1。介绍
呼吸道疾病在猪畜牧业的主要健康问题。猪呼吸道疾病通常是两个主要的结果和机会性感染
1]。猪呼吸道疾病综合症是一种具有经济意义呼吸道疾病,其特征是降低饲料效率,增长缓慢,咳嗽,发烧和呼吸困难
2]。呼吸道疾病在猪身上往往导致肺炎复杂投机取巧的细菌感染。氧化应激是关键的开发和进展的肺炎,因为释放活性氧(罗斯)肺泡巨噬细胞和中性粒细胞炎性肺组织(
3,
4]。罗斯引起蛋白质的氧化、DNA和脂质,可能导致肺损伤。氧化应激增加伴随着减少内源性抗氧化防御系统可能引起炎症性肺部疾病如哮喘。
刚断奶的仔猪常患呼吸道疾病,如肺炎,因为他们遇到巨大的环境压力,如改变饮食或感染,导致消化问题或增长缓慢
5- - - - - -
8]。因此,抗生素通常添加到饲料刚断奶的小猪促进经济增长,防止呼吸道疾病(
9,
10]。因为担心抗生素残留和抗生素耐药性细菌,预防呼吸道疾病的替代饲料添加剂的发展在小猪是至关重要的
11,
12]。草药提取物可以作为替代药物,因为他们的抗菌活性和抗病毒性质(
13- - - - - -
16]。草本提取物制剂在中国被广泛用于治疗儿童肺炎(
17]。
最近的研究表明,刚断奶的小猪经常体验肺炎与血管紧张素转换酶2 (ACE-2)的高表达。ACE-2 SARS-CoV-2的关键受体,与COVID-19[爆发
18]。COVID-19患者、高ACE-2表达式被确认在肺肺泡细胞,和一些患者严重肺炎(
19]。我们之前发现Guizhi Li-Zhong唐(GLZ)可以作为一个替代饲料添加剂显著降低ACE-2表达式在小猪的肺组织与虚假的或抗生素治疗(
20.]。尽管GLZ可以用于治疗肺炎在刚断奶的仔猪通过减少ACE-2表达式在肺组织,相关保护机制还没有系统的研究。这项研究调查了GLZ机制作为饲料添加剂,防止肺炎的肺组织刚断奶的小猪。
2。材料和方法
2.1。GLZ草药配方制备
在这项研究中,GLZ被选为另一种饲料添加剂,取得台湾专利(NTNU-P10843)。GLZ主要由Guizhi Li-Zhong唐在特定比例,用量是1 - 2公斤的GLZ每1000公斤的饲料。所有中药材料购买Sun-Ten制药公司(新台北市,台湾)。药用成分重量百分比如下:Guizhi 5 - 40%,人参10 - 25%,甘草10 - 25%,
白术macrocephala10 - 35%,生姜10 - 25%。正如我们之前的研究(
20.),我们分析了生物活性标记化合物GLZ通过三维色谱法。
2.2。化验后的枯氏细胞0.2% GLZ治疗
GLZ的抗氧化活性是评估通过一个1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH、D9132 Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)测定。DPPH实验方法是类似于在我们先前的研究
21];0.2%的DPPH自由基清除GLZ治疗进行了分析使用DPPH在甲醇的混合物。枯氏细胞的细胞毒性的0.2% GLZ治疗评估用a3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT、M5655 Sigma-Aldrich有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国)测定。枯氏细胞(SCC119)获得Sigma-Aldrich有限公司(圣路易斯,密苏里州,美国)。GLZ治疗24小时后0.2%,枯氏细胞的可行性进行了分析和量化使用MTT测定有或没有脂多糖(LPS) (l - 2654, Sigma-Aldrich)治疗。
2.3。动物的准备
共有94名男性刚断奶的小猪被随机分为三组,接受假,0.2% Tilmicosin抗生素(选项卡),或0.2% GLZ治疗和饲养4至10周的年龄在大丰牧场(台湾云林县)在无菌条件下的恒温25°C 24小时光暗周期。在10周的年纪,共有12个刚断奶的小猪(每组3)随机选择和牺牲肺组织样本。我们的小猪实验后3 r(替代、减少和细化)原则和实验室动物保健和使用指南(许可证号码:台湾/动物/不使用。109007)。
2.4。繁殖率和血液免疫球蛋白
