ECAM 以证据为基础的补充和替代医学 1741 - 4288 1741 - 427 x Hindawi 10.1155 / 2020/6980398 6980398 研究文章 NF - A20-Binding抑制剂 κB 1改善神经炎症介导Antineuroinflammatory电针刺激在脑缺血/再灌注大鼠的影响 周 Xueling 1 2 陆 朱文昊 1 2 王 你 3 李 Jiani 3 https://orcid.org/0000 - 0002 - 7150 - 552 x 罗 勇 1 张 冯 1 神经学部门 重庆医科大学第一附属医院 重庆400016 中国 cqmu.edu.cn 2 实验室研究中心 重庆医科大学第一附属医院 重庆400016 中国 cqmu.edu.cn 3 神经学部门 第二附属医院的重庆医科大学 重庆400010 中国 cqmu.edu.cn 2020年 14 10 2020年 2020年 31日 7 2020年 22 9 2020年 25 9 2020年 14 10 2020年 2020年 版权©2020 Xueling周et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

NF - A20-binding抑制剂 κB 1 NF - (ABIN1)是一种抑制剂 κB和发挥抗炎作用。电针刺激(EA)被认为是神经保护策略通过抑制脑缺血后神经炎症损伤。本研究进行探索的角色ABIN1和调查ABIN1是否在EA的机制参与脑缺血/再灌注(I / R)大鼠。男性Sprague-Dawley (SD)大鼠大脑中动脉闭塞受到/再灌注(MCAO / R)和接收EA再灌注后每天一次。Lentivirus-mediated ABIN1基因可拆卸的用于检测I / R后ABIN1在神经炎症的作用。ABIN1表达式,促炎细胞因子的水平,小胶质激活,神经功能,梗塞卷和NF - κB激活进行评估。ABIN1表达升高的peri-infarct皮层和被EA进一步调节。ABIN1击倒的促炎细胞因子的水平增加,活化的小胶质细胞,神经赤字恶化,扩大梗死体积。此外,ABIN1被部分扭转EA的神经保护作用,这治疗削弱抑制NF - EA的能力 κB的活动。基于这些发现,ABIN1是一个潜在的抑制的神经炎症和ABIN1介导antineuroinflammatory EA在脑I / R大鼠的影响。

 中国国家自然科学基金 30470606 81403243 中国医学科学技术重庆市卫生局的项目 2012-2-128 1。介绍

缺血性中风占84.4%的中风,导致高的全球负担( 1]。随着血管内治疗的发展,急性缺血性中风的治疗已进入一个新阶段( 2]。然而,可能导致脑缺血/再灌注损伤血管再通。因此,神经保护与再灌注疗法相结合是一个重要的下一步发展的缺血性中风治疗( 3, 4]。病理机制的脑缺血/再灌注(I / R)是复杂的。过度的脑I / R后神经炎症加重脑损伤的主要原因之一( 5- - - - - - 7),被认为是一个潜在的治疗目标( 4, 8]。NF - κB作为“分子开关”在缺血性中风,促进炎症的起始和放大级联( 9]。最常见的NF -二聚的形式 κB是p65 / p50和二聚体结合κB(我的抑制剂 κ细胞质中的B),局部处于休息状态。根据脑缺血刺激我 κ蛋白质磷酸化抑制剂的κB激酶(IKK)和退化,允许NF - κB进入细胞核,促进一系列促炎细胞因子的表达( 9- - - - - - 11]。

NF - A20-binding抑制剂 κB 1 (ABIN1)是一种生理抑制剂的NF - κB结合Lys63和Met-1 polyubiquitin链高亲和力( 12, 13]。作为一个适配器蛋白质表达A20 ABIN1促进分子的deubiquitination上游NF - κB和抑制NF - κB激活( 14, 15]。ABIN1-deficient老鼠死在胚胎发生和老鼠的生存表现出免疫细胞激活和发展进步,lupus-like炎性疾病( 16, 17]。值得注意的是,ABIN1作为抑制剂各炎性疾病的炎症,如肝脏I / R,哮喘,系统性红斑狼疮,牛皮癣,骨关节炎( 18- - - - - - 22]。然而,ABIN1的作用在神经炎症损伤脑I / R后没有被报道。

