58雄性Wistar鼠被用于慢性BCCAo实验(12周大;查尔斯河有限公司Gapeung、韩国)。老鼠被安置在一个植物园两周开始建国大学实验的温度控制( 22 ± 1 °C)和湿度( 50 ± 10 在12 h %)光/暗周期(在喂饲h灯)。食物和水是随意提供给所有的动物在整个实验过程。建国大学动物保健和使用委员会制度批准该报告中描述的所有协议。所有外科手术和行为测试发生在光阶段。

Wistar鼠被麻醉使用5%异氟烷和氧气的混合物,和3%异氟烷麻醉维持期间的外科手术。中线切口,暴露颈总动脉,然后紧双重结扎丝缝合。此外,控制动物受到虚假的操作没有BCCAo他们经历了同样的过程。直肠温度维持在 37.0 ± 0.5 °C和整个手术的加热垫。在低灌注,约5%的动物神经系统症状,如癫痫蹲,和这些动物死后一个星期内参与。此外,老鼠,那些将要动手术损失了至少80%的体重在药物或车辆管理被排除在进一步的实验。

f .却已从商业供应商购买2010年(Kwangmyung-Dang、韩国蔚山、韩国)。这是确定的中药质量控制团队和沉积在创造性的研究实验室,KIOM(韩国)。干 f .却已是粉和提取蒸馏水(2 h 2公斤/ 8 L)低于100°C的ultrasound-assisted器(OM30-EP;Sonimedi、韩国)。提取都是集中在真空过滤,然后被干后用旋转蒸发器48 h在40°C通过使用提取真空干燥器(Exdryer、Sonimedi、韩国)产生粉提取(324.5 g, 16.225%的收益率)。粉提取是悬浮在无菌蒸馏水在适当的浓度。一个高效液相色谱法测定了以柠檬酸为制造商的质量控制标准 f .却已在每个实验提取成分。高效液相色谱法进行了使用两个水域515泵,2996光电二极管阵列检测器,Phenomenex Synergi水电rp - 80 a(4米, 4 。 6 × 250年 mm身份证)。流动相是由乙腈(A)和0.1%磷酸与线性梯度洗脱(B): 0分钟,100% B;15分钟,3.8%。 f .却已提取是根据膜过滤器过滤孔径0.45毫米(微孔)和10 L注入体积。柠檬酸检测波长220纳米。分析了粗提取液一式三份,柠檬酸含量是18.68%左右。

老鼠BCCAo实验中使用的是隔离分成5组:sham-operated组(口服的药物载体, n = 14 );BCCAo组(口服的药物载体, n = 14 );三个BCCAo组接受每日口服药物(100毫克/公斤 f .却已提取、200毫克/公斤 f .却已提取和400毫克/公斤 f .却已提取、 n = 10 老鼠每组)。车辆/药物治疗开始后20天BCCAo手术,并一直持续到实验的最后(见图 1)。在药品管理局,失去了两只老鼠 f .却已提取物治疗组由于压力与长期口腔喂食,但提取的 f .却已没有毒性的一般行为变化和死亡率。

高效液相色谱法是使用海域执行联盟2695高效液相色谱(HPLC)系统,2996 PDA探测器和YMC水圈C-18(5毫米, 4 。 6 × 250年 毫米身份证。)(YMC有限公司,东京,日本)。流动相是由乙腈(A)和(B)水梯度洗脱步:(A) / (B) = 0/100(0分),(A)和(B) = 10/90(15分钟),和(A) / (B) = 100/0(40分钟;坚持10分钟)。流量为1.0毫升/分钟。的原油水提取物 f .却已是根据膜过滤器过滤散文大小0.45毫米(微孔),和注射量是10吗 μl

