1。介绍
肝脏是一个重要的器官的新陈代谢过程中起着重要作用的碳水化合物,蛋白质和脂质,运转正常的肝脏健康至关重要。肝脏疾病引起的代谢功能障碍导致严重的健康问题。非酒精性脂肪肝病(NAFLD),造成代谢紊乱,被认为是肝功能异常的主要原因(
1,
2]。几项研究已经表明,非酒精性脂肪肝可能发展成的结束阶段肝脏疾病和肝细胞癌;它可以不再被视为一个简单的疾病,但严重肝脏疾病的危险因素(
3,
4]。全球在一般人群非酒精性脂肪肝患病率估计约30%,在过去的二十年中翻了一番
5,
6),一个主要关系到人类健康。
胰岛素抵抗,造成长期的、持续的高血糖,导致受损刺激葡萄糖利用率和糖原合成,是代谢综合征的致病特点的关键,现在被认为是最常见的危险因素的发展和发展非酒精性脂肪肝病(NAFLD) [
7]。非酒精性脂肪肝的病理生理学是多种因素引起的
8],如肥胖、胰岛素抵抗[
9),和脂质代谢的调节异常
10),也以一个动态的方式相互作用。直到现在,没有药物治疗或治疗指南已经被批准用于治疗非酒精性脂肪肝(
11),强调需要开发新型治疗非酒精性脂肪肝。
Adlay (
薏苡属lacryma-jobil .),也称为工作眼泪或中国珍珠大麦,是一种药用植物,在台湾已种植广泛,中国和日本。Adlay一直担任营养食品和用于中医多年治疗炎性疾病、疣、神经痛和肿瘤疾病(
12]。多个研究表明adlay生理效应及其生物活性成分在植物的各个部分
13]。Adlay种子的主要药用部分,含有多种生物活性成分,如多糖、coixol,蛋白质,脂类和多酚类物质
14]。几项研究已经表明,adlay种子具有抗炎活性(
12),血糖过低的活动(
15),能够降低血清脂质成分的量(
16[],hypocholesterolemic活动
17),和其他对人类有益的影响(
18]。然而,据我们所知,是知之甚少的影响通过补充adlay种子提取物对饮食fat-induced代谢综合症和非酒精性脂肪肝。
在这项研究中,我们审查的影响ethanolic adlay种子和水提取物对高脂肪饮食——(HFD)诱导代谢失调,非酒精性脂肪肝的状态,肝组织的炎症
在活的有机体内。在我们HFD小鼠模型,动物显示异常脂质和葡萄糖代谢,以及重要的血脂异常和肝脂肪变性的标志。adlay种子提取物改善葡萄糖耐量和预防血脂异常和HFD-induced NAFLD的老鼠。此外,我们利用人类脂肪肝细胞模型通过使用人类永生的主肝细胞,HuS-E / 2细胞,探讨adlay种子提取物改善非酒精性脂肪肝的机制。我们的研究结果提供的证据的使用预防的膳食补充剂adlay种子提取物fat-induced代谢综合征和非酒精性脂肪肝。
2。材料和方法
2.1。制备Adlay种子提取物
Adlay植物(
薏苡属lacryma-jobil . var. ma-yuen Stapf)生长在台中地区农业研究与推广站,台中,台湾。整个adlay谷物磨成20网粉和70%乙醇提取。ethanolic提取adlay种子(日月光半导体;CoiXtreme™, A.T.P.有限公司,台湾)集中与乳糖颗粒粉和使用coixol作为复合指标的浓度620 ppm。水提取物adlay种子(ASW)是由20网把整个adlay谷物磨成粉和提取与水使用超声波浴30分钟50°C(布兰森有限公司)。被认为是水溶性多糖的提取,然后集中,烤箱干在50°C,磨成粉末。然后,ASE和反潜战被储存在−20°C作为功能材料。
2.2。动物
有没有男性C57BL / 6 j小鼠购买国家实验动物中心,台湾,和维护在温控房间12 h光暗周期国立阳明大学动物中心,台湾。他们被安置,有免费的食物和饮用水。标准饮食的老鼠和适应环境1周随后被随机分为四组。ND组(
n= 6)继续正常饮食,而其他三个组(
