除非另有说明，所有化学品和试剂均购自Sigma(美国)。盐酸阿仑膦酸钠和雷洛昔芬分别从Merck (GmbH)和Eli Lilly (USA)获得。

中草药原料均由香港一家知名供应商采购。形态学、显微和化学鉴定均按照中国药典进行[ 15］．植物标本室的样本样本已存放于香港中文大学中医研究所博物馆，样本样本编号如下:2004-2547 (E)， 2004-2566 (L)， 2004-2568 (P)。将淫羊藿、女贞子、补骨脂等药材按重量比5:4:1在沸水中回流提取1 h，重复提取2次。将水提物收集并过滤。滤液在50℃减压浓缩后冻干成粉末。分子式经过了标准化。以淫羊藿苷(淫羊藿)、红景天苷(女贞子)、补骨脂素和异补骨脂素(补骨脂)为代表分子，采用液相色谱-质谱联用(LC-MS) (6530 accurate-mass Q-TOF LC/MS, Agilent Technologies, USA)进行化学分析。ELP水提物(1 mg/mL)注入ACQUITY UPLC C18色谱柱(2.1 × 100 mm id，粒径1.7) μ米)(水域,美国)。采用以下溶剂体系进行梯度洗脱:流动相A-双蒸馏水/甲酸(99.9/0.1;v / v);B-acetonitrile移动阶段。线性梯度洗脱体系为100% A ~ 100% B洗脱30 min, 100% A静置10 min。流速设置为0.3 mL/min。通过比较未知峰的保留时间和与之匹配的电离产物大小的标准品的保留时间，进行化学标记物的鉴定。在多反应监测模式(MRM)下，通过监测结合母质和产物化合物的正离子来检测电离产物。母离子和产物离子的理论m/z值[m +H]⁺淫羊藿苷、[M+Na]为677.66⁺Salidroside 323.304，[M + H]⁺补骨脂素及其异构体异补骨脂素的187.16。定量测定了ELP提取物中各标记物的丰度。

香港大学动物实验伦理委员会（参考文献09／068／MIS）获得动物实验伦理认可。使用88只3个月大的雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠，每笼4只，置于温度为22°C、明暗循环12小时的房间内。大鼠平均分为8组。卵巢切除组大鼠双侧卵巢切除，而假手术组大鼠进行假手术。在实验期间，将大鼠饲养在含有0.9%钙和0.7%磷酸盐的标准啮齿动物食物上，并提供蒸馏水 随意．卵巢切除术3周后，每只大鼠灌胃给予ELP提取物和两种抗吸收药物(阿仑膦酸(A)和雷洛昔芬(R)) 8周，见表 1．每周记录大鼠的体重以评估变化。通过将动物在牺牲前一天放置在个体代谢笼中，收集禁食24小时尿液样本。用2mL 1M盐酸酸化尿液样品，并在4℃下以1200×g离心10分钟以除去污染物，并将等分试样储存在-20℃直至测定。牺牲后，血液样品从腹腔静脉中取出。然后通过以3000×g在4℃下以3000×g离心20分钟而获得血清样品，并在评估生化参数之前储存在-80℃。将子宫移除并立即称重。卵巢切除术的成功通过未能检测卵巢组织并通过观察子宫角的标记萎缩来证实粪便。

实验动物分为11组，如表所示 1．1组为假手术组，其余10组均行卵巢切除(OVX)。实验用ELP剂量(0.35 g/kg/d;第3组和8-11组)在我们之前的研究中被证明是有效的[ 10］．剂量(相当于一个成年人摄入6-12克生药)是根据人体当量剂量表计算的[ 16，乘以萃取率。也提出了类似的理由 一个 和 R ．我们的试验研究表明最佳浓度 一个 和 R 分别为0.5 mg/kg/d(组4)和2.5 mg/kg/d(组6)。每种抗吸收药物的低剂量(最佳浓度的1/10)， 一个 (低;组5)和R(低;第7组，建立各药物的剂量依赖性效应。8 ~ 11组采用高、低剂量ELP联合治疗 一个 或 R 是为了研究每一对中草药之间的相互作用而建立的。

使用外围定量计算断层扫描（PQCT）（XCT2000，Stratec Medizintechnik，GmbH），监测腰椎椎骨（L5），近端胫骨形象，近端胫骨形象的骨密度（L5），近端胫骨形象和远端股骨形象。实验期八周。开始的一天是第一天。标准测量的变异系数（CV％）小于3％。首先，使用氯胺酮和木嗪（100mg / kg体重和10mg / kg体重）肌肉内的鸡尾酒麻醉大鼠。然后将其固定在定制的半透明塑料支架上。在PQCT的内置研究模式下扫描腰椎（L5），右侧胫骨和远端股骨。扫描速度为25毫米/秒，体素分辨率0.2 mm。生成并呈现总BMD（BMD）和包括皮质和小梁区域）。