我们记录繁殖率的变化每隔2天从4到10周的年龄骗局,GLZ治疗组选项卡中,0.2%和0.2%。在10周的年纪,收集血液样本从每组的小猪。通过使用夹心免疫球蛋白G(免疫球蛋白)酶联免疫吸附测定试剂盒(e4472 - 100和e4476 - 100;BioVision,苗必达、钙、美国),分析了血液中免疫球蛋白含量Multiskan去微型板块分光光度计读者(美国热科学、沃尔瑟姆,MA)根据制造商的指示。
2.5。咳嗽发生率和血液学
通过连续的视频和音频分析获得相机设置高于猪的房子,我们计算和记录咳嗽的发生率从4到10周的所有治疗组的年龄。在10周的年纪,小猪的血液学分析每个治疗使用ProCyte Dx进行血液学分析仪(IDEXX实验室、韦斯特布鲁克、我,美国),这是一个自动化的血液学分析仪评估24参数在动物血液样本在大约2分钟。
2.6。免疫组织化学染色
在10周的年纪,肺组织收集从每组的小猪。肺组织固定在4%甲醛和嵌入石蜡。肺组织样本切成5
μm部分通过使用切片机,这些部分被安装在载玻片上染色。苏木精和伊红染色()),一套(Sigma-Aldrich公司,圣路易斯,密苏里州,美国)是用于肺组织形态。免疫组织化学染色(包含IHC)使用SOD2的抗体,3 nt, TNF -
αNF -
κB, caspase-3(细胞信号技术,丹弗斯、马、美国)在肺组织评估他们的表现。此外,3、3′-diaminobenzidine发色体(Novolink聚合物检测系统l),其次是与苏木精复染色(Novolink聚合物检测系统l)。
2.7。西方墨点法
小猪的肺组织提取使用缓冲类似用于我们的先前的研究。肺中提取蛋白质分离使用10%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(Bionovas Inc .)、多伦多,安大略省,加拿大),涂抹在硝化纤维膜。膜SOD2处理,3 nt, TNF -
αNF -
κB, caspase-3,
β肌动蛋白抗体(热费希尔科学Inc .)。二次抗体和化学发光底物(美国通用电气医疗集团生命科学、巴林顿,美国)也用于诱导化学发光检测到一个拉斯维加斯- 4000(通用电气医疗生命科学Inc .)。免疫印迹的光密度是评价ImageJ(版本1.48 t, NIH,华盛顿,美国)。
2.8。统计分析
血液免疫球蛋白水平,嗜酸性粒细胞百分比,咳嗽发生率,SOD2的相对表达,3 nt, TNF -
αNF -
κB, caspase-3表示为平均值±标准错误。统计分析进行了使用单向方差分析其次是Student-Newman-Keuls多重比较期末测验。
一个
p
值< 0.05被认为是显著的。
3所示。结果
3.1。抗氧化能力和枯氏细胞生存能力
的抗氧化能力和细胞毒性GLZ测定通过DPPH和MTT检测,分别。图
1(一)在每一组中显示DPPH自由基清除活性也显著大于GLZ更高浓度(
p
<
0.01
)。研究结果表明,GLZ治疗有很高的抗氧化能力,可以清除有害自由基。图
1 (b)的枯氏细胞生存能力表明GLZ治疗低细胞毒性枯氏细胞(
p
<
0.05
)。因此,0.2% GLZ作为抗生素药物治疗可能是适合刚断奶的小猪,因为它的抗氧化活性和较低的细胞毒性。如图
1 (b)B, GLZ治疗可以减轻LPS-induced损害枯氏细胞(
p
<
0.01
)。
抗氧化能力和细胞毒性GLZ治疗。(一)DPPH自由基清除活性与GLZ浓度显著增加。(
n为每个组= 3)。(b) MTT测定在不同浓度的GLZ治疗没有(一个)有限合伙人)和(b) + LPS)有限合伙人的待遇。无论有限合伙人治疗,枯氏细胞生存能力GLZ治疗(5 - 20毫克/毫升)明显大于虚假治疗(
n为每个组= 3)。数据显示为平均值±标准平均误差(
∗
∗
p
<
0.01
单向方差分析,其次是Student-Newman-Keuls多重比较期末测验)。
3.2。存活率、血液中免疫球蛋白含量和肺炎
图
2(一个)显示存活率的变化在刚断奶的小猪接受虚假的,0.2%的标签,0.2% GLZ治疗从4到10周的年龄。仔猪的成活率接受虚假的治疗方法是低于0.2%的选项卡接受了治疗,0.2% GLZ治疗。图
