富集分析和预测机制,流程图的技术策略研究是图所示
1。
技术策略流程图。
![]()
2。材料和方法
2.1。活性组分的识别以及中药的潜在目标
中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP) [
13)是一个比较经典的中药成分的数据库超过500中药和超过30000的化合物提供药代动力学信息对应的化合物。它已成为最常用的一个数据库网络药理学研究的学者。分子机制的生物信息学分析工具中药(BATMAN-TCM) [
14)是第一个在线生物信息学分析工具专门为研究中药的内在分子机制。相关活性成分的PAA TCMSP和BATMAN-TCM数据库中搜索与下面的筛选标准,是集结合常用的网络药理学的标准组件筛选方法和相关文献记录:口服生物利用度(OB)≥30%和药物相似(DL)≥0.18。化合物没有满足这些筛选条件被排除在外。根据文献,活性成分不合格的筛查和实验证明是有效的也纳入另一种成分;因此,获得的有效成分和治疗的目标
黄芪和当归被输入到UniProt数据库为每个目标
https://www.uniprot.org/获取标准数量的目标,最后结果计入一个Excel表。
2.2。识别疾病的目标
在线孟德尔遗传在人(人类)(
https://omim.org/)是一个数据库的人类基因和遗传表型集中在分子基因变异和显性表达式之间的关系和包含了超过15000个基因的信息。GeneCards [
15)(
https://www.genecards.org/)包含丰富的生物医学数据基因和他们的产品,包括基因组、蛋白质组学和基因function-related信息。DisGeNET [
16)是一个多功能平台,可用于人类疾病的分子基础的研究及其并发症,疾病候选基因的验证,和文本挖掘的性能评估方法。遗传协会数据库(GAD) [
17)是一个标准化的工具查看病例对照研究的日益增长的人类多态性数据。用户可以搜索基因,疾病、多态性、染色体位置和引用来获取相关信息。我们输入“男性不育”到人类数据库,GeneCards数据库,迦得(
https://geneticassociationdb.nih.gov/)和DisGeNET (
http://www.disgenet.org)来寻找目标与男性不育和记录在一个Excel表。
2.3。确定治疗目标和构建蛋白质相互作用(质子泵抑制剂)
有效成分,目标,和疾病的目标PAA删除处理,导入文氏图计划(
http://bioinformatics.psb.ugent.be/web-tools/Venn/)。最后,目标在十字路口被认为是有效的PAA治疗男性不育的目标。检索的搜索工具相互作用基因/蛋白质(STRING)质子泵抑制剂可以用于判断的信心通过不同证据评分系统,这样我们将知道哪些蛋白质在疾病的治疗中发挥重要作用。交叉分析后获得的目标输入字符串构造PPI网络,和结果导入Cytoscape软件(3.7.2章版)(
18]。根据网络分析工具和分子复杂的检测(MCODE) [
19插件,进行拓扑分析获得全面的数据为每个节点。根据中间性中心(BC),亲密中心(CC),学位,和MCODE得分,PAA的核心目标治疗男性不育,和PPI网络了。
2.4。网络建设
的disease-drug-active ingredient-target PAA治疗男性不育的网络被使用Cytoscape软件可视化。在网络中,每个节点代表一个数据元素,如疾病、药物活性成分,或目标。在无标度网络索引节点度反映了每个节点的参与,和程度的大小成正比的参与节点。导入数据之后,网络分析仪模块被用来获取每个数据元素的程度。
2.5。功能节点为核心目标
Metascape (
http://metascape.org/基因功能注释分析)是一个强大的工具,可以帮助用户当前流行的生物信息学分析方法应用于批基因和蛋白质分析为了理解基因或蛋白质功能。在这项研究中,我们使用了Metascape数据库执行基因本体论(去)基因和基因组功能注释和京都百科全书(KEGG)通路富集。去分析用来描述基因的功能目标细胞的组件(CC),分子功能(MF)和生物过程(BP)。KEGG分析用来确定相关的信号通路基因目标,选择与统计显著性分析结果(
P
<
0.05
)。网络相互作用的核心目标和信号通路与Cytoscape软件是为每个节点获得全面的信息。
2.6。Component-Target通路网络的建设
排名前20的通路从KEGG分析结果并结合文件过滤检索获得的可能途径与男性不育症的治疗和丰富的目标路径。目标与PAA中的有效成分对最终用于构造component-target通路网络图。