n每组= 6)切换到高脂肪饮食(HFD集团494千卡/ 100 g, 45%的能量以脂肪;TestDiet Inc .)、美国),HFD混合了1%(重量重量)ethanolic提取adlay种子ASE组(1%),和HFD混合了3%(重量重量)水提取物adlay种子(3%反潜战组)10周。食品消费和体重每天和每周的衡量,分别。所有的老鼠都牺牲在实验周期结束。血清样本、肝组织和附睾脂肪组织是收获进行进一步分析。实验动物研究委员会批准的协议是国立阳明大学(IACUC没有。1070213),所有程序后指导的实验室动物保健和使用(NIH出版,85 - 23,1996年修订)的指导方针和动物福利法案,台湾。
2.3。血糖、血清胰岛素,腹腔内葡萄糖耐量试验和内稳态模型评估胰岛素抵抗指数
分析血糖、血清胰岛素,腹腔内葡萄糖耐量试验,和内稳态模型评估胰岛素抵抗指数进行如前所述[
19]。
2.4。生化特性
血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(为),谷氨酸草酰乙酸的转氨酶(得到),谷氨酸丙酮转氨酶(GPT),肌酐(CRE)和血液尿素氮(BUN)测定使用酶化验设备和富士DRI-CHEM分析仪(富士胶片、东京、日本)。低密度脂蛋白胆固醇(年龄组)水平计算TC−(为+ TG / 5) (
20.]。
2.5。甘油三酸酯和胆固醇肝组织的分析
肝甘油三酯和胆固醇决定执行的方法如前所述[
19]。
2.6。细胞系
HuS-E / 2细胞,请提供Kunitada Shimotohno(日本京都大学),种植如前所述[
21]。产生脂肪肝细胞模型,HuS-E / 2细胞融合与0.1毫米孵化70%油酸(OA) 18 h。
2.7。抗体和免疫印迹分析
抗体AMPK, ACC,扣带皮层部位(Ser79)和微管蛋白从GeneTex获得。anti-pAMPK (Thr172)抗体来自细胞信号。的辣根peroxidase-conjugated anti-mouse或anti-rabbit免疫球蛋白抗体来自Abcam。免疫印迹分析如前所述[
19]。
2.8。定量实时聚合酶链反应
总之,总mRNA小鼠肝组织或HuS-E / 2细胞提取TRZOL试剂和反向转录成cDNA通过使用脱氧RT工具包(Yeastern生物技术)。所有qPCR反应进行SYBR绿色PCR反应混合液(应用生物系统公司)。使用StepOne荧光信号数据处理软件。使用的引物是前面描述的
19]。
2.9。统计分析
从所有实验获得的数据显示为±SEM手段。所有的差异都是评估意义使用单向方差分析Dunnett紧随其后的诚实的显著差异事后测试。星号指示值明显不同的控制(
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0.01
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0.001
)。
3所示。结果
3.1。ASE和反潜战改善葡萄糖止血HFD老鼠
确定ASE和反潜战非酒精性脂肪肝的影响,我们使用了一个建立HFD-induced NAFLD的老鼠模型,由喂养一个HFD, HFD老鼠ASE对待或反潜战(图10周
1(一))。身体体重增加和脂肪组织的重量HFD组显著大于ND组(表
1)。这表明HFD小鼠倾向于开发代谢并发症,这符合中央肥胖的主要特征。适量的食物消耗的老鼠在组之间没有显著性差异。有趣的是,3%的肝脏重量反潜战老鼠明显低于HFD老鼠经过10周的饮食(表
1)。
ASE和反潜战对葡萄糖代谢的影响,葡萄糖耐量和胰岛素抵抗在HFD C57BL / 6 j小鼠喂食。(一)实验方法。六个雄性C57BL / 6小鼠被分为四组,正常饮食(ND),高脂肪饮食(HFD), 1% ASE和HFD, 3%反潜战与HFD混合10周。年龄在16周,进行后续分析。(b) 16 h的禁食后血糖水平。(c)规范化IPGTT曲线。数据归一化通过减去基线值(空腹血糖)测量值在每个鼠标。(d)曲线下的面积(AUC) IPGTT血糖的测定。(e) 16 h的禁食后血清胰岛素水平。(f) HOMA-IR指数计算空腹血糖和胰岛素水平。 Data are shown as means ± SEM (
n在每组= 6)。HFD和ND、ASE或反潜战,