电针刺激(EA)是现代科技的产物,增加了针灸电刺激,它的特点是成本低、副作用少,和控制参数。EA调节免疫反应和恢复体内平衡,这可能会成为它的使用作为治疗各种炎症性疾病( 23- - - - - - 25]。此外,EA是一种广泛使用的治疗缺血性中风和取得了好的结果 26- - - - - - 28]。EA的神经保护效应的抑制NF -密切相关 κB ( 29日- - - - - - 31日];然而,EA的具体调控机制尚未完全阐明。如图所示在我们先前的研究,EA抑制了我 κB α磷酸化和NF -防止核易位 κB p65通过移植神经deubiquitinating酶表达A20最终改善神经赤字在大脑中动脉阻塞再灌注(MCAO / R)大鼠( 32]。有趣的是,ABIN1是一个重要的成员表达A20复杂,也可能是受EA。考虑到ABIN1抑制NF -中扮演着关键角色 κB-related炎症反应、EA可以抑制NF - κB激活和发挥神经保护作用通过上调ABIN1表达脑I / R的老鼠。因此,在本研究中,我们最初探索的影响ABIN1 MCAO / R鼠神经炎症损伤。然后,EA的可能机制调节ABIN1的表达抑制NF - κB激活了。

 2。方法 2.1。动物

健康Sprague-Dawley (SD)大鼠体重280 - 300克购买从重庆医科大学实验动物中心(中国重庆)。动物是维持在一个特定的病原体自由(SPF)房间(12 h光/暗周期22±2°C,湿度60 - 70%)。老鼠被允许免费获得食物和水。老鼠一直在一个星期前适应实验。动物实验过程都是动物实验伦理委员会批准重庆医科大学(SYXK (Yu), 2018 - 0003年),并按照美国国立卫生研究院的执行指导实验室动物保健和使用的。

在第一项研究中,老鼠被随机分为4组:虚假的集团,MCAO / R组,MCAO / R + EA组,MCAO / R +假EA组调查的表达ABIN1 peri-infarct皮层。

第二项研究的影响阐明ABIN1 I / R后神经炎症损伤使用虚假的集团,MCAO / R组,MCAO / R + LV-Scramble组和MCAO / R + LV-shABIN1组。

第三个研究探索ABIN1是否参与EA的antineuroinflammatory机制使用MCAO / R组,MCAO / R + EA组,MCAO / R + EA + LV-Scramble集团和MCAO / R + EA + LV-shABIN1组。

 2.2。MCAO / R模型的建立

总共208只老鼠被用在这个实验中,包括17个老鼠被排除由于死( n= 14)或不成功诱导缺血( n= 3)。SD大鼠接受MCAO / R(如前所述)( 33]。简单地说,老鼠与戊巴比妥钠麻醉(60毫克/公斤,i.p)。插入一个尼龙单丝silicon-coated圆形的顶块右大脑中动脉。缺血2 h后,尼龙单丝摘除引起再灌注。老鼠被激光多普勒flowmetry (Perimed AB PeriFlux 5000年,瑞典),和地区脑血流量下降到20%和> 80%的基线恢复,表明MCAO / R模型的成功建立。老鼠在虚假的组进行相同的操作,除了单丝不插入阻塞大脑中动脉。大鼠直肠温度保持在37±0.5°C电热垫。

 2.3。颅内慢病毒注入

慢病毒包含ABIN1成分(LV-shABIN1) ABIN1击倒和控制成分(LV-Scramble)由Genechem(上海,中国)。前两周的建立MCAO / R模型,正确的大鼠皮层注射慢病毒。注射部位如下:1,p 1.0毫米;马丁−2.0毫米;dv−1.2毫米,和站点2,p−3.0毫米;马丁−1.5毫米;dv−1.2毫米( 34]。总共2.5 μl LV-shABIN1或LV-Scramble注入每个站点。

 2.4。EA治疗

再灌注后,老鼠每天处理EA一次直到牺牲。如前所述(执行EA 32)和针灸针插入Baihui(问20)、风(李4),和Taichong (LR 3)(图 1),与EA工具(模型没有。SDZ-III Hwato,中国)。构建一个电路,两个电极连接,分别在问20针,左耳(nonacupoint)。另两个电极连接,分别在李4和LR 3针。的刺激参数强度1 mA和20赫兹的频率为5分钟2赫兹30分钟紧随其后。虚假的EA组、针贴在穴位没有皮肤渗透,和动物没有收到电刺激( 35]。