2.7。Ligand-Protein对接
六个蛋白质的信息(TP53 mapk1, il - 6, ANXA1, EGF,和表皮生长因子受体)在PPI网络的大多数男性不育密切相关是通过RCSB PDB (
https://www.rcsb.org/)。蛋白质被选为.pdb格式转换成通过AutoDock .pdbqt格式(
http://autodock.scripps.edu/)。进行对接与山柰酚AutoDock,豆甾醇和槲皮素。
3所示。结果
3.1。鉴定中药的成分和目标
PAA的有效成分在TCMSP BATMAN-TCM,搜索和筛选化合物据OB≥30%, DL≥0.18和结合文献筛选[
20.- - - - - -
23]。最终,112潜在核心获得的化合物,和977对应的目标是预测。
人类数据库,GeneCards数据库、迦得和DisGeNET数据库被用来寻找男性infertility-related目标。总共得到了4108年的目标后删除重复项。最后,374年男性不育症的治疗是有效的目标通过映射(图
2)。
PAA在男性不育治疗的目标。蓝色圆圈中的数字是作为一个独特的目标数,黄色的圆圈中的数字是男性不育的独特目标数,和共同目标数中间的数是常见的。
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3.2。PPI网络的建设
总共有374 PPI的共同目标是导入到字符串分析,结果总得分≥0.900被选中。总共有1415配对互动关系。结果导入到Cytoscape,经过筛选的基础上进行中间性中心,接近中心,学位,和MCODE得分,85年核心目标。PPI网络是与这些目标,如图
3(一个)。创建一个条形图也显示的频率出现的前20名的目标,如图
3 (b)和表
1。
作为一个对男性不育症的PPI网络。(一)核心PPI网络图。(b)频率(前20名的核心目标
y设在代表目标,
x设在代表频率)。
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详细数据的前20名的目标。
| 目标 |
学位 |
中间性中心 |
亲密关系中心 |
MCODE得分 |
| MAPK1 |
44 |
0.11909067 |
0.40682415 |
3.181818182 |
| TP53 |
44 |
0.07271146 |
0.37349398 |
3.454545455 |
| AKT1 |
40 |
0.10656178 |
0.4005168 |
4.169117647 |
| 小君 |
39 |
0.04830527 |
0.38993711 |
2.759259259 |
| AGT |
37 |
0.07377641 |
0.3583815 |
17 |
| RXRA |
35 |
0.10861121 |
0.40207523 |
6.222222222 |
| RELA |
31日 |
0.0222772 |
0.3708134 |
2.675324675 |
| HSP90AA1 |
31日 |
0.02770788 |
0.36470588 |
3.264705882 |
| NCOA1 |
30. |
0.03957597 |
0.37575758 |
6.222222222 |
| ANXA1 |
30. |
0.01792683 |
0.32460733 |
17 |
| EDN1 |
30. |
0.03558045 |
0.37530266 |
11 |
| 表皮生长因子受体 |
29日 |
0.04140608 |
0.36172695 |
8 |
| 肿瘤坏死因子 |
29日 |
0.03633951 |
0.36299766 |
2.810526316 |
| NR3C1 |
28 |
0.0253214 |
0.38130381 |
2.685714286 |
| MED1 |
27 |
0.03261089 |
0.36172695 |
6.222222222 |
| ADCY1 |
27 |
0.01606181 |
0.31155779 |
17 |
| ESR1 |
26 |
0.04038295 |
0.37621359 |
2.947368421 |
| 白细胞介素6 |
26 |
0.02207884 |
0.35107588 |
6 |
| PPARA |
25 |