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增加的水平。HFD和ND、ASE或反潜战,
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在降低水平。
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治疗10周后小鼠的生理参数。
| 参数 |
HFD |
日月光半导体hfd - 1% |
hfd - 3%反潜战 |
ND |
| 体重(g) |
35.90±1.04 |
37.40±2.72 |
34.78±1.73 |
26.85±0.72
∗
∗
∗
|
| 食物摄入量(g) |
3.92±0.68 |
3.95±0.90 |
3.99±2.66 |
3.59±0.49 |
| 脂肪组织的重量(克) |
2.16±0.16 |
2.02±0.44 |
2.11±0.23 |
0.33±0.07
∗
∗
∗
|
| 肝脏重量(克) |
1.11±0.05 |
1.18±0.15 |
1.02±0.06
∗
∗
|
0.93±0.07
∗
∗
∗
|
(a)和正常饮食;HFD,高脂肪饮食;日月光半导体,ethanolic adlay种子的提取物;反潜战、水提取adlay种子。(b)所有数据显示为±SEM手段,
n每组= 8。不同组的数据与相应的数据来自HFD-fed老鼠。使用学生的差异进行统计学意义
t以及。(c) HFD vs adlay提取物和ND:
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∗
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<
0.01
和
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∗
∗
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<
0.001
表示水平下降。
此外,我们发现连续HFD喂养10周导致空腹血糖显著增加,曲线下面积(AUC) IPGTT,和HFD小鼠的空腹胰岛素(数据
1 (b)来
1 (e)),表明葡萄糖耐量和胰岛素敏感性是受损的。计算HOMA-IR(图
1 (f))证实,胰岛素抵抗被喂养一个HFD诱导。ASE和反潜战显著改善治疗不仅空腹血糖水平的增加,而且葡萄糖耐量和胰岛素抵抗。治疗反潜战也显著避免空腹胰岛素浓度的增加,与HFD组相比,虽然是一个小,类似的效果与ASE进行治疗。这些数据表明,膳食干预与1%的ASE和3%的反潜战十周防HFD-induced增强空腹血糖和胰岛素,以及葡萄糖耐量和胰岛素抵抗。
3.2。日月光半导体和反潜战减毒HFD小鼠高脂血症
血清脂质成分的变化是代谢综合征的特点之一(
22]。因此,血清TG、TC、为和年龄组水平监测评估ASE和反潜战对脂质代谢的影响。我们发现,喂食HFD 10周血清TG水平显著增加,TC,年龄组,导致小鼠高脂血症。有趣的是,增加的血清TG显著预防水平1%的ASE组(图
2(一个)),增加血清TC和年龄组的水平显著预防1%的ASE和3%的反潜战组(数字
2 (b)和
2 (d))。血清水平为从HFD组之间没有显著性差异在日月光半导体或反潜战治疗(图
2 (c))。这些结果表明,干预ASE和反潜战抑制高脂血症在HFD老鼠。
ASE和反潜战对血清脂质水平的影响在HFD C57BL / 6 j小鼠喂食。血清TG (a)的水平,TC (b),高密度脂蛋白胆固醇(c)和non-HDL-C (d)。数据显示为±SEM手段(
n在每组= 6)。HFD和ASE或反潜战,
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p
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0.05
