1。介绍
中风严重残疾的主要原因,严重威胁人类健康。它造成了严重的社会和经济负担
1,
2]。超早期静脉内溶栓(4.5小时)rt-PA目前最常用的治疗急性脑梗死的方法。然而,由于狭窄的“时间窗”,出血风险高,国民健康意识不足,可怜的医疗资源分配,和我国交通拥堵问题,实际的溶栓率小于30% (
3]。因为这些限制,大多数患者不能得到及时有效的治疗(
4]。动脉内的接触溶栓、机械溶栓、直接支架植入,和其他技术近年来已经逐渐出现,因此延长治疗时间窗,使闭塞血管再通率达到71% (
5- - - - - -
7]。然而,患者预后良好的血管再通还不到46%。
急性缺血性脑梗死治疗的核心原则有两个:防止不可逆损伤的扩张和拯救可逆缺血组织(也称为缺血半影)[
8]。低温疗法是目前公认世界上为数不多的几个有效的神经保护策略(
9- - - - - -
14]。事实上,由于其积极的神经保护效应,轻度低体温一直在全球范围内用于脑保护在新生儿缺氧缺血性脑病(
15,
16),创伤性脑损伤(
17,
18),和心脏复苏术
19]。临床上,物理降温的主要限制是延迟冷却启动和目标温度。末开始需要延长冷却时间,这就需要广泛的医疗和护理工作,并导致继发性并发症(
20.]。考虑interischemia体温过低,其好处已被证明在心脏研究,它改善了患者的预后
21]。然而,目前尚不清楚interischemia低体温在急性缺血性中风减少组织损伤。
研究表明,低温治疗可以通过抑制发挥神经保护作用的活动烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)和减少活性氧簇(ROS)的一代(
22,
23]。氮氧化物活化是脑损伤的重要机制,它可以进一步加重高卒中后葡萄糖代谢。缺血性中风的发生后,ATP的半影正在迅速耗尽,和脑组织产生大量降低NADPH通过缺氧通过磷酸己糖旁路代谢途径。氮氧化物的作用下,产生大量的活性氧,从而导致氧化应激损伤(
24- - - - - -
26]。先前的研究已经证明,氮氧化物基因敲除小鼠(
27[]或氮氧化物抑制剂干预
28)能成功地抑制活性氧的生产,从而减少氧化应激损伤后缺血(
29日,
30.]。此外,我们先前的研究已经发现,药物引起再灌注后低温抑制氮氧化物的活动,减少ROS的产生,并减少随之而来的氧化应激,从而发挥神经保护作用[
31日]。
在这项研究中,我们确定是否interischemia低温诱导的药理方法诱导较强的神经保护大脑通过抑制氮氧化物的活动,减少活性氧的生产。如果成功的话,这项研究在血管再通治疗急性脑梗死提供了一种有效的治疗方法,为临床提供基础参考转换。这样,中风患者接受药物治疗体温过低,医疗和护理就会减少血管再通之前努力保护大脑免受进一步伤害。
2。材料和方法
2.1。主题
所有实验协议是动物保健和使用委员会批准,首都医科大学,北京,中国,根据美国国立卫生研究院(NIH的贝塞斯达,医学博士,美国)指导实验室动物保健和使用的。所有成年男性的雄性sd大鼠中(河280 - 320克,至关重要的实验动物科技有限公司有限公司,北京,中国)被随机分为4组(图
1(一)):(1)sham-operated集团没有大脑中动脉阻塞(MCAO);(2)中风组没有药理体温过低(MCAO 2 h);(3)中风组再灌注前药理低温处理1 h (interischemia体温过低)(MCAO 2 h / 1 h);和(4)中风组再灌注后药理治疗体温过低(inter-reperfusion体温过低)发起(MCAO 2 h / 2 h)。进一步分为三个亚组,每组8老鼠在每个子群。氯丙嗪和异丙嗪dihydrocapsaicin (DHC)被用来诱导体温过低。所有的实验过程和数据分析随机,盲法的方式进行。再灌注24小时时,神经赤字和梗塞体积在每组检查,和生化分析进行。
体温2 h MCAO大鼠在不同时间点有或没有体温过低。
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2.2。局灶性脑缺血
程序已经被我们前面描述的
31日]。动物们接受了手术开始前禁食12小时。动物麻醉室与1 - 3%异氟烷和70%氧化亚氮和30%氧气的混合和1%异氟烷和维护。一个2 h对MCAO诱导使用管腔内的丝(
32]。在操作期间,体温(直肠温度),血液pH值,pCO2和阿宝2,平均动脉压(MAP)都监控。激光多普勒是用于监测血流MCA-supplied地区以确保模型的成功。
2.3。药理体温过低
在所有的缺血模型2 h MCAO再灌注后,1:1的比例氯丙嗪和异丙嗪(C + P) 4毫克/公斤3毫升的盐水结合dihydrocapsaicin (DHC)剂量的0.5毫克/公斤(
33)是腹腔内注射,如我们之前所述
31日在1或2 h后缺血。为了保持和提高药物的疗效,第二次注射与初始剂量的1/3是交付2 h。
2.4。体温监测