0.05492241 |
0.39340102 |
6.222222222 |
| VEGFA |
25 |
0.02270293 |
0.35227273 |
2.911764706 |
3.3。药物Pair-Component-Target-Disease监管网络建设
共同的目标信息和映射PAA的活性成分对之间的关系和男性不育导入Cytoscape软件。网络的拓扑结构与网络分析仪评估Cytoscape的函数,和节点重要性表达的程度。节点度大于20的活性成分和10被选为目标,建立药物pair-component-target网络图,如图
4。前五山柰酚化合物对学位,豆甾醇、β谷甾醇,槲皮素和刀豆氨酸。其中,山柰酚、豆甾醇和槲皮素与雄性不育是密切相关的。
药物pair-component-target-disease监管网络。红色节点是中药,黄色节点是活性成分,绿色的节点目标,橙色节点之间的两个圆是常见的活性成分
黄芪和
当归,深绿色叶节点的共同目标
黄芪和
当归。
![]()
3.4。去富集分析的核心目标
去目标分析取得了398年重要的结果,包括382个基点,7 CCs, 9 MFs。十大英国石油(BP)、CC和曼氏金融术语被用来创建泡沫图表,如图
5。BP的范畴,与目标相关联的主要条款包括药物的细胞反应,分泌,调节和响应营养水平。CC范畴,丰富了条款目标包括蛋白激酶复杂,转移酶复杂,染色体区域。曼氏金融范畴的目标是丰富激酶活性等方面,细胞周期蛋白绑定,和激素活动。
前十的浓缩:(a)前10名的浓缩(BP), (b)的结果去浓缩(MF)和(c)结果的浓缩(CC) (
y设在代表前10 BP / MF / CC条款,和
x设在代表了浓缩因素)。
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3.5。KEGG分析的核心目标
共有153个途径是通过KEGG富集分析。结合文献检索,重要性高的前20名通路选择基于大小的泡沫映射
P
价值。一个文献检索显示,20通路中重要的信号通路与不孕症有关,包括PI3K-Akt HIF-1, AGE-RAGE IL-17,甲状腺激素信号通路。这些途径所有涉及到的目标,如TP53 mapk1, il - 6, ANXA1, EGF、EGFR,可用在表的详细信息
2。这些结果在图所示
6。
Male-infertility-related通路和相关目标。
| 描述 |
数 |
目标 |
| 营的信号通路 |
18 |
CFTR ACOX1、ADCY1 ADRB2 AKT1,检测CHRM2, CREB1, DRD2, EDN1, EDNRA,安全系数,HTR1A, NFKB1, NFKBIA, PPARA, PRKCA MAPK1, SST |
| PI3K-Akt信号通路 |
20. |
AKT1、CCND1 CDK2、CDKN1A CHRM2, CREB1, EGF、EGFR, HSP90AA1, HSP90AB1, IL4,白细胞介素6、KDR, NFKB1, NOS3, PRKCA, MAPK1, RXRA, TP53 FGF23 |
| IL-17信号通路 |
12 |
CASP8,安全系数、HSP90AA1 HSP90AB1、IFNG IL1B, IL4,白细胞介素6,使用IL13, NFKB1, NFKBIA MAPK1 |
| FOXO信号通路 |
11 |
AKT1 CCND1,猫,CDK2、CDKN1A EGF、EGFR,白细胞介素6、MAPK1, SLC2A4 TGFB1 |
| MAPK信号通路 |
13 |
IL1B AKT1, EGF、EGFR”丛书,白细胞介素6、KDR, NFKB1, PRKCA, MAPK1, TGFB1, TP53 FGF23 |
KEGG浓缩(前20名
y设在代表KEGG术语的前20名,
x设在代表了丰富的因素)。
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3.6。对接的结果
总共18对接结果,如表所示
3。这项研究的结果表明,结合能的配体受体都是负的,这表明化合物之间的有约束力的活动和目标蛋白,强大的绑定活动时结合能小于−5焦每摩尔,和强大的绑定活动当它小于7−焦每摩尔。每个配体的对接模式最低结合能被选为显示(见图
7)。
对接结果。
| 配位体 |
受体(PDB ID) |
最低结合能(焦每摩尔) |
| 豆甾醇 |
EGF (1 nql) |
−14.0 |
| 豆甾醇 |
表皮生长因子受体(5 ug9) |