;
∗
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0.01
。
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3.3。日月光半导体和反潜战减轻肝脂肪变性和HFD小鼠肝脏炎症
肝脏,作为脂质稳态的中央监管机构,是一个重要的器官在脂类代谢
23]。脂质代谢的不平衡和代谢障碍有关,可能沉淀保留肝脏内的脂肪和非酒精性脂肪肝的后续发展
24]。我们调查的影响政府的ASE或反潜战在HFD小鼠治疗非酒精性脂肪肝。喂养HFD 10周导致肝脏TG含量显著(31.4%)高于ND组,同时补充ASE 1%或3%反潜战导致肝脏TG含量只有19.3%和4.1%高于ND组(图
3(一个)),这表明ASE和反潜战显著预防HFD小鼠肝脏脂质沉积。各组之间没有差别的肝脏胆固醇(图
3 (b))。)染色显示,大量脂滴堆积在HFD小鼠的肝细胞,与ND老鼠相比,但这阻止了非酒精性脂肪肝的症状ASE或反潜战补充10周(图
3 (c))。此外,检查效果HFD ASE和反潜战在肝脂肪变性的小鼠肝脏,我们确定的变化与脂肪酸合成相关基因
β氧化。基因的表达参与了肝细胞的脂肪从头合成,过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARγ
γ),固醇调节元件结合蛋白1 (SREBP1)和脂肪酸合酶(FAS) HFD组显著高于ND组,而所有的基因都表达在大大降低水平治疗后ASE和反潜战,而HFD集团(数据
3 (d)- - - - - -
3 (f))。转录因子的表达,过氧物酶体proliferator-activatedα受体(PPAR
α)和过氧物酶体proliferator-activatedδ受体(PPAR
δ),脂肪酸有关
β氧化,显著增加了治疗ASE和反潜战,而HFD集团(数据
3 (g)和
3 (h))。数据表明,ASE和反潜战治疗导致的差别upregulation脂肪酸氧化和对这些脂肪酸合成,导致肝脂肪变性的改进。进一步检查小鼠肝脏的炎症,炎症因子TNF -
α和白介素6 (il - 6)进行了分析。结果表明,两种TNF -
α和肝组织中il - 6的高脂肪饮食组高于正常饮食组,表明高脂饮食诱导的肝脏炎症,而治疗ASE 1%或3%反潜战显著降低炎性因子TNF -
α和il - 6,预防肝脏发炎的状态(数据
3(我)和
3 (j))。综上所述,ASE治疗或反潜战阻止HFD小鼠肝脂肪变性。
ASE和反潜战对肝脂肪变性和炎症的影响在C57BL / 6 j小鼠的肝脏HFD美联储。(一)肝脏TG的变化。(b)肝TC的变化。(c)苏木精和伊红染色横向肝部分(原始放大×200)。(d-f)肝新创lipogenesis-related基因表达。(d) PPAR
γ。SREBP-1c (e)。FAS (f)。(g和h)肝
β-oxidation-related基因表达。(g) PPAR
α。(h) PPAR
δ。(我)肝脏炎症因子,肿瘤坏死因子-
α。(j)肝脏炎症因子,il - 6的分泌。数据显示为±SEM手段(
n在每组= 6)。HFD和ASE或反潜战,
∗
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3.4。在老鼠HFD ASE和反潜战改善肝功能
多余的脂质积累在肝脏有很强的协会与胰岛素抵抗和低级的肝脏炎症,这可能导致非酒精性脂肪肝发展更严重的形式,纳什(
25]。这里,我们发现,血清和GPT HFD小鼠水平显著高于ND老鼠,表明肝脏是一个受伤的状态,显著预防后10周的喂养ASE 1%或3%反潜战(数字
4(一)和
4 (b))。此外,无论是美联储集团HFD还是美联储ASE的团体或反潜战经历了重大变化水平的血清肌酐(CRE)和血液尿素氮(BUN)测定,通常用作标记的肾功能诊所(数字
4 (c)和
4 (d))。这些数据表明,ASE和反潜战HFD-induced NAFLD开发期间补充改善肝功能。