直肠温度(体温)监测在30分钟或1 h增加之前的体温过低,直到它返回到初始水平。
2.5。脑梗死体积
老鼠用1%水合氯醛麻醉,脑缺血大鼠的脑组织被立即切成七冠状部分(2毫米厚),美国(如前所述
34]。部分是沾染了2、3、去除氯(美国σTTC) 37°C。ImageJ图像分析软件是用来测量脑梗死体积。为了减少错误造成的脑水肿,脑梗死体积测量间接使用间接计算方法,相对于noninfarcted半球。
2.6。神经赤字
神经功能赤字是由5-scoring系统(
32手术前,2 h后中风和再灌注后24小时。得分越高表明更严重的神经缺陷。
2.7。ROS生产测量通过流式细胞仪测定
如前所述,我们(
35),成年人的大脑离解工具包(130-107-677,Miltenyi研究,Bergisch格拉德巴赫,德国)用于大脑细胞隔离。老鼠牺牲在再灌注后6 - 24小时,和正确的半球被切成小块,地面,透过70
μ格拉德巴赫Bergisch m细胞过滤器(Miltenyi研究,德国)获得单细胞悬浮体。使抗体被添加到细胞和孵化37°C为60分钟根据指令。细胞被清洗和分析FACSCalibur流式细胞分析仪与CellQuest软件(美国BD,圣何塞,CA)。结果表达的荧光值。
2.8。氮氧化物亚基的表达和葡萄糖转运蛋白亚型
均化后的孤立脑微血管,试剂盒试剂(表达载体,卡尔斯巴德,CA)是用于提取mRNA根据指令。总RNA被一个高容量然后转化成cDNA cDNA逆转录工具包(应用生物系统公司,培育城市,CA)。利用cDNA、基因表达是由棱镜7500年量化实时PCR(美国应用生物系统公司,CA)。所有反应都表现在下列条件:95°C 15分钟,40 95°C的周期10秒,30秒和60°C。引物的序列的老鼠氮氧化物子单元(gp91phox,p67phox,p47phox,第22位phox),葡萄糖转运蛋白亚型(GLUT1和GLUT3),和GADPH如表所示
1。GADPH用作控制基因确定相对mRNA的表达。
引物进行实时聚合酶链反应(PCR)分析。
| 基因 |
正向引物(5 ' 3 ') |
反向引物(5 ' 3 ') |
| gp91phox |
TGACTCGGTTGGCTGGCATC |
CGCAAAGGTACAGGAACATGGG |
| p67phox |
AGCAGAAGAGCAGTTAGCATTGG |
TGCTTTCCATGGCCTTGTC |
| p47phox |
TCACCGAGATCTACGAGTTC |
ATCCCATGAGGCTGTTGAAGT |
| 第22位phox |
TGTTGCAGGAGTGCTCATCTGTCT |
AGGACAGCCCGGACGTAGTAATTT |
| GLUT1 |
CAGAGCGACAAGACACCTGA |
ACTGAAGAAAGGTGCCCAGG |
| GLUT3 |
GTGGAGCGGTGAAGATCAGATA |
GGCAACAGTAACAGCGAACA |
| GADPH |
CAAGAAGGTGGTGAAGCAG |
AAAGGTGGAAGAATGGGAG |
2.9。统计分析
所有数据都表示为±SE。所有的分析使用GraphPad棱镜v7.0 (GraphPad软件,圣地亚哥,CA)。组之间的差异评估使用单向方差分析(方差分析)与设定的显著性水平
P
<
0.05
。事后对比组进一步使用最小显著差方法执行。
3所示。结果
3.1。生理参数
在血液pH值,没有明显差异2,pCO2两组之间(数据没有显示)。
3.2。体温
interischemia体温过低组下降了2.23°C的温度在30分钟内药物管理局1 h卒中后再灌注前(1 h)和继续降至最低的3.68°C以下初始温度为1.5 h再灌注(图
1)。同时,inter-reperfusion体温过低组,下降了2.92°C被认为在30分钟的药理低温诱导在30分钟再灌注并继续下降到最低的3.75°C下初始温度再灌注2小时时。两组的体温保持在初始测量12 h再灌注。值得注意的是,低体温早些时候达到了1 h interischemia组相比inter-reperfusion体温过低组。
3.3。脑梗死体积和神经赤字
中风组相比没有体温过低,脑梗塞体积最大的再灌注24小时时(48.5%)(数据
2(一个)和
2 (b)),体温过低的两组都明显减少梗塞体积。interischemia体温过低组更大的减少梗塞体积的25.2% (
p
#
#
#
<
0.001
)和32.1% (
p
#
#
<
0.01
)inter-reperfusion低温组。而中风组再灌注24小时时(3.0)(图
2 (c)),同样,interischemia低温组(
p
#
#
<
0.01
)和inter-reperfusion低温组(
p
#
<
0.05
)降低神经功能缺损评分,interischemia体温过低被更多的神经。
