在这项研究中,秋水仙碱是购买从西双版纳班纳制药有限公司(云南、中国)。创新领导力₄是由天津Guangfu化学研究所(天津)。丙氨酸氨基转移酶(ALT,猫。不。:2018年0627), aspartate amino transferase (AST, Cat. No.: 20180607), collagen IV (COL-IV, Cat. No.: 201809), hyaluronic acid (HA, Cat. No.: 201808), laminin (LN, Cat. No.: 201809), and precollagen type III (PC III, Cat. No.: 201809) detection kits were provided by Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, China). The antibodies of phospho-c-Jun, phospho-MEK1/2, HMGB1, αsma、phospho-ERK1/2 ERK1/2买了从细胞信号技术(美国)。MEK1/2抗体和COL-I买来Abcam(美国)和抗体的愤怒和GAPDH都是从ABclonal买(中国)。

基于“增大化现实”技术(干的根源 基于“增大化现实”技术membranaceus(费)。商洽。)是由北京制药有限公司(中国,北京)。十倍的水被用于第一的基于“增大化现实”技术提取2 h。然后,八倍的水被用来提取1.5小时。的提取 黄芪被冷冻真空干燥炉干燥成粉末。最终的收益率是40.08%。Q-TOF LC / MS分析表明,基于“增大化现实”技术提取的主要组件包括3、4-dihydroxybenzyl醛(6.17%)、calycosin-7-glucoside (0.69%)、armillaripin (10.31%)、rhodomollein III(7.05%)、邻苯二甲酸酐(1.76%)、clavatine (6.46%)、pterosin B (7.46%)、D-cathinone(2.65%)、芒柄花黄素(15.4%)、Andrographolide(2.57%),和anemarrhenasaponin-I (4.55%) ( 19]。

共有36个男性的雄性sd大鼠中权重从中国获得180 - 200克食品药品认证研究所(不许可。SCXK (Jing) 2014 - 0013)。这些老鼠被安置在中央第五动物实验室医学中心的中国人民解放军总医院。动物们保持受控条件下的温度25°C±2°C,湿度55%±5%,光明与黑暗周期。

所有的动物被随机分为6组,每组六个老鼠。橄榄油CCl稀释₄比例为1:1。模型组,基于“增大化现实”技术(2.7,5.4,10.8 g / kg / d)组和秋水仙碱(作为阳性对照组)CCl组都参加了₄稀释剂(2毫升/公斤)为8周(每周两次 19]。与此同时,对照组腹腔注射相同剂量的橄榄油。八周后,AR(2.7, 5.4,和10.8 g / kg / d)组和秋水仙碱组(0.2毫克/公斤/天)有相应的药物浓度( 20.]。对照组和模型组被给予相同体积的蒸馏水。所有的老鼠都被胃内的政府为6周一天一次。所有老鼠都剥夺食物前24小时持续治疗但允许免费使用水。这些动物牺牲2 h后治疗和他们的肝脏和血清收获的进一步的研究。血液样本离心机在3500 rpm,持续15分钟。肝脏组织分为三块,放置在样品瓶。血清和肝组织存储在−80°C。所有动物实验伦理委员会批准的第五次中国人民解放军总医院医学中心在中国。

血清ALT、AST、COL-IV HA、LN、PCⅲ测量。总之,根据制造商的协议、样品,2,4-dinitrophenylhydrazine溶液和氢氧化钠溶液依次添加。最终颜色在510 nm,血清ALT和AST水平根据OD值测定。同样,根据制造商的指示,加入试剂的工具包反过来,阅读最终颜色在450海里,并获得COL-IV的血清HA、LN、PCⅲ根据OD值。

肝组织中性缓冲福尔马林固定在10%超过48小时。所有的肝脏与梯度乙醇溶液和筛选了固定和嵌入石蜡。组织部分约4 - 5 μ厚度减少,沾染了苏木精伊红())和马森。肝组织的病理变化是尼康显微镜下观察(尼康仪器公司、日本)。

使用定量rt - pcr检测的mRNA表达il - 6、TNF - α,il - 1 βHMGB1, TLR4、Myd88和愤怒在肝组织中。总RNA提取试剂盒试剂从90毫克冻肝组织(美国生命科技,CA)。提取的mRNA的吸光度检测到分光光度计在260 nm和280 nm,分别。的信使rna纯度1.8和2.2之间(A260 / A280)被选为合格产品的后续研究。RNA (2 μg)被转录成cDNA PrimerScript RT摄政工具包(美国马热费希尔科学)。互补脱氧核糖核酸随后进行PCR扩增的ABI 7500实时PCR仪(美国应用生物系统公司公司,卡尔斯巴德,CA)。数据分析是由2^−△△CT方法。表列出了引物 1。