2 (b)介绍了血液中免疫球蛋白含量在小猪的血为每个治疗10周的年龄。小猪收到GLZ治疗有显著(0.2%
p
<
0.01
)血液中免疫球蛋白含量高于小猪虚假或0.2%选项卡接受了治疗,因此可能有优越的免疫功能。图
2 (c)显示)肺组织的污渍刚断奶的小猪在10周的年龄接到骗局后,GLZ治疗选项卡中,0.2%和0.2%。肺炎肺组织中可观察到的小猪收到虚假和0.2%标签治疗而不是观察肺组织的小猪收到0.2% GLZ治疗。这些结果符合更高的存活率和免疫球蛋白水平观察小猪GLZ收到0.2%。因此,0.2% GLZ治疗可能是一个有用的抗生素药刚断奶的小猪,因为它能够提高免疫功能。
GLZ治疗增加存活率和血液免疫球蛋白免疫球蛋白水平,防止肺炎在刚断奶的小猪。(一)在仔猪存活率的变化从4到10周的年龄接受虚假的,GLZ治疗选项卡中,0.2%和0.2%。(b)在仔猪血液中免疫球蛋白含量为每一个治疗10周的年龄。值是平均值±标准平均误差(
n为每个组= 3;
∗
∗
p
<
0.01
,
∗
p
<
0.05
单向方差分析,其次是Student-Newman-Keuls多重比较期末测验)。(c)代表他走时污渍肺组织的小猪在每个治疗10周的年龄。肺炎是虚假的肺组织中观察到,选项卡组而不是0.2% GLZ组0.2%。比例尺条= 150
μm。
3.3。过敏性嗜酸性粒细胞水平和咳嗽发生率
我们检查了过敏性的血液中嗜酸性粒细胞水平每次治疗后10周大的小猪。如图
3(一个)礼物,0.2% GLZ治疗显著降低过敏性的仔猪血液中嗜酸性粒细胞(
p
<
0.01
)。我们进一步研究了咳嗽发生率在小猪从4到10周的年龄。图
3 (b)显示,咳嗽发生率结果符合过敏性的嗜酸性粒细胞的水平。因此,0.2% GLZ治疗可能有效的替代医学衰减呼吸道过敏在刚断奶的小猪。
过敏性嗜酸性粒细胞水平和咳嗽发生率。(一)血液学分析仔猪在10周的年龄接受(a)骗局,选项卡(B) 0.2%, (c) 0.2% GLZ治疗。过敏性嗜酸性粒细胞在红色圆圈标记。嗜酸性粒细胞的小猪从4到10周的年龄每个治疗(
n为每个组= 3)。(b)咳嗽发生率在小猪从4到10周的年龄接受虚假的(
n选项卡(= 31),0.2%
n= 31),0.2% GLZ治疗(
n= 32)。值是平均值±标准平均误差(
∗
∗
p
<
0.01
,
∗
p
<
0.05
单向方差分析,其次是Student-Newman-Keuls多重比较期末测验)。
3.4。Antioxidant-Related SOD2和Oxidative-Stress-Related 3 nt表达的肺部组织
确定GLZ治疗的抗氧化效果,的表达antioxidant-related SOD2和oxidative-stress-related 3 nt在10周大了小猪的肺部组织。IHC染色显示在图中
4(一)表明SOD2的肺组织高表达小猪收到GLZ治疗但低对于那些接受虚假的治疗。免疫印迹分析的结果呈现在图
4 (b)并证明antioxidant-related SOD2表达式的小猪收到GLZ治疗显著高于小猪接受虚假的或0.2%选项卡治疗(
p
<
0.01
)。图
5(一个)表明3 nt低表达在肺组织接收0.2% GLZ治疗和更高的小猪小猪收到假的治疗。图
5 (b)表明oxidative-stress-related 3 nt的表达式小猪收到0.2% GLZ和标签治疗明显低于小猪收到假的治疗(
p
<
0.01
)。数据
4和
5显示,0.2% GLZ治疗缓解氧化应激在小猪的肺部组织。
草药配方GLZ治疗可以增加antioxidant-related SOD2表达式在刚断奶的小猪的肺组织。(一)代表包含IHC染色SOD2表达式的小猪每次治疗后10周的年龄。SOD2表达式是由深棕色表示。规模的酒吧是30
μ对于大型图像和150
μ米小图像。(b)在肺组织免疫印迹SOD2表达的小猪在每个治疗后10周的年龄(
n为每个组= 3)。值是平均值±标准平均误差(
∗
∗
p
<
0.01
,
∗
p
<
0.05
单向方差分析,其次是Student-Newman-Keuls多重比较期末测验)。