GV20示意图,李4,太冲穴位的老鼠。

 2.5。评估神经功能

在72 h和24、48和72 h脑I / R后,每只老鼠与修改后的评估神经严重程度评分(mns)和修改胶带测试由一个观察者(MST)实验是不可见的。mns是综合评分系统,包括电机、平衡、感官和反射测试和评分在0(正常)18(最大赤字)分( 36]。修改后的胶带测试是用来评估躯体感觉障碍。粘纸胶带(长3厘米,宽1厘米)周围放置老鼠的爪子,和时间的老鼠撕胶带在30秒内被记录。每天每四肢测试5次,和修改胶带测试性能提出了左/右的比率( 37]。

 2.6。脑梗死体积的测量

老鼠安乐死的过量戊巴比妥钠(150毫克/公斤,i.p)。牺牲后,大脑被切成2毫米厚的连续冠状切片和沉浸在2、3,去除氯(TTC) 37°C在黑暗中15分钟。图像获取与ImageJ相机和分析软件。梗死体积的比例提出了完整的半球。

 2.7。实时定量PCR (RT-qPCR)

如图 2(一),苍白的区域被认为是梗塞核心。条梗塞核心周围的组织(2毫米厚)被认为是peri-infarct组织和解剖rt - pcr和免疫印迹分析 38]。总RNA提取使用试剂盒从peri-infarct皮层(豆类、日本)。然后,互补dna合成使用PrimeScript RT试剂盒与gDNA橡皮擦(豆类)和用作RT-qPCR模板,在CFX96实时进行PCR检测系统(Bio-Rad有限公司美国)SYBR绿色。使用以下引物序列(5′,3′):GAPDH:转发:AAGTTCAACGGCACAGTCAAGG和反向:ACGCCAGTAGACTCCACGACAT, ABIN1:转发:TCGGCTGAAGGGAAAAATACA和扭转:CAAAGGAGACCAAGGAGGGAG。结果规范化水平的管家GAPDH基因。

ABIN1表达式peri-infarct区域在不同的时间点。(a)的核心和peri-infarct地区MCAO / R老鼠。(罪犯)RT-qPCR和免疫印迹,分别检测ABIN1信使rna和蛋白质的水平peri-infarct皮层在6 h, 12 h, 24小时、48小时、72 h后再灌注( n= 5大鼠每组)。的表达ABIN1 GAPDH规范化。(e) ABIN1(红色)和DAPI(蓝色)免疫荧光染色存在的分布在再灌注后24 h ABIN1 ( n= 3大鼠每组)。比例尺= 50 μm。列图表呈现ABIN1 (f)+在四组细胞计数( ∗ P < 0.05 和 ∗∗ P < 0.01 相比虚假的组; # P < 0.05 和 # # P < 0.01 相比MCAO / R组)。

 2.8。免疫印迹分析

蛋白质提取使用缓冲区里帕从peri-infarct皮层(Beyotime,中国)。细胞质或核蛋白质提取工具包(Beyotime)被用来提取细胞质和核蛋白质。如前所述(执行免疫印迹 39]。短暂、蛋白质凝胶分离在10%,转移到PVDF膜。与5%的脱脂牛奶,阻塞后膜在4°C主要抗体孵育过夜。以下主要使用特定的蛋白质抗体:ABIN1(# 4664,细胞信号技术,美国1:1000),A20(# 5630,细胞信号技术,美国1:1000),NF - κB p65(# 8242,细胞信号技术,1:1000),我 κB α美国Proteintech (18220 - 1 - ap, 1: 000), phospho-I κB α(Ser32)(# 2859,细胞信号技术,1:1000),GAPDH(美国10494 - 1 - ap, Proteintech 1: 1000),和组蛋白H3(# 3638,细胞信号技术,1:1000)。膜用TBST洗净,浸在二级抗体在37°C 1 h。发现了与TBST洗后,免疫反应性的乐队使用WesternBright发射极耦合逻辑(美国Advansta)。膜进行扫描和分析使用一个融合FX5分析系统(Vilber Lourmat融合外汇7光谱,法国)。

 2.9。ELISA

peri-infarct皮质收集24小时再灌注后,和肿瘤坏死因子的浓度 α、MCP-1和il - 1 β化验使用ELISA试剂盒(EK0526号、EK0902 EK0393,分别博士德,中国)。