冰冷的无线电免疫沉淀反应试验(里帕)的混合裂解缓冲,phenylmethylsulfonyl氟化物(PMSF)和蛋白质磷酸酶抑制剂用于蛋白质提取。肝组织(80毫克)的均质和细胞溶解混合,然后在12000×g离心10分钟4°C。上层清液的收集和BCA蛋白质分析工具包(北京Solarbio科技有限公司北京有限公司,中国)是用于检测总蛋白浓度。所有的蛋白质样品被夷平相同的浓度。然后,减少Laemmli SDS样本缓冲区添加和混合,并在沸水中煮5分钟。准备样本西方涂抹10%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和污点被转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。PVDF膜密封在5%脱脂牛奶在室温下2小时,然后放置在一个混合5%的脱脂牛奶,Tris-buffered盐水(TBS),和0.05%渐变20主要与相应的抗体,和孵化一夜之间在4°C。抗体,包括兔子Anti-NF - κB p65(细胞信号技术,稀释:1:1000),愤怒(ABclonal技术、稀释:1:1000),phospho-MEK1/2(细胞信号技术,稀释:1:2000),MEK1/2 (Abcam稀释:1:10000),phospho-ERK1/2(细胞信号技术,稀释:1:1000),ERK1/2(细胞信号技术,稀释:1:10000),phospho-c-Jun (Abcam稀释:1:500),和GAPDH (ABclonal技术、稀释:1:10000),在这一步骤中使用。GAPDH是用作控制总蛋白提取。与适当的二次抗体孵化后2小时在室温下,细胞膜被三次TBS渐变20 5分钟为0.05%。最后,化学发光系统是用来测量免疫反应性的蛋白质。所有的西方墨点法是重复3次。

对AR的表达的影响 αsma, HMGB1,胶原蛋白在肝纤维化大鼠肝组织,免疫组织化学分析如前所述[ 21]。石蜡的部分肝脏组织在二甲苯和梯度乙醇deparaffinization和脱水,然后是部分被放入柠檬酸抗原为抗原检索检索解决方案。用3%过氧化氢溶液的部分阻断内源性过氧化物酶。被阻塞的部分有1% BSA在室温下30分钟。随后,部分被孵化 αsma(细胞信号技术,稀释:1:100),兔子Anti-HMGB1(细胞信号技术,稀释:1:200),和胶原蛋白I型(Abcam稀释:1:200)在一夜之间在PBS溶液在4°C。孵化后的部分用适当的二次抗体室温1小时,他们沾民建联和苏木精染色的解决方案,最后幻灯片是脱水和安装。尼康显微镜(尼康仪器公司、日本)和NIS-Elements (F 4.0版本,日本)软件被用来观察的部分。最后,Image-Pro +(6.0版本,媒体Cybemetics, INC .,罗克维尔市,医学博士,美国)软件用于计算和分析综合平均光密度(IOD)免疫组织化学反应的积极的区域形象。

结果表示为平均值±标准偏差(SD)。单向方差分析进行评估的数据,邓肯与SPSS电脑程序的多量程测试(20.0版本,SPSS Inc .)、芝加哥,美国)。 P < 0.05 被认为是显著和 P < 0.01 被认为是非常重要的。

如数据所示 1(一)和 1 (b),ALT和AST水平的老鼠模型组显著增加( P < 0.01 )与对照组相比。血清ALT和AST浓度显著降低口服后AR 5.4克/公斤和10.8克/公斤( P < 0.01 )。随后,COL-IV的血清HA、LN、PCⅲ可以反映肝纤维化程度的检查( 22]。如数据所示 1 (c)- - - - - - 1 (f)COL-IV的血清水平,模型中HA、LN、PCⅲ组明显高于对照组( P < 0.01 )。基于“增大化现实”技术的抑制作用的水平COL-IV, HA、LN、PCⅲ是剂量依赖性。特别是COL-IV的血清HA、LN、PCⅲ明显减少10.8克/公斤AR组( P < 0.01 )。

然后,hematoxylin-eosin马森(他)染色和染色是用来观察肝组织的病理变化 21, 23]。他的结果显示,对照组正常的肝组织结构没有形态变化。CCl的长期₄治疗大鼠显示,他们的肝脏局部坏死,伴有严重脂肪变性和炎症细胞浸润肝小叶中央静脉周围。相比之下,肝损伤的程度,基于“增大化现实”技术治疗组脂肪变性、炎症浸润减少剂量依赖性的方式(图的不同程度 2(一个))。马森肝段染色,蓝色区域代表了胶原蛋白沉积。结果表明,大量的胶原蛋白沉积在肝窦的模型组。基于“增大化现实”技术可以有效地减少胶原蛋白沉积,改善肝纤维化(图 2 (b))。上述结果证实,三地₄全身的大鼠肝纤维化模型是成功的,并基于“增大化现实”技术能有效地改善在大鼠肝纤维化。

临床数据表明,炎症是一个关键因素在肝纤维化的进展 24]。il - 6,作为一个经典的促炎细胞因子生物标志物,用于临床诊断慢性肝纤维化( 25]。肿瘤坏死因子- α能促进活化肝星状细胞的生存,促进肝纤维化的发展( 26]。据报道,血清il - 1 β血吸虫病引起的肝纤维化患者显著增加( 24]。因此,我们检测到的表达il - 6、TNF - α,il - 1 β老鼠的定量rt - pcr。mRNA水平的il - 6、TNF - α,il - 1 βCCl显著增加吗₄全身组与对照组( P < 0.01 ,图 3)。与基于“增大化现实”技术治疗后,相关基因的表达减少剂量依赖性的方式( P < 0.05 , P < 0.01 )。结果表明,基于“增大化现实”技术对创新领导力的治疗效果₄全身的老鼠的肝脏炎症。