−11.5 |
| 槲皮素 |
EGF (1 nql) |
−11.5 |
| 豆甾醇 |
ANXA1 (1 mcx) |
−11.0 |
| 豆甾醇 |
白细胞介素6 (4 cni) |
−10.0 |
| 豆甾醇 |
表皮生长因子受体(5 ug9) |
−9.3 |
| 槲皮素 |
EGF (1 nql) |
−9.0 |
| 山柰酚 |
白细胞介素6 (4 cni) |
−8.8 |
| 山柰酚 |
TP53 (3 d06) |
−8.7 |
| 山柰酚 |
EGF (1 nql) |
−8.5 |
| 豆甾醇 |
TP53 (3 d06) |
−8.3 |
| 豆甾醇 |
MAPK1 (2 waj) |
−7.5 |
| 山柰酚 |
ANXA1 (1 mcx) |
−7.2 |
| 槲皮素 |
TP53 (3 d06) |
−6.9 |
| 槲皮素 |
ANXA1 (1 mcx) |
−5.7 |
| 山柰酚 |
MAPK1 (2 waj) |
−5.0 |
| 槲皮素 |
白细胞介素6 (4 cni) |
−3.8 |
| 槲皮素 |
MAPK1 (2 waj) |
−2.8 |
分子对接模型的示意图。(一)之间的对接示意图EGF和槲皮素。(b)之间的对接示意图EGF和豆甾醇。(c)示意图EGFR和山柰酚之间的对接。
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4所示。讨论
先前报告的使用中药治疗男性不育的表示
黄芪和
当归经常用于中药(
24]。它们通常用于治疗不孕不育由于气血两虚和血液。根据传统中医理论,气能产生血,血能载气。气虚不能产生血,血不足不能改变本质。
黄芪和
当归可以补充气和血液和调节阴阳。
980年共有112个有效成分相应的目标,和4108年疾病PAA对筛选的目标组件数据库,和374年潜在目标映射后得到了男性不育。这一发现表明,PAA多组分和多目标特征的男性不育症的治疗。药物pair-component-target网络图表明,山柰酚,豆甾醇、β谷甾醇,槲皮素和刀豆氨酸活性成分。这些协会几个组件与男性不育如下。山柰酚类黄酮,可显著提高抗氧化剂的水平如SOD(超氧化物歧化酶)、猫(过氧化氢酶)和GPX(谷胱甘肽过氧化物酶)在糖尿病大鼠的精子;减少炎症的水平等因素NF -
κ核因子B(κB)和肿瘤坏死因子-
α(肿瘤坏死因子α)精子;缓解精子损伤(
25];和显著提高小鼠的精子质量引起的不孕苯并芘,能源物质的不完全燃烧的产物(
26]。槲皮素等黄酮类化合物还具有良好的抗炎作用
27]。相关研究表明,与槲皮素治疗后,mtDNA的内容(线粒体DNA)患者的精子显著减少,而Cyt b的内容(细胞色素b)和NADH 5(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸5)在精子显著增加,这有助于提高精子多动和顶体反应(
28]。豆甾醇属于类的植物固醇。研究表明,膳食补充植物甾醇可以显著增加精子数量和精子能动性和降低精子的氧化应激反应(
29日]。因此,山柰酚,豆甾醇、槲皮素和其他化合物可能是核心PAA减轻男性不育症的化合物。
结果表明,潜在的目标
当归和
黄芪男性不育的治疗包括TP53(肿瘤蛋白质P53) mapk1(增殖蛋白激酶1),il - 6(白细胞介素- 6受体),ANXA1 (annexin-A1)、表皮生长因子(表皮生长因子),EGFR(表皮生长因子受体)。在这里,这六个目标和男性不育的关系。TP53基因,一个重要的肿瘤抑制基因,可以调节细胞的生长、分化、衰老,免疫反应。在精子发生减数分裂是至关重要的,TP53 mRNA和蛋白表达在初级精母细胞和精子发生的细胞凋亡中起着重要作用,这表明TP53参与减数分裂(
30.,
31日]。癌症越来越多的研究证实,PI3K-Akt途径可以提供积极的和消极的p53的监管水平(
32]。然而,这一规定是否会影响男性生育能力尚未证明。MAPK(增殖蛋白激酶)MAPK信号通路的一个重要组成部分。MAPK扩散密切相关、炎症、分化、凋亡等过程在男性精子
33]。ANXA1,哺乳动物膜联蛋白家族的重要一员,与细胞增殖和膜融合密切相关(
34]。研究人类精子发现ANXA1可以绑定和Ca2 +端依赖的方式与f -肌动蛋白(
35),肌动蛋白细胞骨架中扮演一个重要的角色在精子精子获能和顶体反应(
36]。巨噬细胞il - 6是一种炎性细胞因子分泌。尽管它主要是参与体内炎症反应,其水平显著增加不育患者的精液(