卒中后TTC组织学证实脑梗塞体积有或没有体温过低(a, b)。卒中后神经赤字和药理体温过低,使用5分系统系统(c)。
p
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0.05
,
p
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0.01
,
p
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0.001
而MCAO 2 h组(
n= 8)。
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3.4。氮氧化物亚基的表达和葡萄糖转运蛋白亚型
中风组没有体温过低在mRNA的表达显著增加氮氧化物子单元(gp91phox,p67phox,p47phox,第22位phox和24小时再灌注(图6点)
3)。这组相比,低温组观察到显著降低氮氧化物的mRNA表达子单元6和24小时再灌注。再灌注24小时时(数据
3 (b),
3 (d),
3 (f),
3 (h)),interischemia低温组显著减少额外的氮亚基mRNA的表达。
氮氧化物的mRNA表达子单元(gp91phox,p67phox,p47phox,第22位phox)由实时PCR在6和24小时再灌注。
P
∗
<
0.05
,
P
∗
∗
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0.01
,
P
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∗
∗
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0.001
而虚假的集团;
p
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0.05
,
p
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0.01
,
p
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相比MCAO 2 h组;
P
美元
<
0
0。
而MCAO 2 h / 1 h组(
n= 8)。
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显著增加葡萄糖转运体的mRNA表达亚型(GLUT1和GLUT3)也出现在脑缺血大鼠6和24小时再灌注(图
4)。两个低温组观察到显著降低mRNA表达。尽管没有区别interischemia和inter-reperfusion减少葡萄糖转运蛋白亚型mRNA在6小时再灌注(数字
4(一)和
4 (c)),再灌注24小时时(数据
4 (b)和
4 (d)),interischemia低温诱导显著减少mRNA的表达。
葡萄糖转运蛋白亚型的mRNA表达(GLUT1和GLUT3)由实时PCR在6和24小时再灌注。
P
∗
∗
<
0.01
和
P
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∗
∗
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0.001
而虚假的集团;
p
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0.05
和
p
#
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相比MCAO 2 h组;
P
美元
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0
0。
而MCAO 2 h / 1 h组(
n= 8)。
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3.5。ROS生产
中风诱导显著增加活性氧的生产6 - 24小时再灌注(
P
∗
∗
<
0.01
)(图
5)。两种低体温协议大大降低活性氧的生产在6小时再灌注(数字
5(一个)和
5 (c))(
p
#
#
<
0.01
),而interischemia低温组增强减少ROS (
P
美元
<
0
0。
)再灌注24小时时(数据
5 (b)和
5 (d))。
通过流式细胞仪测定ROS生产。
P
∗
<
0.05
和
P
∗
∗
<
0.01
而虚假的集团;
p
#
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0.05
和
p
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0.01