在大鼠安乐死后，使用microCT (Micro CT 40, Scanco Medical, Switzerland)分析左侧远端股骨的微结构。简单地说，将股骨垂直于扫描轴对齐。扫描在55 kVp和144 kVp下进行 μA的分辨率为16 μm /体素。在每个二维切片上用半自动绘制的轮廓识别股骨远端骨小梁。分割参数固定在:Sigma = 0.5，支持度= 1.0，阈值= 245。在50个连续切片内测定感兴趣体积(VOI)。利用micro-CT工作站的图像分析程序，通过三维重建图像获取VOI的微结构参数。分析直接模型参数(骨体积密度(BV/TV)、骨小梁数(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁板分离(Tb.Sp))。

处死大鼠后取右股骨。立即用0.9%盐水浸泡的纱布包裹，置于可重新密封的塑料袋中。所有样品保存在−20°C。在进行生物力学试验前，允许试件在室温(24°C)下过夜解冻。采用Hounsfield材料试验机(KM25, Redhill, UK)进行三点弯曲试验。安装了最大250n的测压元件。下支架的跨度为20 mm。在中外侧入路以5 mm/min的恒定速度加载骨中轴，直至失败。记录屈服强度、最大强度和断裂强度以供分析。

采用美国生物医学技术公司(Biomedical Technologies)的大鼠骨钙素(OC) ELISA试剂盒测定血清骨钙素(OC)浓度。采用ELISA试剂盒(Quidel, USA)检测尿中脱氧吡啶啉交联(DPD)水平。每个试剂盒生成标准曲线，并根据标准曲线计算浓度。

根据数据分布情况，采用单因素方差分析(ANOVA)或Kruskal-Wallis检验，然后分别采用Posthoc Dunnet或Dunn检验来检验处理组与对照组之间的差异。分别比较阿仑膦酸组和雷洛昔芬组。所有的协变量都进行了调整以进行统计分析。所有统计分析均使用Windows的社会科学统计软件包(SPSS) 15.0版本，并在5%显著性水平下进行 （ P < 0.05 ） ．数据以均数±均数标准误差(SEM)表示。

经LC-MS测定，ELP水提物中标记物组成如图所示 1．红景天苷、淫羊藿苷、补骨脂素和异补骨脂素的保留时间分别为4.68、10.99、11.45和11.81 min(图) 1(一)）.该洗脱条件能较好地分离补骨脂素和异补骨脂素异构体。所有标记物的存在表明经一系列制备工艺后，ELP提取物中均含有淫羊藿、女贞子和补骨脂。在提取样品中，红景天苷含量最高，淫羊藿苷次之，异补骨脂素和补骨脂素含量最高(图) 1 (b)）.

在模型建立过程中，切除卵巢使腰椎、股骨和胫骨的总骨密度分别降低6.5±2.7%、9.65±3.0%和14.37±3.4%。在接下来的8周治疗中，我们发现ELP、A和R不同组合与未处理的OVX相比，没有引起大鼠体重的显著变化，如图所示 2（a）和 2（b）．

在OVX组腰椎，卵巢切除对降低总骨密度的作用显著。总骨密度从基线(第0天)持续下降到8周治疗期间的8.2%(图) 3(一个)). 然而，股骨远端和胫骨近端的总骨密度与基线值相比没有变化（图 3 (c)和 3 (e)）.这可能提示去卵巢大鼠非承重骨(即腰椎)的骨密度减少期比承重骨(即股骨和胫骨)的骨密度减少期更长。对于假手术组，在第8周(数据未显示)，所有研究区域的总骨密度从基线到6.0%(腰椎)、11.07%(股骨远端)和14.16(胫骨近端)均有所增加。

所有9个治疗组在第6周的腰椎明显高于OVX的BMD。ELP明显将BMD损失减少5.3％（第6周; P < ０．００１ )和3.4%(第8周; P ＝ 0.011 )，与相应OVX组比较(图 3(一个)). 这一发现与我们之前的报告一致[ 10]. 然而，当在股骨远端和胫骨近端将ELP与OVX进行比较时，在整个实验过程中未观察到显著差异（图 3 (c)和 3 (e)）.这一观察结果表明，ELP在预防非负重骨骨丢失方面比在负重骨骨增重方面更有效。对于抗吸收药物，其剂量依赖效应 一个 和 R 在所有腰椎、股骨远端和胫骨近端观察到。其他动物研究也报道了这种效应[ 17- - - - - - 19］．这两个 一个 (数据 3(一个)， 3 (c), 3 (e)), R (数据 3 (b)， 3 (d), 3 (f))与OVX相比，在其最佳剂量下，骨量减少大鼠在所有3个区域的总BMD均显著提高。在最佳剂量下，A在所有研究区域的保护效果均高于R。