 2.10。免疫荧光染色

脑组织固定,脱水,然后切成冠状部分的厚度10 μm。部分是permeabilized Triton x - 100年的0.3%。然后,脑片被封锁5%驴或山羊血清1 h和孵化一夜之间在4°C主要抗体:ABIN1 (bs - 9568 r, bios,中国,1:50),NeuN (MAB377、微孔、德国,1:200),A20(美国3 a11g6 Proteintech 1: 100), Iba-1 (nb100 - 1028,罗福斯、美国、1:50),和GFAP (BM0055博士德,中国,1:100)。然后,下面的荧光标记二次抗体被孵化的部分在37°C 1 h在黑暗中:CoraLite594-goat anti-rabbit (SA00013-4 Proteintech 1: 200), CoraLite488-goat anti-mouse (SA00013-1 Proteintech 1: 200), CoraLite594-donkey anti-rabbit (SA00013-8 Proteintech 1: 200), FITC-donkey抗体(SA00003-3 Proteintech 1: 200)和细胞核与DAPI染色。脑片激光共焦显微镜下观察(lsm) - - - 800年,卡尔蔡司影像有限公司,德国)。

 2.11。Coimmunoprecipitation

peri-infarct皮层均质在IP裂解缓冲(Beyotime,中国)提取蛋白质。一微克anti-ABIN1抗体(# 4664,细胞信号技术),anti-A20抗体(# 5630,细胞信号技术),或正常大鼠免疫球蛋白被添加到每个毫克的上层清液总蛋白,和样品旋转在一夜之间在4°C。40毫升水中蛋白质A / G琼脂糖珠与上层清液混合和旋转在4°C 2 h。珠子是用裂解缓冲然后筛选了40 μl (SDS加载缓冲区。免疫印迹的收集上清液。

 2.12。统计分析

所有的数据进行了分析使用SPSS 21.0和8.0画使用GraphPad棱镜和表达为手段±sem。细胞定位的差异ABIN1评估使用未配对 t以及。所有其他使用单向方差分析定量数据进行了分析。 P < 0.05 被认为是具有统计学意义。

 3所示。结果 3.1。ABIN1表达式是诱导大鼠MCAO / R

我们测量的水平ABIN1 peri-infarct皮层的信使rna和蛋白质在6小时,12小时,24小时,再灌注后48小时,72 h。ABIN1信使rna和蛋白质的表达达到顶峰MCAO / R组再灌注后24 h时,然后逐渐减少(数字 2(b) - 2(d))。ABIN1 mRNA和蛋白表达水平上高于MCAO / R组比虚假的组从12 h - 72 h(数字 2(b) - 2(d))。此外,与MCAO / R组相比,EA进一步增加了表达的ABIN1 6 h - 72 h(数字 2(b) - 2(d))。此外,ABIN1是利用免疫荧光染色检测在再灌注后24 h(数字 2(e)和 2(f))。虚假的组相比,ABIN1的数量+细胞peri-infarct皮层MCAO / R组显著增加(数据 2(e)和 2(f))。此外,ABIN1的数量+老鼠的细胞进一步增加接收EA(数字 2(e)和 2(f))。ABIN1表达没有观察到显著区别MCAO / R组和MCAO / R +假EA组(数字 2(b) - 2(f))。

 3.2。分布的ABIN1 Peri-Infarct皮层

ABIN1被描述为一种NF - κB抑制因子通过与表达A20交互 12];进一步验证A20之间的交互和ABIN1 peri-infarct皮层,免疫荧光染色和coimmunoprecipitation执行。免疫荧光染色显示许多ABIN1+和样子+peri-infarct皮层的细胞再灌注后24小时,和表达A20 ABIN1与细胞质(图 3(一个))。coimmunoprecipitation结果进一步表明,ABIN1和表达A20相互绑定peri-infarct皮层在再灌注后24 h(图 3 (b))。

