1。介绍
动脉粥样硬化是一种常见的慢性炎症性疾病的动脉内皮,积累脂质,在大型动脉斑块。动脉粥样硬化可以启动和发展从内皮功能障碍,这被认为是早期预测动脉粥样硬化(
1 ]。各种因素可以引起血管内皮损伤,其中,最重要的是氧化低密度脂蛋白(ox-LDL) [
2 ]。升高血清水平的ox-LDL被发现在所有患者动脉粥样硬化的
3 ),血管内皮细胞损伤是引起ox-LDL通过氧化应激水平升高(
4 ]。目前,它仍然对底层复杂的分子机制主要是未知的动脉粥样硬化。
自噬是一个降低长寿蛋白质和细胞器的代谢过程中应力条件和对各种生理过程至关重要,如细胞生长和生存
5 ]。积累的数据表明,自噬发挥着潜在的作用在体内平衡和心脏和血管的功能,和有缺陷的或过度自噬促进动脉粥样硬化;然而,准确的自噬对动脉粥样硬化的影响依赖于不同的细胞类型和阶段的斑块(
6 ]。自噬在动脉粥样硬化提供双对细胞损伤的影响。因此,自噬在动脉粥样硬化的影响仍然是一个有待进一步调查。
微- rnas (microrna)非编码RNA分子小,和他们协调基因沉默绑定到3′未翻译区(3′utr)。microrna在内皮细胞扮演着多个角色,包括增殖、粘附、迁移、和生存(
7 ,
8 ),与动脉粥样硬化有关
9 和自噬
10 ]。
多功能microrna mir - 149,有许多生理和病理作用。多态性mir - 149授予对缺血性中风的一个条件高度相关的动脉粥样硬化(
11 ]。此外,mir - 149可以调节凋亡细胞的巨噬细胞间隙,抑制炎症和坏死核心形成动脉粥样硬化病变(
12 ]。此外,mir - 149可以抑制细胞凋亡,增强扩散和软骨细胞的自噬
13 ]。然而,目前尚不清楚有关规定mir - 149和内皮细胞自噬活动。因此,本研究旨在探讨mir - 149的作用和机制与ox-LDL内皮细胞损伤引起的。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
HUVECs是购自中国科学院细胞银行(中国上海)和低葡萄糖杜尔贝科的修改鹰培养基培养(DMEM)包含10%的边后卫在孵化器有限公司为5%2 在37°C。HUVECs受到ox-LDL (100
μ g / mL)诱导内皮损伤。分析mir - 149表达ox-LDL曝光后,HUVECs孵化了ox-LDL 3、6、12、24、48小时。HUVECs被分成六个组来调查细胞损伤:控制,数控模拟,mir - 149模拟,ox-LDL, ox-LDL +数控模拟,ox-LDL + mir - 149模拟。HUVECs研究自噬被分为三组:对照组,ox-LDL, ox-LDL + mir - 149模拟。对照组培养与0.1%二甲亚砜(DMSO)。
2.2。细胞转染
HUVECs被播种在6-well盘子10%胎牛血清的DMEM培养基的边后卫。当融合细胞生长至70%,他们被转染mir - 149模拟或负控制(数控模拟)使用lipofectamine 2000试剂(美国纽约生活技术)。模拟序列(Sangon生物技术,中国上海)如下:mir - 149 - 5 - p模仿,5′UCU GGC UCC贵港市UCU UCA中联科利CC-3′;和模拟数控5′-UUC UCC棉酚问GUC ACG UTT-3′。转染48 h后,证实了转染效率RT-qPCR和免疫印迹。
2.3。细胞生存能力分析
与数控模拟HUVECs, HUVECs转染,HUVECs转染和mir - 149模拟(所有5×103 细胞/ 96 -孔板)被播种。细胞培养与ox-LDL (100
μ g / mL) 24 h。CCK-8试剂添加到细胞(1:10稀释)为孵化37°C 1 h。吸光度测量的波长450 nm的标仪(美国CA Bio-Rad)。
2.4。Caspase-3活动
HUVECs细胞溶解,离心得到上层清液。然后,30
μ 与70年L上层清液含蛋白质提取的孵化
μ L caspase-3衬底(Ac-DEVD-pNA猫。不。:C1115;Beyotime,中国上海)37°C 2 h。标仪测量吸光度在405海里。caspase-3活动是规范化的控制。
2.5。免疫荧光
HUVECs和HUVECs转染和mir - 149模拟(3×104 /毫升)被播种在6-well文化板块和暴露在ox-LDL (100
μ g / mL) 24 h。细胞被固定为4%多聚甲醛(pH值7.4)20分钟,permeabilized triton x - 100, 1%和1% BSA阻塞。细胞治疗山羊多克隆抗体anti-LC3-II(猫。不。sc - 398822;美国圣克鲁斯,CA)在4°C过夜然后孵化FITC-linked二级抗体1 h。细胞与DAPI染色(10毫克/毫升)和共焦显微镜下观察(德国徕卡)。LC3-II +细胞DAPI +细胞的比例计算(至少100细胞数)。
2.6。实时定量聚合酶链反应
总RNA提取HUVECs使用试剂盒®试剂(表达载体)。模板互补脱氧核糖核酸合成的RNA逆转录酶使用ReverTra Ace qPCR RT工具包(Toyobo、东京、日本)。qPCR反应体系组成的互补脱氧核糖核酸(2
μ L)、PCR反应混合液(10
μ 引物(0.5 L),前进
μ L),反向引物(0.5
μ L)和H2 O (7.5
μ L)引物序列如下:mir - 149,提出5′- GGC TCT GGC GTG TCT T移行细胞癌,反向′5′- CAG TGC gg GTC CGA GGT ATT-3′;U6,向前5′ctc GCT TCG GCA GCA CA-3′,和反向5′aac GCT柠檬酸CGA ATT TGC GT-3′。所有反应跑7分钟的初始变性在95°C,紧随其后的是40周期的变性在95°C 30年代和退火60°C 45 s。RT-qPCR使用ABI棱镜7500进行快速实时PCR仪(应用生物系统公司;福斯特城、钙、美国)。