37]。EGF对雄性动物的生殖活动密切相关。一个适当的剂量的EGF能具体地通过表皮生长因子受体促进精原干细胞的增殖在时间的方式
38]。此外,研究表明,EGF可以调节睾丸间质细胞的增殖和维护睾酮的浓度(
39]。如表所示
2,这些目标是PI3K-Akt的上游或下游,IL-17,营地,FOXO、MAPK和其他信号通路。他们可能发挥关键作用由PAA治疗男性不育。
KEGG浓缩的目标路径分析表明,PAA在男性不育症的治疗包括PI3K-Akt, IL-17(白介素17),营地,FOXO MAPK和其他信号通路。一种机制图如图
8。这些信号通路如何与开发或治疗男性不育的简要描述如下。如图
6,PI3K-Akt信号和信号通路参与营最目标。PI3K / AKT通路是一个重要的信号通路在人类的身体。PI3K异质二聚体,同时展览丝氨酸/苏氨酸激酶活性和磷脂酰肌醇激酶活动。它是由调节亚基P85催化亚基p110,这与精子发生和成熟密切相关;例如,它会影响精原干细胞的增殖和分化,精母细胞的减数分裂
40]。PI3K不仅可以激活酪氨酸激酶(RTK)受体酪氨酸激酶,在细胞膜和ras蛋白也被其他蛋白质。一种蛋白激酶是PI3K的直接目标基因
41,
42]。PI3K激活后,可以激活一种蛋白激酶磷酸化的磷脂酰肌醇4-phosphate和磷脂酰肌醇4-diphosphate。一些研究发现PI3K-specific抑制剂(LY294002)可以显著提高人类精子能动性和向前精子的运动性的比例(
43,效果更明显的人精子活力不足(
44]。这一发现表明,PI3K负调节人类精子细胞的能动性。此外,PI3K负调节的自噬,自噬可以参与调节精子的生存和运动。值得注意的是,黄曲霉毒素可以引起精子细胞自噬通过抑制mTOR / PI3K / AKT通路,从而造成损害男性生育能力(
45]。foxo位于下游的生长因子和营养信号。在哺乳动物中,foxo包括Foxo1、Foxo3 Foxo4,协调各种反应,包括细胞周期阻滞和细胞程序性死亡(
46]。FOXO转录因子是关键节点在许多信号通路的十字路口
46]。先前的研究已经证实,foxo位于下游的PI3K / AKT信号通路,由Akt-dependent磷酸化。当一种蛋白激酶磷酸化,foxo抑制(
47]。繁殖,FOXO1精子发生中起着重要的作用[
48,
49]。FOXO也扮演着重要的角色在精原干细胞的自我更新和分化(精原细胞)。当PI3K / AKT激活,FOXO1失去活性,进一步抑制细胞的自我更新(
50),这表明这FOXO扮演一个重要的精子发生后期的监管作用。MAPK属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族。主要有三个亚科:兵,c-Jun n端激酶(物),和p38MAPK (MAPK14)亚科;这个家庭被认为是一个重要的行列式精子发展(
51- - - - - -
54]。在大鼠睾丸、磷酸化ERK1/22 JNK1/2, p38MAPK本地化在精原细胞,发挥重要的作用在调节营养供给,维持细胞连接和支持生殖细胞的有丝分裂和减数分裂
57]。生殖细胞的迁移和释放精子需要(能)粘合连接处并且支持细胞之间的紧密连接(套)(SC-SC连接)和支持细胞(SC-GC连接)。这个要求使得正常精子形成依赖的细胞。激活p38MAPK和ERK途径干扰之间的能支持细胞,激活ERK途径也影响这两个连接的动力学,从而影响细胞的自我更新(
55]。许多细胞可以应对生殖毒物,这些反应是由MAPK通路的激活;例如,双酚A可以激活ERK和物信号通路诱导细胞凋亡
56的影响下,di-n-butyl-phthalate(一种内分泌干扰),大鼠睾丸组织受损,精液质量下降,和有一个高架p-ERK1/2 p-JNK MAPK通路中的表达,但不是p38 MAPK磷酸化水平(
57]。在其他的实验中,然而,p38mpak建议发挥重要作用在足细胞损伤(
58]。虽然现有的研究报道不一致的结论,它已成为一个事实MAPKs与男性不育有着密切的联系,这是符合本实验的结果。营与精子能动性密切相关(
59]。具体地说,它扮演着一个重要的角色在起始,精子的运动性的变更和维护
60]。近年来,IL-17已被证明是一个促炎细胞因子。通过特定绑定的受体,它可以促进炎症、免疫反应、造血和其他流程。横断面的一项研究发现,不育患者的精液IL-17水平显著高于正常男性的精液
61年]。
图的信号通路与不孕症有关。
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