ABIN1托管的样子和NeuN Iba-1,分别在peri-infarct皮层。(一)双重免疫荧光染色ABIN1和表达A20 peri-infarct皮层再灌注后24小时( n= 3大鼠每组)。比例尺= 50 μm。(b) Coimmunoprecipitation ABIN1和表达A20 peri-infarct皮层在再灌注后24小时( n= 3大鼠每组)。(c)的双重免疫荧光标记ABIN1(红色)和NeuN(绿色,神经元),Iba-1(绿色,小胶质细胞)和GFAP(绿色,星形胶质细胞),分别为( n= 3大鼠每组)。白色箭头表明,ABIN1与NeuN和Iba-1,分别。比例尺= 50 μm。(d)的比较ABIN1的百分比+NeuN+细胞在ABIN1+细胞和ABIN1+Iba-1+细胞在ABIN1+细胞peri-infarct皮层。 ∗∗ P < 0.01 ABIN1相比+NeuN+/ ABIN1+。

接下来,在peri-infarct ABIN1皮层的细胞定位再灌注后24 h是评估使用双重免疫荧光标记。ABIN1与NeuN与(一个神经元标记)和Iba-1(小胶质细胞标记),但不与GFAP(一个星形胶质细胞标记)(图 3 (c))。此外,ABIN1+NeuN+细胞占ABIN1 70.22±1.71%+细胞,ABIN1+Iba-1+细胞占ABIN1 26.83±2.75%+细胞peri-infarct皮层(数字 3 (c)和 3 (d))。这些结果表明,神经元和小神经胶质细胞来源的ABIN1 peri-infarct皮层。

 3.3。ABIN1击倒的促炎细胞因子增加生产和小胶质激活

ABIN1沉默了皮质注射ABIN1 LV-shABIN1进一步探索这个角色的I / R后神经炎症。首先,ABIN1信使rna和蛋白质的水平测量再灌注后24 h时,确保ABIN1击倒的有效性。ABIN1的表达显著降低MCAO / R + LV-shABIN1集团(数字 4(一)和 4(b)),这表明ABIN1被成功地沉默。

ABIN1击倒的促炎细胞因子增加生产和小胶质激活。(a - b)水平ABIN1信使rna和蛋白质的发现再灌注后24小时使用RT-qPCR和免疫印迹,分别确认ABIN1基因击倒的效率( n= 5大鼠每组)。(c) ELISA用于检测肿瘤坏死因子的浓度 α,il - 1 β和MCP-1 peri-infarct皮层在再灌注后24小时( n= 5大鼠每组)。(d)小胶质形态学观察使用免疫荧光染色Iba-1 peri-infarct皮层的(绿色)再灌注后24 h时( n= 3大鼠每组)。比例尺= 50 μm。(e和f)小胶质细胞过程的量化端点和细胞和流程长度/细胞( ∗∗ P < 0.01 相比虚假的组; # # P < 0.01 相比MCAO / R组)。

然后,我们研究了促炎因子的生产和小胶质激活使用ELISA和免疫荧光染色,分别。典型的促炎因子TNF - α,il - 1 β,上级和MCP-1产生MCAO / R组比虚假的组(图 4(c))。更高水平的这些细胞因子被发现在MCAO / R + LV-shABIN1组比MCAO / R组(图 4(c))。这些促炎因子的水平没有显著不同MCAO / R + LV-scramble组和MCAO / R组(图 4(c))。

小胶质细胞的形态是其生物功能密切相关。小胶质细胞是hyperramified休息。活化的小胶质细胞的特点是放大细胞体短和厚过程和棒状细胞体,甚至一些展览一个科幻世界里的变形虫,细胞体( 40]。我们通过量化评估小胶质细胞的激活端点的数量每细胞和细胞过程的长度,可作为神经炎症指标( 41, 42]。Iba-1免疫荧光染色法是用于检测小胶质细胞在peri-infarct皮层后24 h I / R。虚假的集团展出的小胶质细胞静息状态的表现型(hyperramification)(图 4(d))。如数据所示 4(d) - 4(f),端点的数量每细胞和细胞过程的长度降低MCAO / R组与虚假的集团相比,表明有更多的活化的小胶质细胞在大鼠MCAO / R。此外,端点的数量每个细胞和细胞过程的长度降低MCAO / R + LV-shABIN1集团与MCAO / R组相比,表明封锁ABIN1表达增强小胶质激活(数字 4(d) - 4(f))。之间的显著差异,并未观察到MCAO / R + LV-scramble组和MCAO / R组(数字 4(d) - 4(f))。