相比MCAO 2 h组;
P
美元
<
0
0。
而MCAO 2 h / 1 h组(
n= 8)。的
x设在荧光值。红色:虚假的;黑色:MCAO 2 h;蓝色:MCAO 2 h / 1 h;黄色:MCAO 2 h / 2 h。
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4所示。讨论
在这项研究中,我们报道了体温过低进行interischemia或者inter-reperfusion减少脑梗死体积,神经赤字,ROS生产,氮氧化物的mRNA表达子单元以及葡萄糖转运蛋白亚型。此外,我们发现interischemia低体温相比,进一步减少了脑损伤的迹象inter-reperfusion在卒中后24小时体温过低。这些研究结果支持我们的假设interischemia体温过低引起的缺血性的药理方法提供了更强的神经保护大脑。
低温疗法在很大程度上取决于几个因素,如起始时间、持续时间、和体温过低的深度
11,
36]。研究表明,低体温应该尽快启动,温度迅速达到目标,和较低的温度维持很长一段时间内更好的神经保护作用[
20.]。一些早期的研究表明,减少体温只有几度,如果它是在缺血早期诱导,可以有显著的神经保护作用[
37- - - - - -
39]。
interischemia体温过低所带来的好处已经被证明在心脏研究(
40,
41]。有研究报道,体温过低再灌注减少心肌梗死的大小之前,节省更多的死亡的心肌细胞,改善心肌梗死的结果。许多研究的动物模型和人体试验表明interischemia体温过低不仅安全可行,而且也对缺血性心肌具有良好的保护作用
42- - - - - -
45]。postreperfusion低体温相比,interischemia体温过低已被证明是更有利于心肌细胞,这可能与核心梗死体积,减少氧化损伤,再灌注后细胞损伤。进一步说明,先前的研究表明,低体温的感应25分钟缺血发作后40分钟总缺血时间导致猪心肌梗死面积减少39%,而低体温再灌注后不会降低心肌梗死体积(
43]。此外,再灌注前达到目标温度是至关重要的减少梗塞大小治疗st段抬高心肌梗死患者肝素)(
46]。
在脑缺血,一些证据支持,早期预防轻度到中度低温诱导在严重创伤性脑损伤患者伤后不久可以降低死亡率和改善神经功能恢复(
47]。丁等人表明,当地大脑体温过低引起再灌注前注入生理盐水,是保持10分钟,其次是完整的再灌注可以减少脑损伤,改善神经功能,保持长期功能恢复(
48]。interischemia体温过低的优点是再灌注前达到目标温度,这不仅可以减少缺血损伤,而且再灌注损伤。因此,它更有利于开始体温过低的治疗脑损伤后尽快。
目前,低温疗法在临床实践中主要是系统性物理降温或血管内intracarotid注入生理盐水(
49- - - - - -
52]。很难建立,缓慢冷却,不能迅速达到目标温度,可以很容易地导致严重心律失常和肺部感染等并发症(
53- - - - - -
55]。因此,目前临床应用的低体温是有限的。相反,药物低体温是更方便,可以达到目标温度前血管再通,没有广泛的医疗和护理工作。这可能有一定的临床应用前景,它可以成为一个更好的选择低温诱导前血管再通(
11]。然而,药物低体温症也有一定的局限性。单药应用效率低和许多并发症。在低剂量药物结合时,他们可以建立一个协同效应,提高低温的效率,减少单个药物的副作用,减少并发症。我们之前的研究表明,氯丙嗪和异丙嗪(C + P)显著降低脑梗塞大鼠的体积和减毒的神经功能缺损
31日,
56]。Dihydrocapsaicin(本公司),一个潜在的辣椒素通道瞬时受体激动剂(TRPV1),也是当前正在研究的是一种很有前途的药物低温诱导物(
57,
58]。独立研究表明,DHC在高剂量能达到有效降低体温疗法,尽管其应用程序仅是有限的由于显著的毒性和并发症(
11,
33]。然而,结合低剂量的C + P,它可能发挥协同效应,提高体温过低的效率,减少单一药物的副作用,减少并发症(
59]。因此,在这项研究中,我们选择了C + P DHC诱导药理体温过低的结合。
低体温症的神经保护作用的机制仍在探索和描述。审查表明,体温过低可能作用于脑缺血级联的几个途径和有不同的在不同的时间点对炎症反应的影响(
60]。ROS扮演着一个重要的角色在缺血性神经元损伤的病理生理过程
23]。NADPH氧化酶复杂生产超氧化物(O2)和缺血和再灌注期间参与活性氧的生产
61年]。炸药ROS主要生产已被证明发生前10 - 15分钟再灌注在MCAO大鼠模型(
22]。在这个模型中,我们的研究表明,interischemia体温过低和inter-reperfusion低温诱导的低剂量的吩噻嗪药物和DHC减少缺血再灌注损伤,保护脑组织,诱导神经保护而没有治疗中风。Interischemia体温过低的治疗或许能更好地引起更强的卒中后神经保护。