GLZ治疗减少表达oxidative-stress-related 3 nt的肺组织刚断奶的小猪。(一)代表包含IHC染色3 nt表达式的小猪在假后10周的年龄,GLZ治疗选项卡中,0.2%和0.2%。3 nt表达式是由深棕色表示。规模的酒吧是30
μ对于大型图像和150
μ米小图像。(b)肺组织免疫印迹3 nt表达的小猪在每个治疗后10周的年龄(
n为每个组= 3)。值是平均值±标准平均误差(
∗
∗
p
<
0.01
单向方差分析,其次是Student-Newman-Keuls多重比较期末测验)。
3.5。炎症相关的肿瘤坏死因子-α<斜体> < /斜体>和NF -κ<斜体> < /斜体> B表达的肺部组织
确定GLZ治疗的抗炎作用,炎症相关的肿瘤坏死因子的表达式
α和NF -
κB在肺组织的10周大的小猪是检查每个治疗组。图
6(一)揭示了TNF -
α肺组织中表达很低的小猪收到0.2% GLZ治疗但高对于那些接受虚假的治疗。免疫印迹分析的结果呈现在图
6 (b)显示,炎症相关的肿瘤坏死因子-
α表达式的小猪收到0.2% GLZ治疗明显低于接受虚假的小猪和0.2%的治疗选项卡(
p
<
0.01
)。图
7(一)揭示了NF -
κB表达在肺组织低小猪收到0.2% GLZ治疗但高对于那些接受虚假的治疗。图
7 (b)表明,炎症相关的NF -
κB表达在接收GLZ和0.2%的小猪选项卡中治疗明显低于在小猪收到虚假治疗(
p
<
0.01
-0.05)。数据
6和
7显示,0.2% GLZ治疗缓解炎症在小猪的肺部组织。
减少炎症相关的TNF的表达——GLZ治疗
α肺组织的刚断奶的小猪。(一)代表包含IHC染色TNF -
α小猪的表达在假后10周的年龄,GLZ治疗选项卡中,0.2%和0.2%。肿瘤坏死因子-
α表达式是由深棕色表示。规模的酒吧是30
μ对于大型图像和150
μ米小图像。(b)对肿瘤坏死因子-免疫印迹
α肺组织表达的小猪在每个治疗10周后(
n为每个组= 3)。值是平均值±标准平均误差(
∗
∗
p
<
0.01
单向方差分析,其次是Student-Newman-Keuls多重比较期末测验)。
GLZ治疗减少炎症相关的NF -的表情
κB在肺组织的刚断奶的小猪。(一)代表包含IHC染色NF -
κB表达在小猪在假后10周的年龄,GLZ治疗选项卡中,0.2%和0.2%。NF -
κB表达式是由深棕色表示。规模的酒吧是30
μ对于大型图像和150
μ米小图像。(b)对NF -免疫印迹
κB表达在小猪的肺组织在每个治疗后10周的年龄
n为每个组= 3)。值是平均值±标准平均误差(
∗
p
<
0.05
单向方差分析,其次是Student-Newman-Keuls多重比较期末测验)。
3.6。Apoptosis-Related Caspase-3表达的肺部组织
确定凋亡GLZ治疗的能力,表达apoptosis-related caspase-3在肺组织检查在每个治疗组10周大的小猪。IHC染色结果显示在图
8(一个);caspase-3表达式在肺组织低小猪收到0.2% GLZ治疗但高小猪收到虚假的治疗。图
8 (b)显示结果的免疫印迹分析apoptosis-related caspase-3表达式在接收GLZ和0.2%的小猪选项卡中治疗明显低于在小猪收到虚假治疗(
p
<
0.01
)。结果在图
8证明0.2% GLZ治疗可以减轻细胞凋亡在小猪的肺部组织。
GLZ治疗减少表达apoptosis-related caspase-3刚断奶的小猪的肺组织。(a)代表包含IHC染色caspase-3表达在小猪在假后10周的年龄,GLZ治疗选项卡中,0.2%和0.2%。Caspase-3表达式是由深棕色表示。规模的酒吧是30
μ对于大型图像和150
μ米小图像。(b)肺组织免疫印迹caspase-3表达的小猪在每个治疗后10周的年龄(
n为每个组= 3)。值是平均值±标准平均误差(
∗
∗
p
<
0.01
单向方差分析,其次是Student-Newman-Keuls多重比较期末测验)。
4所示。讨论
草药配方GLZ研究作为替代医学刚断奶的小猪。公式可以减轻呼吸道过敏和预防肺炎在刚断奶的小猪在呼吸系统中通过抑制ACE-2表达式(
20.]。然而,关于底层的药理机制所知甚少。刚断奶的小猪经常体验呼吸道疾病,如肺炎,因为他们遇到巨大的环境压力
5- - - - - -