仪器是效仿。迷宫是轮槽,直径1.83米,58厘米深,满35.5厘米的深度与不温不火( 26 ± 1 °C)水使得不透明的白漆(蛋彩画法)。一个可移动的圆形平台,直径12厘米,2厘米低于水面。迷宫周围白色的窗帘,各种形状和大小的黑色衣服被视觉刺激。迷宫的中心上方的摄像机传回来的照片,录像机和HVS图像分析计算机系统。水迷宫试验的数据进行了分析使用软件提供的HVS(英国汉普顿)。

培训过程的空间记忆任务慢性BCCAo老鼠一直在前面描述的( 15]。在一个标准化的程序,要求使用远端信号在错综复杂的环境中,老鼠训练学习伪装逃避平台的位置( 23]。简单地说,每一个会话包含五个试验在两天,和总训练是由四个交易日。在每个培训试验,平台的位置保持不变,和90年代的老鼠游或者直到他们发现这个平台。整个试验,起始位置之间的不同的四个等距点的四周装置。探针试验进行了30分钟后第二次会议和第四会话来评估的发展空间迷宫的偏见;因此,整个训练过程包括两个探针试验老鼠。在这些调查试验,大鼠游泳与平台收回为30年代池的底部,在这段时间提高平台是为了完成试验的正常位置。行为评估是开始手术后45天(见图 1)。

大鼠免疫印迹分析中使用的斩首后一周行为实验,和大脑的海马microdissected然后冻结。整个组织提取准备使用在其他地方描述蛋白质提取方法( 24]。总蛋白提取、个人组织样本被称重,然后在五卷均质冰冷的缓冲区包含20毫米三羟甲基氨基甲烷在液pH值7.5,5%的甘油,1.5毫米EDTA、氯化钾40毫米,0.5毫米二硫苏糖醇、蛋白酶抑制剂(没有。539131年,Calbiochem)。匀浆被离心机在20800×4°C g 1 h,和上层的收获,snap-frozen,储存在−80°C。胞质或核蛋白质提取准备使用先前描述的蛋白质提取方法( 25]。个人冰冻组织称重和均质(1:2 =组织质量:卷)在冰冷的20毫米Tris-HCl (pH值7.5)缓冲区包含10%的甘油,50 mM氯化钠,1毫米EDTA, EGTA 1毫米,2毫米二硫苏糖醇,蛋白酶抑制剂鸡尾酒(没有。539131年,Calbiochem)和磷酸酶抑制剂(1毫米PMSF, 2毫米Na₃签证官₄,氟化钠和25毫米)和组织磨床(没有20中风。440613年,Radnoti)。样本离心10分钟在2000×g在4°C;上层清液离心1 h×105000 g,和最终的上层清液被用作细胞质分数。丸洗在0.5毫升的均化缓冲和离心10分钟2000×g在4°C。最后一球重,resuspended(1: 1 =质量:卷)在同一个缓冲区提供0.5氯化钾,孵化1 h在冰浴(涡流频繁),和离心10分钟8000×g在4°C。上层清液用作核提取。蛋白质浓度的这些提取物是由布拉德福德化验。

蛋白质标准(精度+西方C蛋白sds - page标准;Bio-Rad)加载的第一车道每个凝胶(左)。被分离的蛋白质sds - page和转移到PVDF膜electroblotting使用迷你Trans-Blot细胞(Bio-Rad)。这个膜是孵化主要抗体(Ab)对ERK(1: 5000年,细胞信号),p-ERK(1: 3000年,细胞信号),肌动蛋白(1:5000) κB - α(1:1000)和NF - κB p65(1: 1000年,北部生物技术),然后与HRP-conjugated二级Abs。膜是使用发达到hyperfilm发射极耦合逻辑系统和可视化。所有的实验都重复三次以上anti-actin抗体的加载控制。p-ERK ERK的相对表达水平,我 κB - α和NF - κB p65微密度测定和规范化 β肌动蛋白(1:5000年,σ),一个不变的细胞骨架蛋白。免疫印迹分析每组每组3 - 6的老鼠。