ASE和反潜战的血清肝steatosis-related标记的C57BL / 6 j小鼠HFD美联储。(a和b)的血清肝lipotoxicity标记和GPT。(c和d)肾毒性的血清标志物CRE和面包。数据显示为±SEM手段(
n在每组= 6)。HFD和ASE或反潜战,
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3.5。ASE和反潜战抑制肝脂肪从头合成途径,诱导脂肪酸β<斜体> < /斜体>氧化人类脂肪肝细胞模型
增加肝内TG (IHTG)内容是NAFLD的标志特征。为了确定ASE的影响机制和反潜战,肝新创lipogenesis-related蛋白质和基因表达研究在人类脂肪肝细胞模型通过使用一个人类原发性肝细胞永生化,HuS-E / 2细胞(
26]。AMPK起着至关重要的作用在调节肝脏的脂肪代谢,AMPK磷酸化其下游目标酶的激活,ACC,通过磷酸化ser - 79 (
27]。我们发现治疗ASE和反潜战显著增加pAMPK和扣带皮层部位,分别为(数字
5(一个)和
5 (b))。治疗OA也导致更高的脂肪酸合酶(FAS)基因表达和固醇调节元件结合protein-1c比NT (SREBP-1c)控制,而治疗ASE或反潜战显著降低FAS和SREBP-1c基因表达,参与脂肪酸合成(数字
5 (c)和
5 (d))。此外,基因表达的过氧物酶体proliferator-activatedα受体(PPAR
α)和过氧物酶体proliferator-activatedδ受体(PPAR
δ)治疗OA低于NT的控制,而治疗ASE和反潜战PPAR的显著增加
α和PPAR
δ相关基因表达,脂肪酸
β氧化(图
5 (e)和
5 (f))。这些数据表明,ASE和反潜战抑制肝脂肪从头合成途径,促进了脂肪酸
β氧化途径。
ASE和反潜战在改善肝脂肪变性的机制在OA-treated HuS-E / 2细胞。(a和b)的蛋白质因子与肝脂肪从头合成和脂肪酸有关
β氧化途径被免疫印迹分析。磷酸化的蛋白表达在Thr172 AMPK, ACC Ser79,总AMPK, ACC ASE治疗条件下所示面板(a)。这些蛋白表达条件下的反潜战治疗小组(b)所示。微管蛋白作为加载控制。定量分析与多计V3.0。(氟)基因表达与肝脂肪从头合成和脂肪酸有关
βRT-qPCR氧化途径进行了分析。脂肪酸synthesis-related基因的表达:(c) FAS和(d) SREBP-1c。脂肪酸的表达
β-oxidation-related基因:PPAR (e)
α和PPAR (f)
δ。实验一式三份,执行和数据显示为±SEM手段。OA和ASE或反潜战,
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增加的水平。OA和ASE或反潜战,
∗
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∗
∗
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0.001
在降低水平。
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4所示。讨论
作为最常见的肝脏疾病之一,随着患病率在世界范围内,非酒精性脂肪肝是一个进步的病理状态,与许多代谢并发症,包括肥胖、2型糖尿病、血脂异常、代谢综合征,促进发展的更严重的肝脏疾病,比如纳什,先进的纤维化、肝硬化和肝细胞癌(HCC) (
28]。到目前为止,没有可用药物治疗针对非酒精性脂肪肝,除了预防改进生活方式和体育锻炼来减肥
29日]。小说寻求紧急治疗非酒精性脂肪肝。
Adlay是一种一年生草本广泛种植于台湾、中国和日本,和它的种子作为膳食补充剂和中药治疗疣、皮肤裂开,风湿病,几千年来神经痛(