文献研究发现,HMGB1肝纤维化患者细胞因子丰富充实,TLR4 / / NF -介导的 κB信号通路是肝脏无菌性炎症的重要途径之一。因此,我们测试了HMGB1的表达水平,TLR4 Myd88和NF - κB p65,关键信号通路在肝纤维化大鼠的目标。定量rt - pcr和免疫组织化学(包含IHC)方法被用来检测HMGB1的表达和亚细胞定位。如数据所示 4(一)- - - - - - 4 (e)在对照组,HMGB1主要是位于肝细胞的细胞核,很少在细胞质或正弦曲线。模型组,HMGB1免疫反应性门静脉周的观察,桥在肝脏纤维化区域。此外,计算机辅助半定量的分析表明,基于“增大化现实”技术治疗缓解HMGB1的表达较模型组(图 4 (f), P < 0.05 , P < 0.01 )。

此外,HMGB1的mRNA表达也用rt - pcr方法量化。结果表明,高剂量的基于“增大化现实”技术可以显著降低HMGB1的mRNA的表达,这与IHC方法的结果是一致的。这些结果证明,基于“增大化现实”技术可以减少HMGB1的表达(图 4 (g))。随后,定量rt - pcr用于检测TLR4 Myd88,和愤怒的mRNA水平模型组明显高于对照组(数字 4 (h)- - - - - - 4 (j), P < 0.01 )。与基于“增大化现实”技术治疗后,相关基因的表达减少剂量依赖性的方式( P < 0.05 , P < 0.01 )。西方墨点法用于检测NF的表达水平 κB p65与肝纤维化大鼠的肝脏。如数据所示 4 (k)- - - - - - 4(左)的免疫印迹乐队NF - κB p65模型组比对照组明显厚,和统计结果显示显著差异( P < 0.01 )。基于“增大化现实”技术治疗后,NF -的表达 κB p65减少剂量依赖性的方式,特别是在5.4克/公斤AR组和10.8克/公斤AR组( P < 0.01 )。这些结果表明,基于“增大化现实”技术可以改善肝脏炎症的表达下调HMGB1 / TLR4 / / NF - κB信号通路。

肝星状细胞是肝纤维化的核心细胞。据报道,HMGB1可以直接激活肝星状细胞( 16]。因此,我们推测,基于“增大化现实”技术可以发挥保护作用,肝纤维化,减少肝星状细胞的激活。 α光滑的肌肉肌动蛋白( αsma)是一种特殊的标志激活肝星状细胞( 27]。在这里,激活肝星状细胞的比率是衡量使用包含IHC方法通过检测 αsma在肝脏组织(图 5)。在对照组中,只有少量的 α门户地区-SMA-positive细胞被发现,这可能是肝动脉。更多的 αCCl -SMA-positive细胞中观察到₄全身组与对照组相比,和 α基于“增大化现实”技术治疗后-SMA-positive细胞显著减少。通过计算机辅助半定量的分析,平均集成光密度(IOD) α-SMA-positive区域的基于“增大化现实”技术治疗组被证实是剂量依赖性的方式比模型组显著降低(图 5, P < 0.01 )。这些结果显示,基于“增大化现实”技术能减少肝星状细胞的活化,肝纤维化的关键细胞。

接下来,包含IHC方法被用来检测数据中的i型胶原的表达 6(一)- - - - - - 6 (e)、I型胶原蛋白沉积在肝小叶门静脉老鼠CCl处理₄就显著增加。与基于“增大化现实”技术治疗后,I型胶原蛋白的表达和沉积在肝脏明显抑制,尤其是在组剂量为10.8克/公斤。I型胶原immunopositive地区的半定量的分析进一步证实了上述结果(图 6 (f))。均值IOD I型胶原蛋白的基于“增大化现实”技术管理组显著降低剂量依赖性的方式相比,模型组( P < 0.01 )。之前报道,HMGB1与愤怒的受体调节I型胶原蛋白的表达( 17]。因此,我们探讨AR的表达的影响下游HMGB1的目标,如愤怒、p-MEK1/2, p-ERK1/2, p-cJun, I型胶原蛋白。免疫印迹法检测的表达愤怒,p-MEK1/2, p-ERK1/2, p-cJun蛋白质经过政府的基于“增大化现实”技术(数字 6 (g)- - - - - - 6 (k))。愤怒的蛋白质、p-MEK1/2 p-ERK1/2, p-cJun CCl只在明显增加₄全身组与对照组( P < 0.05 , P < 0.01 )。与模型组相比,高剂量管理组AR的表达明显减少愤怒,p-MEK1/2 p-ERK1/2, p-cJun(数字 6 (h)- - - - - - 6 (k), P < 0.05 , P < 0.01 )。