老鼠安乐死致命的过量的盐酸氯胺酮(30毫克/公斤)和甲苯噻嗪(2.5毫克/公斤)行为实验,后一个星期之后,他们与4%多聚甲醛灌注intracardially 0.1磷酸盐缓冲剂(pH值7.4磅)。固定后,大脑被移除,后缀PPB (2 h),在处理含20%蔗糖的PBS cryoprotection(24小时),冻结在干冰粉,然后分段(冠状面:40 um)使用切片机。第八部分是用于免疫组织化学分析OX-6和电离的钙结合衔接分子(Iba-1)。Iba-1 17-kDa类ef - hand蛋白质的表达仅限于小胶质细胞/巨噬细胞( 26]。在OX-6组织化学染色或Iba-1,内源性过氧化物酶活性在自由浮动的部分就熄了30分钟的孵化3% H₂O₂在PBS / 10%甲醇。部分都是在室温下培养1 h在PBS 0.3% Triton-X 100含10%胎马血清(GIBCO)。部分被孵化OX-6(鼠标anti-OX-6 BD生物科学1:1000)或Iba-1抗体(和光,兔多克隆抗体,anti-Iba-1 kouichi 1: 1000) 1 h在室温和一夜之间在4°C 3%血清PBS-T解决方案。部分被孵化1 h和适当的生物素化的二次抗体(向量,1:200)和1 h ExtrAvidin过氧化物酶共轭(西格玛奥德里奇,1:1000)。最后,部分反应了一个向量SG衬底工具包(西格玛奥德里奇)过氧化物酶并安装到涂树脂幻灯片,之后他们干了一个星期。干部分幻灯片上盖玻片Permount试剂。

评估colocalization p-ERK神经元和易位的NF - κ成核,免疫荧光研究执行。部分被洗在PBS Triton x - 100然后孵化0.3%阻塞血清,5%正常马血清0.15% Triton PBS。随后,部分被孵化主要抗体20个小时在室温下的解决方案。为初级抗体、鼠标anti-NeuN抗体(微孔,1:1000),兔子Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2)抗体(细胞信号,1:100),和兔抗NF - κB抗体(Santacruz,1: 500)。部分洗在PBS 0.15% Triton x - 100和孵化在二级抗体溶液(Alexa 568共轭驴anti-rabbit抗体,Alexa 488共轭驴anti-mouse抗体,1:200)在室温下2小时。彩色部分是安装在树脂涂敷幻灯片和干30分钟。幻灯片被盖了延长黄金不变色试剂(表达载体)。

量化小胶质细胞的数量OX-6或Iba-1阳性细胞数。部分包括海马和海马体的伞从每组3 - 6大鼠进行了分析。定量分析,我们选择特定区域的神经炎症变化已经在文献中报道( 27]。海马体,包括CA1、CA3及齿状回(DG),是量化的焦点Iba-1阳性细胞。一个感兴趣的区域(ROI)的0.03毫米²每一个部分在海马区,CA1, CA3, DG(前囱−3.00−4.00毫米;六个部分每鼠)。的数量Iba-1小胶质细胞在每个计算ROI和平均。在海马体的伞ROI(前囱−3.36−3.72毫米;每鼠6部分)被选中。的数量OX-6小胶质细胞在每个计算ROI和平均。海马CA1、CA3及齿状回的焦点p-ERK的量化表达式。神经元层CA1, CA3, DG的海马体(前囱−3.24−3.72毫米;每鼠3部分)。在每个ROI p-ERK表达信号的完整性测量和平均。

单向方差分析和单向重复方差分析进行评估的影响 f .却已提取ERK表达水平的变化,p-ERK,我 κB - α胞质NF - κ核NF - B p65, κB p65 OX-6和Iba-1阳性细胞的数量,和空间记忆障碍引起的慢性BCCAo。(Dunnett事后分析 t 或 t 以及)随后进行确定的影响 f .却已治疗。 P 值小于0.05被认为是重要的,除非另有说明。 t 以及进行评估的影响慢性BCCAo在海马p-ERK阳性细胞的强度水平。