12]。除了ethnopharmacological功能,一些生物活性成分adlay种子已经被分离出来并标识,如coixenolide、内酰胺,coixol,多糖、植物甾醇、三萜
30.,
31日),具有抗增殖、抗肿瘤和治疗癌症,各种免疫调节活动转移,高血压、关节炎、哮喘和免疫紊乱(
32,
33]。adlay种子的药物代谢动力学情况进行了调查
在活的有机体内。此外,adlay种子被认为是安全的常规口服和外用和减少化疗的副作用
34]。在几种提取方法中,水和ethanolic adlay种子提取物生物活性属性是众所周知的。adlay水提取物的种子被报道含有coixans A, B, C和具有低血糖活动(
15]。ethanolic提取adlay种子富含脂肪分化(阿魏酸具有活动
35]。然而,很少有研究调查adlay种子提取物对非酒精性脂肪肝的治疗效果。因此,我们考虑adlay种子的提取物可以提供一种新颖的策略与非酒精性脂肪肝的治疗潜力巨大。
非酒精性脂肪肝常见的并发症之一是血脂异常(
36),研究表明,非酒精性脂肪肝,血脂异常密切相关(
37,
38]。确定adlay种子提取物对小鼠的影响食源性代谢障碍,我们混合ASE 1%或3%反潜战,分别与HFD饲料对小鼠10周。我们发现,治疗与ASE或反潜战10周阻止了更高的空腹血糖水平,胰岛素,葡萄糖耐量,造成HOMA-IR喂养HFD老鼠。此外,观察血脂异常HFD老鼠,和补充ASE或反潜战显著改善血清TC和年龄组的浓度的增加,与ASE明显预防和治疗血清TG浓度的增加。最近的研究调查了非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化,造成高胆固醇血症(
39,
40]。我们的结果表明,ASE和HFD ASE改善高胆固醇血症小鼠,这与先前的研究一致(
17),表明潜在的治疗不仅非酒精性脂肪肝,还影响动脉粥样硬化。
非酒精性脂肪肝被认为是肝功能异常的主要原因(
1,
2]。我们确实确认10周喂养HFD诱导的早期病变的发展非酒精性脂肪肝小鼠的肝脏中,而补充ASE和反潜战不仅大大避免增加肝脏TG水平也肝细胞内脂滴的积累。Lipotoxicity是脂质积累的有害影响nonadipose组织,导致肝脏炎症和纤维化(
41]。探讨肝脏炎症,我们测试了至关重要的炎症因子,肿瘤坏死因子-
α和il - 6,以及临床参数,得到和GPT,肝脏损伤的标志(
42]。肿瘤坏死因子基因表达增加
α和il - 6水平的血清被喂养和GPT HFD 10周明显减毒的ASE或补充反潜战,说明改进预防ASE和反潜战对肝脏炎症和损伤的影响。此外,血清中无显著差异CRE和面包中观察组,显示没有ASE和反潜战对肾功能的影响。
我们也验证了ASE和反潜战的影响机制。在我们的研究中,我们使用了HuS-E / 2细胞系,这是源于人类原发性肝细胞和已被证明是表型和功能类似人类原发性肝细胞(
21,
43]。推出的底层机制ASE和反潜战对改善非酒精性脂肪肝的影响在高脂肪食源性老鼠,我们模拟一个高脂肪环境HuS-E / 2细胞系和接受不同剂量的ASE和反潜战。我们的结果显示ASE和反潜战的蛋白表达显著增加pAMPK和扣带皮层部位。确定AMPK目标之一是ACC,扮演一个角色的控制通过调节脂肪酸代谢malonyl-CoA合成。通过磷酸化,抑制ACC和降低反应产物的浓度malonyl-CoA, AMPK活化预计协调分区之间的脂肪酸氧化和生物合成途径增加脂肪酸氧化能力和抑制脂肪从头合成
44]。另外,ASE治疗或反潜战的基因表达显著减少FAS和SREBP-1c显著增加PPAR的基因表达
α和PPAR
δ。SREBP-1c激活其他脂肪生成的基因,如ACC和FAS,防止脂肪酸
β氧化(
45]。PPAR
α和
δ相关的线粒体脂肪酸吗
β氧化和铅脂肪酸进入线粒体和代谢(
46]。
尽管我们的研究结果表明adlay种子提取物改善非酒精性脂肪肝的预防效果,在我们的研究中仍有限制。非酒精性脂肪肝肝脏坏死性炎症和纤维化可能发展成纳什,更快,甚至肝细胞癌(
47]。ASE和反潜战是否对纳什应该进一步研究有治疗效果。