在联合研究中，我们的数据显示ELP提取物与雷洛昔芬在增加骨质减少的骨骨密度方面具有协同作用。用0.25 mg/kg/d的雷洛昔芬治疗骨质减少大鼠， R (低)，观察到腰椎和股骨远端总骨密度损失显著减少，但从第4周开始，其最佳剂量的效果降低。然而, R (Low)在减少胫骨近端总骨密度损失方面没有显著效果，与ELP组相似。ELP和ELP联合治疗骨质减少大鼠 R （低），股骨总骨密度显著增加（图 3 (d))和胫骨(图 3 (f)）从第2周到第8周开始，与OVX。有趣的是，ELP + R（低温）的骨保护作用比每周2开始的最佳剂量优于R单独的骨保护作用。在腰椎上发现类似的观察，ELP + R（低）完全废除了BMD由于卵巢切除术而减少（图 3 (b)）.ELP与R (Low)联合治疗，骨密度明显高于对照组 R 在承重骨骼的整个实验中。观察ELP + R和ELP + R (Low)在腰椎和胫骨的剂量依赖效应。同时给予ELP和 R 胫骨总骨密度增加5.26% (2.5 mg/kg/d) R ； P ＝ 0.014 )和5.94%(0.25毫克/公斤/天) R ； P ＝ 0.026 ）与相应的剂量组相比 R 单独地ELP+R组是最有效的治疗组 R 或单独在脊柱和胫骨近端进行ELP提取。然而，ELP和阿仑膦酸钠联合治疗组均无这种协同作用。

虽然总骨密度一直被认为是骨强度的替代指标，但微结构特性提供了更全面的信息，以评估不同组合对股骨小梁骨质量的影响。与OVX相比，各治疗组骨小梁的骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)和骨小梁厚度(Tb.Th)均有提高，但骨小梁间距(Tb.Sp)降低。ELP治疗显示BV/TV、Tb轻度升高，但不显著。N,结核病。结核病发病率降低。Sp，与股区总骨密度增加不显著直接相关，如图所示 3 (c)．相反，a和R在骨质减少大鼠股骨远端骨体积增加中存在剂量依赖效应。A组大鼠BV/TV较高( P ＝ 0.007 ；数字 4(一)),结核。N ( P ＝ 0.004 ；数字 4 (c))，但降低结核病。周效磺胺-乙胺嘧啶( P ＝ 0．002 ；数字 4 (g)比OVX)。结核病。N和结核病。Sp，在r治疗组中未观察到显著差异(图 4 (d)和 4 (h)）.

与总骨密度分析相似，ELP提取物可协同提高疗效 R 在去卵巢的大鼠身上。而与a共药组均无这种协同作用。当与ELP和R (Low)共药组大鼠BV/TV呈上升趋势(图) 4 (b)）和tb.th（图 4 (f))，但没有达到统计学意义，这可能是由于变化幅度较小和重复试验有限。在高浓度的 R ，ELP + R与用过的人相比，在微体系结构的进一步改善 R 一个人。BV/TV有显著性差异( P ＝ 0.007 ；数字 4 (b))和结核病。Th ( P ＝ 0.038 ；数字 4 (f)），与OVX组相比。

我们的骨骼力学测试数据显示，所有以最佳剂量给予ELP、阿仑膦酸或雷洛昔芬的组均可增加骨质减少大鼠股骨中轴的生物力学特性(图) 5）.ELP和 R 与OVX相比，其破坏强度、极限强度和刚度均有显著提高 一个 显着增加失败和最终的优势。观察到两种抗腐蚀药物对生物力学性质的剂量依赖性效果（除了刚度之外 一个 ）.

对于组合研究，ELP提取物可以提高效果 R 在所有剂量水平。相反，只有与低剂量A共同处理的组，其失效强度和极限强度参数才有改善。用ELP和 R (低)，破坏强度有增加的趋势(图 5 (b))，极限强度(图 5 (d))和硬度(图 5 (f)）.在那些与ELP联合治疗的组中也发现了类似的观察结果 R ．这些发现进一步证实了ELP能增强脑功能 R 呈剂量依赖性。然而，ELP与 R 不被认为是协同作用，因为任何剂量的 R 弱于ELP单独。这种相互作用被看作是一种简单的添加剂。

为了阐明ELP和 R 骨代谢、骨形成标志物血清骨钙素水平和骨降解标志物尿DPD水平进行分析。数字 6(一)治疗8周后，血清骨钙素水平出现相应变化。ELP治疗组骨钙素水平显著升高 （ P ＝ 0.031 ） ，但不在两者中 R 团体。类似于生物力学测试，ELP提取物似乎增强了效果 R 在所有剂量水平，虽然没有达到显著水平。数字 6 (b)治疗8周后，尿DPD水平出现相应变化。脱氧吡啶啉交联（DPD）代表破骨细胞再吸收引起的骨结构降解，它受到 R 在0.25 mg / kg /天 （ P ＝ 0.006 ） 和2.5毫克/公斤/天 （ P < ０．００１ ） ．ELP治疗组DPD水平有下降趋势。有趣的是，ELP与 R 可协同显著降低DPD水平(R (Low)， P ＝ 0.0258 ； R ， P ＝ 0.0202 )，与 R 一个人。综上所述，这些发现证明ELP主要通过抑制骨吸收和部分促进骨形成来增强R的作用。