 3.4。ABIN1击倒加剧了神经赤字和扩大梗死体积

mns和MST用来评估大鼠的神经功能72 h和24之前,48岁的脑I / R后和72 h。再灌注前72 h时,大鼠的神经功能正常,各组之间差异无显著意义(数字 5(一)和 5(b))。mns和MST MCAO / R组的比例比虚假的小组在24日,48和72 h I / R后(数字 5(一)和 5(b))。与MCAO / R组相比,神经赤字MCAO / R + 72 h LV-shABIN1组显著增加,但不是在48小时或24小时(数字 5(一)和 5(b))。的神经赤字MCAO / R + LV-scramble组没有不同于MCAO / R组在24日,48和72 h I / R后(数字 5(一)和 5(b))。梗死体积是利用TTC染色评估在再灌注后72 h。脑梗死体积之间没有显著差异MCAO / R + LV-scramble组和MCAO / R组,但扩大MCAO / R + LV-shABIN1集团(数字 5(c)和 5(d))。

ABIN1击倒加剧了神经赤字和扩大梗死体积。(a和b) mns和MST,分别分析了在72 h和24日48和72 h后再灌注( n= 5大鼠每组)。(c)脑组织部分在72 h与TTC染色后再灌注( n= 5大鼠每组)。(d)梗塞体积的比例提出了完整的半球( ∗∗ P < 0.01 相比虚假的组; # P < 0.05 相比MCAO / R组)。

 3.5。ABIN1击倒在某种程度上削弱了Antineuroinflammatory EA的效果

肿瘤坏死因子-的浓度 α,il - 1 β,和MCP-1 peri-infarct皮层被发现再灌注后24 h时用ELISA测定的影响ABIN1击倒antineuroinflammatory EA的影响。这些促炎细胞因子的水平显著降低MCAO / R + EA组相比,MCAO / R组(图 6(a))。此外,ABIN1击倒受损antineuroinflammatory EA的影响,因为较高的肿瘤坏死因子- α,il - 1 β,和检测到了MCP-1 MCAO / R + EA + LV-shABIN1组比MCAO / R + EA组(图 6(a))。MCAO / R + + LV-scramble和MCAO / R + EA组显示类似的这些细胞因子的水平(图 6(a))。此外,结果Iba-1 peri-infarct皮层的免疫荧光染色再灌注后24 h时表示,MCAO / R + EA组有更多的端点/细胞和细胞过程超过MCAO / R组;然而,ABIN1击倒在MCAO / R + EA + LV-shABIN1集团提升小胶质激活(数字 6(b) - 6(d))。小胶质细胞激活没有明显不同MCAO / R + EA + LV-scramble组和MCAO / R + EA组(数字 6(b) - 6(d))。

ABIN1击倒损害antineuroinflammatory EA的效果。(a)的浓度TNF - α,il - 1 β,和MCP-1 peri-infarct皮层在再灌注后24小时(用elisa检测 n= 5大鼠每组)。(b)观察小胶质形态进行免疫荧光染色,Iba-1 peri-infarct皮层的(绿色)再灌注后24 h时( n= 3大鼠每组)。比例尺= 50 μm。(c和d) /细胞和小胶质端点过程的量化长度/细胞( ∗∗ P < 0.01 相比MCAO / R组; # P < 0.05 和 # # P < 0.01 相比MCAO / R + EA组)。

 3.6。ABIN1击倒部分抑制EA的神经保护作用

mns和MST四组大鼠的评估在72 h和24,再灌注后48和72 h。再灌注前72 h时,大鼠的神经功能正常,观察组间无显著差异。神经损伤中观察到大鼠MCAO / R + EA组显著提高72 h但不是24和48 h后再灌注与大鼠MCAO / R组(数字 7(一)和 7(b))。大鼠MCAO / R + EA + LV-shABIN1组表现出神经赤字比大鼠MCAO / R + EA组72 h后再灌注(数字 7(一)和 7(b))。的mns和MST大鼠MCAO / R + EA组类似于大鼠MCAO / R + EA + LV-scramble集团(数字 7(一)和 7(b))。TTC染色在72 h后再灌注显示梗塞体积较小MCAO / R + EA组比MCAO / R组(数字 7(c)和 7(d))。然而,在MCAO / R + EA + LV-shABIN1集团ABIN1击倒增加梗死体积比MCAO / R + EA组(数字 7(c)和 7(d))。梗死体积之间没有显著差异MCAO / R + EA + LV-Scramble组和MCAO / R + EA组(数字 7(c)和 7(d))。基于这些结果,EA发挥保护作用的脑I / R后,但ABIN1击倒削弱EA的效果。