8]。因此,抗生素通常用于猪饲料系统。然而,抗生素的过度使用会导致抗生素耐药性。欧盟禁止使用抗生素生长促进剂2006年猪饲料。因此,取代抗生素类药物与中药或天然产物可以实实在在的利益。体外实验的结果表明,GLZ具有较高的抗氧化清除自由基的能力(图
1(一))和低枯氏细胞细胞毒性(图
1 (b))。因此,GLZ治疗可能是有用的作为一个替代医学刚断奶的小猪。
刚断奶的小猪,草药配方GLZ治疗可以提高生存率(图
2(一个)免疫球蛋白水平(图)和免疫相关
2 (b))。小猪GLZ对待治疗相比,这些小猪和虚假的治疗选项卡显示不同程度的肺炎,过敏性嗜酸性粒细胞水平较高(图
3(一个)),和更频繁的咳嗽发生率(图
3 (b))。肺炎在刚断奶的仔猪可能是由于呼吸道感染。选项卡的治疗可能会杀死有害的病毒、细菌、寄生虫等微生物,但也可能杀死益生菌在胃肠道。相比之下,GLZ治疗有抗氧化性质并能提高仔猪的免疫功能,也就是说,他们有能力抵抗有害的病毒、细菌、寄生虫和其他微生物,在不伤害有益的益生菌在胃肠道。这或许可以解释为什么GLZ比标签防止小猪肺炎。
通过包含IHC和肺组织免疫印迹分析,我们发现小猪的表达明显高于接受0.2% GLZ治疗antioxidant-related SOD2(图
4),但较低的表达oxidant-related 3 nt(图
5),炎症相关的肿瘤坏死因子-
α(图
6)和NF -
κB(图
7),apoptosis-related caspase-3(图
8)比小猪收到标签或虚假的治疗。因此,GLZ治疗可能有保护性的抗氧化,抗炎,抗凋亡作用,减轻肺炎在刚断奶的小猪呼吸系统。
Guizhi GLZ的一个组成部分,是一种传统的中药制剂,用于治疗head-related疾病,如发热、头痛、出汗、和风致头痛
22]。色谱的调查Guizhi在我们先前的研究
20.)透露,其生物活性物质是香豆素、肉桂酸、肉桂醛、2-methoxycinnamaldehyde。香豆素被用于各种产品和候选药物因为香豆素化合物具有较高的生物利用度,抗氧化和消炎作用[
23]。肉桂酸及其衍生物(如阿魏酸和肉桂酰胺)吸引了大量的关注由于其抗氧化,抗炎和神经保护属性(
24]。肉桂醛,树皮的主要组成部分
肉桂已经被报道,抗氧化,抗炎,抗菌性能
25,
26]。2-Methoxycinnamaldehyde还演示了抗氧化和抗炎作用
27]。此外,肉桂醛和2-methoxycinnamaldehyde都确认为NF -
κB抑制剂(
28]。NF -
κB是至关重要的细胞死亡的规定,炎症和免疫反应调节趋化因子的表达,如肿瘤坏死因子-
α以及凋亡蛋白(
29日,
30.]。
GLZ的其他组件,Li-Zhong Tang首次提到的中药经文专著1800年前发热性疾病,通常用于传统医学“中间娇”(即温暖。降低胃),驱散寒冷,活血化瘀
气(生命力),加强肾脏(
31日]。色谱分析Li-Zhong唐显示生物活性标记化合物甘草甙;甘草甜素;人参皂苷的Rg1、再保险和Rb1;atractylenolide三世;6-gingerol;和6-shogaol
20.]。甘草甙,甘草基数的一个主要的组成部分,可能产生抗氧化,抗炎,通过抑制NF -和凋亡的影响
κB和MAPK信号通路(
32]。甘草甜素,甘草基数的另一个生物活性成分,具有抗氧化和抗炎特性在肝脏疾病治疗
33]。皂苷含量Rg1和再保险报道减少氧化应激和减弱心肌细胞凋亡在治疗糖尿病大鼠
34]。人参皂苷Rb1抗氧化和消炎作用,可以通过衰减NF -改善急性肺损伤
κB和MAPK激活(
35]。Atractylenolide三世的生物活性成分Atractylodis根茎,据报道,减弱的转录活动NF -
κB和治疗炎症相关的神经退行性疾病(
36]。6-Gingerol鲜姜最丰富的活性化合物,和6-shogaol 6-Gingerol脱水的形式。6-gingerol和6-shogaol都有抗氧化和消炎作用[
37),与6-shogaol优越。6-shogaol DPPH自由基清除活性也比6-gingerol [
38]。在回顾所有的草药配方GLZ生物活性标记物质,我们观察到,几乎所有有抗氧化,抗炎,抗凋亡的属性可能有助于预防或减轻肺炎。