如图 2的水提取物 f .却已包含5-hydroxymethyl-2-furaldehyde ( 1),4-O-caffeoylquinic酸甲酯( 2)、洋李甙( 3),5-O-caffeoylquinic酸甲酯( 4),benzyl-O - β-D-glucopyranoside ( 5),它以前从水中分离提取的水果 f .却已( 28]。

莫里斯在水迷宫任务,搜索错误详细描述其他地方( 23)被用来评估性能的准确性在水迷宫空间学习。在每个试验中,老鼠从越狱平台的距离是采样10次/秒,和这些值平均在1秒垃圾箱。然后搜索累积误差计算的总结1秒平均距离的措施纠正为特定位置在每个试验开始。单向重复方差分析表明,团体之间的影响(sham-operated控制、与车辆BCCAo BCCAo和药物治疗)是重要的( F ( 4 , 46 ) = 8 。 81年 , P < 0.0 01 ),培训效果(会话)( F ( 3 , 138年 ) = 88年 。 81年 , P < 0.00 1 )。组和训练之间的交互作用不显著。如图 3(一个)sham-operated控制老鼠迅速成为精通定位水下平台的培训;然而,相比之下,BCCAo老鼠没有太多的改善迹象的培训。事后分析,证实了这显示之间的显著差异sham-operated控制老鼠和老鼠BCCAo ( P < 0 。 01 )。此外,管理BCCAo老鼠 f .却已提取(200毫克/公斤)显示更好的表现比BCCAo老鼠( P < 0 。 05年 )。然而,BCCAo老鼠处理 f .却已提取(100毫克/公斤或400毫克/公斤)显示无显著改善性能与BCCAo老鼠相比。

此外,明显的差异表现在第一次调查试验观察,所评估的时间的百分比在目标环(5×平台的大小)在30秒的调查。第一次调查试验的单向方差分析表明,群体之间显著的影响( F ( 4,46岁 ) = 6.92 , P < 0.001 )。事后分析显示,sham-operated控制老鼠的空间偏差相比vehicle-treated BCCAo老鼠( P < 0.01 )(图 3 (b))。类似于BCCAo训练的结果,治疗的老鼠 f .却已提取(200毫克/公斤)表现明显优于vehicle-treated BCCAo老鼠( P < 0 。 05年 )。然而,BCCAo老鼠处理 f .却已提取(100毫克/公斤或400毫克/公斤)显示无显著改善性能相比vehicle-treated BCCAo老鼠。第二个探测器的单向方差分析试验表明,群体之间显著的影响( F ( 4,46岁 ) = 8.14 , P < 0.001 )。事后分析显示,sham-operated控制老鼠的空间偏差相比vehicle-treated BCCAo老鼠( P < 0.05 )(图 3 (b))。然而,BCCAo老鼠接受药物治疗并没有显示出显著的改善效果在第二次调查试验相比,BCCAo处理车辆的老鼠。

Iba-1的表达在活化的小胶质细胞在调节大脑疾病( 29日]。量化的影响 f .却已治疗,Iba-1积极的小神经胶质细胞的数量的次区域海马体(CA1, CA3, DG)从每个老鼠都计入图纸相同的部分。方差分析显示重要的集团效应在CA1 ( F ( 2、11 ) = 9.29 , P < 0.05 )。事后分析的影响显示海马BCCAo Iba-1阳性细胞的数量明显高于控制。Iba-1阳性细胞的数量少BCCAo海马处理 f .却已比vehicle-treated BCCAo海马( P < 0.0 5 )(数据 4(一)和 4 (b))。方差分析分析CA3及DG没有集团效应。

此外,据报道,在染色的MHC II级抗原(OX-6) OX-6阳性细胞的数量增加海马伞的大鼠慢性BCCAo [ 16, 30.]。本实验的结果是一致的与先前的报告。方差分析显示重要的集团效应在伞( F ( 2、12 ) = 4.42 , P < 0.05 )。事后分析的效果显示,OX-6阳性细胞的数量在伞BCCAo显著高于控制。OX-6阳性细胞的数量少BCCAo伞处理 f .却已比vehicle-treated BCCAo海马( P < 0.0 5 )(数据 4 (c)和 4 (d))。