ABIN1击倒抑制EA的神经保护作用。(a - b) mns MST记录在72 h和24日48和72 h后再灌注( n= 5大鼠每组)。(c)脑组织部分在72 h与TTC染色后再灌注( n= 5大鼠每组)。(d)梗塞体积的比例提出了完整的半球( ∗ P < 0.05 和 ∗∗ P < 0.01 相比MCAO / R组; # P < 0.05 相比MCAO / R + EA组)。

 3.7。EA抑制NF -κ<斜体> < /斜体> B激活通过上调ABIN1

如前所述,NF - κB中扮演着重要角色在焦脑I / R-induced神经炎症。进一步探索ABIN1是否介导EA诱导抑制NF - κB激活,导出ABIN1的水平, κB α,我 κB α,核/细胞质NF - κB p65蛋白测定peri-infarct皮层的再灌注后24 h时使用免疫印迹和NF -核易位 κB p65使用免疫荧光染色观察。EA显著增加的水平ABIN1蛋白质和导出了下降 κB α/我 κB α比和NF - κB p65核易位与MCAO / R组(数字 8(一)- 8(d))。然而,ABIN1击倒的抗炎效应减弱EA发现》 κB α/我 κB α比增加,NF - κB p65核易位是增强MCAO / R + EA + LV-shABIN1组相比MCAO / R + EA组(数字 8(一)- 8(d))。这些蛋白质的水平没有显著不同MCAO / R + EA + LV-scramble组和MCAO / R + EA组(数字 8(一)- 8(d))。因此,EA可以抑制NF - κB激活通过上调ABIN1表达式。

EA防止NF - κB激活通过上调ABIN1表达式。(a - c)的水平ABIN1》 κB α,我 κB α,核NF - κB p65,细胞质NF - κB p65蛋白peri-infarct皮层的再灌注后24 h时使用免疫印迹检测。GAPDH作为内部参考和胞质蛋白,和组蛋白H3作为内部参考核蛋白质( n= 5大鼠每组)。(d)的核易位NF - κB与免疫荧光染色观察p65 peri-infarct面积在再灌注后24小时( n= 3大鼠每组)。比例尺= 20 μ图表呈现NF - m。列 κB p65+在四组细胞计数( ∗ P < 0.05 和 ∗∗ P < 0.01 相比MCAO / R组; # P < 0.05 和 # # P < 0.01 相比MCAO / R + EA组)。

 4所示。讨论

在缺血性中风EA起着有益的作用,但是EA的机制需要进一步的研究( 43]。在目前的研究中,我们首次显示,ABIN1诱导大鼠MCAO / R。ABIN1击倒加重脑I / R损伤促进小胶质细胞的激活和释放促炎因子(TNF - α,il - 1 β和MCP-1)。此外,upregulation ABIN1表达式EA抑制NF -至关重要 κB脑I / R后相关的神经炎症损伤。

ABIN1信使rna是人类周围淋巴细胞高表达,骨骼肌,脾脏,其多态性与自身免疫性疾病( 15]。我们评估的表达ABIN1脑I / R的早期阶段。ABIN1 mRNA和蛋白表达的大脑皮层假组,表明ABIN1由表达观察大脑皮层在正常情况下。此外,ABIN1 peri-infarct皮层中诱导表达,达到24小时,然后逐渐下降。NF - κB是强烈激活等细胞在脑缺血神经元,小胶质细胞、星形胶质细胞和内皮细胞( 11, 44]。监管机构的NF -一些负面的表达 κNF - B是监管 κB以防止其连续激活( 13, 45]。样子是这些消极的监管机构之一。A20表达在低水平在大多数细胞在生理条件下,但它的表达式是快速诱导激活的NF - κB ( 46]。同样,ABIN1表达式也受NF - κb .人类ABIN1基因启动子包含了NF - κB响应元件,它的启动子活动受NF - κB ( 47]。ABIN1 mRNA的表达与NF -调节各种细胞类型 κB激活( 15]。因此,增加ABIN1表达式中观察到病灶的早期阶段脑I / R可能归因于NF -的激活 κB,因此形成了一个负面反馈循环。

上级表达A20复杂的表达在神经元胶质细胞( 45, 48]。同样,如图所示在我们之前的研究中,表达A20主要表达在神经元在大鼠MCAO / R的皮质 32]。在当前的研究中,我们发现ABIN1和A20与在细胞质中,互相peri-infarct皮层在24 h。此外,我们确定的空间分布ABIN1 peri-infarct皮层首次在大鼠MCAO / R。ABIN1突出局部神经元,其次是小胶质细胞,没有表达观察星形胶质细胞在I / R后24小时。ABIN1在神经元的机制主要表现尚不清楚,但这个微分分布可能是神经元的保护策略由于其高灵敏度缺血和缺氧和有限的宽容过度激活的NF - κI / R后[B和神经炎症 49]。

早期阶段的脑I / R,受损的神经细胞释放细胞因子,趋化因子和有关的分子模式;小神经胶质细胞,大脑中的第一道防线,从神经元被激活后分钟内接收信号 50, 51]。在半影,促炎的小胶质细胞逐渐主导反应,导致促炎和抗炎作用之间的不平衡 52, 53]。过度的促炎的因素如TNF - α,il - 1 β,和MCP-1导致神经元死亡和脑损伤的加重 6, 54]。ABIN1击倒lentivirus-mediated交付使用shABIN1调查ABIN1对焦脑I / R-induced神经炎症的影响。ABIN1击倒增加小胶质激活和促炎因子(TNF -生产 α,il - 1 β和MCP-1),恶化的神经功能,扩大了梗塞体积。因此,ABIN1可能具有神经保护通过减少炎性损伤在脑I / R。然而,MCAO / R组中,内源性ABIN1表达式的upregulation焦脑I / R是不足以抵抗强大的存在;因此,增加ABIN1表达式可能代表一个有前途的治疗策略,以缓解脑I / R后神经炎症。

EA是一个补充和替代治疗缺血性中风,是世界卫生组织推荐的 26]。EA疗法需要结合特定的穴位和电刺激。穴位问20日李4,LR 3发挥镇定和复苏的影响和选择治疗缺血性中风中医( 55, 56]。我们之前的研究表明,EA治疗穴位问20日李4,LR 3发挥了神经保护作用在抑制NF -大鼠MCAO / R κB激活( 31日]。随后,这是表明deubiquitinating酶表达A20被EA抑制我调节 κB α磷酸化和防止NF - κB p65核易位( 32]。作为一个适配器蛋白质表达A20, A20 ABIN1也有类似的生物功能。例如,A20——ABIN1-deficient老鼠过早死亡和严重的炎症,和单核苷酸多态性表达A20 ABIN1基因密切相关的自身免疫性疾病( 12, 13]。因此,是否参与ABIN1 EA的机制是对我们的极大的兴趣。目前的研究显示,EA治疗穴位问20日李4,LR 3的表达增加ABIN1 peri-infarct皮层。因为虚假的EA是缺乏重要的生物活性,因为EA元素,如针头插入穴位和电刺激( 57- - - - - - 60)的表达ABIN1 peri-infarct皮层被虚假的EA没有改变。此外,我们表明,羞于EA的我 κB α磷酸化,阻止了NF - κB p65核易位,抑制神经炎症,改善神经赤字。然而,EA的神经保护效应被ABIN1击倒部分逆转。基于这些结果,建议ABIN1参与EA的机制减轻脑I / R炎性损伤。如前所述,ABIN1 peri-infarct皮层的神经元主要是本地化;因此EA可以抑制神经元NF - κB激活通过上调ABIN1表达式,最终间接抑制小胶质细胞聚集和激活。因为一些国家也用小胶质细胞表达,EA可以减少促炎因子的生产通过直接抑制NF - κB在小胶质细胞激活。进一步的研究将解决这些假设在体外,以确定在NF - ABIN1表达水平的影响 κB在神经元和胶质细胞激活,分别。

 5。结论

总之,ABIN1,诱导脑I / R,炎症抑制起神经保护作用。此外,这项研究表明,EA-induced upregulation ABIN1表达的可能是一个重要机制,NF - EA块 κB激活脑I / R后缓解神经炎症。

 数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

 信息披露

这些机构没有参与的设计研究或收集、分析、解释数据,或者写的手稿。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

 确认

这项工作得到了国家自然科学基金(批准号30470606),国家自然科学基金青年基金项目(批准号81403243),中国医学科技项目重庆市卫生局格兰特(2012-2-128)。

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