MAPK信号传导中起着重要作用在突触可塑性和hippocampus-dependent内存 31日]。最近的一项研究表明,在BCCAo p-ERK的水平增加海马( 15, 16]。因此,我们决定来确定 f .却已在海马提取p-ERK BCCAo-induced增加降低。具体来说,免疫印迹被用来测量海马p-ERK水平在五组大鼠的大脑,即sham-operated控制,BCCAo +车辆,BCCAo + f .却已提取(100毫克/公斤),BCCAo + f .却已提取(200毫克/公斤)和BCCAo + f .却已提取(400毫克/公斤)。p-ERK水平的单向方差分析表明,群体之间显著的影响( F ( 4、11 ) = 3.15 , P < 0.05 )。据事后分析,海马p-ERK水平BCCAo老鼠强烈调节相比,那些sham-operated控制(数字 5(一个)和 5 (b); P < 0.0 5 )。然而,这些BCCAo-induced增加减少了治疗 f .却已( P < 0.0 5 )。单向方差分析ERK水平没有集团的影响(数据 5 (c)和 5 (d))。

后续实验进行了检查如果p-ERK水平的增加引起的慢性BCCAo发生在海马CA1神经元,采用双重免疫荧光组织化学。数据 6(一)和 6 (b)显示p-ERK阳性信号位于海马CA1和CA3锥体细胞和门的地区的总干事地区sham-operated控制和BCCAo老鼠。的影响慢性BCCAo p-ERK表达式的海马区域被p-ERK阳性细胞的平均强度量化(数字 6(一)和 6 (b))。双重免疫荧光组织化学显示信号的p-ERK更强烈NeuN阳性细胞的大鼠的海马CA1 BCCAo比sham-operated控制(图 6 (c))。 t 以及海马CA1 p-ERK水平显示组间显著差异( P < 0.05 )。 t 以及海马CA3和DG p-ERK水平显示组之间没有差异。

NF - - - - - - κB信号改变在慢性神经退行性疾病,包括广告( 17]。具体来说,NF的水平 - - - - - - κB p65 immunoactivity增加患者的大脑中广告( 19]。因此,我们决定确定NF - - - - - - κB激活发生在老鼠的海马BCCAo如果NF - - - - - - κB激活减弱BCCAo大鼠海马的处理 f .却已提取(200毫克/公斤)。胞质NF -单向方差分析的水平 κ核NF - B p65, κB p65,胞质 κB - α海马体的显示,组间显著的影响( F ( 2、9 ) ≥ 3.81 , P ≤ 0.05 )。西方墨点法评估和事后分析,进一步分析了在胞质海马提取物,BCCAo导致减少的水平p65 NF -亚基 κB乐队在海马体(65 kDa) ( P < 0.05 )(数据 7(一)和 7 (b)),以及我 κB - α水平(41 kDa) ( P < 0.05 )(图 7 (c)),而NF - κB p65核海马提取水平高于sham-operated控制( P < 0.05 )(图 7 (d)),这表明BCCAo NF -增加 κB易位。 f .却已提取(200毫克/公斤)治疗减少了NF -的易位 κB p65 BCCAo海马。

随后的实验进行了检查如果NF - κB易位引起慢性BCCAo发生在海马CA1和CA3神经元,采用双重免疫荧光组织化学。图 8表明NF - κB p65积极信号位于海马CA1和CA3锥体细胞sham-operated控制和BCCAo老鼠。双重免疫荧光组织化学表明NF - κB p65积极信号更强烈NeuN阳性细胞的大鼠的海马CA1和CA3 BCCAo比sham-operated控制(图 8 (d)),这表明NF - κB在海马CA1和CA3易位到核与慢性BCCAo大脑。