2.7。2 <一口>−ΔΔCT < /一口>方法
mir - 149水平标准化为一个小核RNA的表达(核内小RNA) u6和分析使用2−ΔΔCt 方法(
14 ]。2−ΔΔCt 值是根据以下公式计算:2(−ΔΔCt) = (Ct (miR−149)−Ct (U6))的所有组/ (Ct (miR−149)−Ct (U6)对照组(
14 ,
15 ]。
2.8。免疫印迹
从HUVEC细胞总蛋白提取,其次是使用bicinchoninic酸蛋白质定量测定。蛋白质样品(50
μ g)受到10% sds - page电泳,然后转移到PVDF膜。阻止非特异性蛋白质结合位点,膜与5%的低脂牛奶,孵化处理主要抗体一种蛋白激酶(猫。不。4691年代;细胞信号技术,Inc .)、p-Akt(猫。不。4060),mTOR(猫。不。2983),p-mTOR(猫。不。 5536), and
β 肌动蛋白在一夜之间在4°C。所有主要的抗体稀释1:500。然后,这些墨迹与HRP-linked孵化二级抗体1 h。乐队观察使用增强化学发光(ECL)(美国马热科学、沃尔瑟姆),使用ImageJ软件及其光密度进行了分析。
2.9。统计分析
所有定量值被表示为意味着±标准差(SD)和分析SPSS 20.0统计软件(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。多个比较是通过单向方差分析,其次是Bonferroni调整的事后测试。
P
<
0.05
被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。mir - 149模拟保护HUVECs Ox-LDL-Induced细胞损伤和凋亡
HUVECs孵化了ox-LDL (100
μ g / mL) 3、6、12、24、48小时诱导内皮损伤。RT-qPCR表明,mir - 149表达明显减少了ox-LDL曝光时间的方式(图
1(一) ),在各个时间点上均有显著差异,除了3 h。然后我们选择24小时为最佳的孵化时间进一步的实验。探讨mir - 149对血管内皮损伤的影响,HUVECs转染了mir - 149模拟或消极的控制(NC)模仿。mir - 149模拟转染细胞显著增加了mir - 149水平有或没有ox-LDL(图
1 (b) )。此外,mir - 149模拟显著增加细胞活力HUVECs(图
1 (c) )。此外,mir - 149模拟减少caspase-3活动在HUVECs ox-LDL(100毫克/毫升)(图
1 (d) )。
图1
mir - 149模拟防止HUVECs受伤。(一)miR-49级别ox-LDL孵化后减少。(b) miR-49水平提高使转染后mir - 149模拟HUVECs 24小时。(c) mir - 149模拟转染细胞生存能力增加。(d) mir - 149模拟转染caspase-3活动减少。
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P
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0.05
,
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P
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0.01
,
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∗
∗
P
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0.001
与对照组;
P
#
#
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0.01
与ox-LDL组。
(一)
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(b)
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(c)
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(d)
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3.2。mir - 149提升自噬与Ox-LDL HUVECs
评估是否mir - 149调节自噬,HUVECs沾LC3-II抗体和共焦显微镜下观察。自噬小体是由黄色图片,从合并获得绿色puncta (FITC-linked LC3-II)用蓝色puncta (DAPI-stained核)。mir - 149模拟增强自噬在HUVECs ox-LDL感应(图(黄色荧光)
2(一个) ),显著增加的百分比与ox-LDL LC3-II +细胞与细胞(图
2 (b) )。此外,免疫印迹显示,mir - 149模拟增加LC3-II / LC3-I率和减少P62蛋白质在HUVEC ox-LDL(数字
2 (c) - - - - - -
2 (e) )。
图2
mir - 149模拟对自噬的影响在ox-LDL-induced HUVECs。(一)HUVECs控制,ox-LDL, mir - 149模拟沾LC3-II抗体(绿色,放大×100)。细胞核与DAPI染色(蓝色)。(b)的量化LC3-II荧光强度,提出了通过细胞LC3-II点。mir - 149模拟与LC3-II点显著增加细胞的数量。(c)进行免疫印迹确定LC3-I, LC3-II, P62蛋白质。(d) mir - 149模拟显著增加的比率LC3-II LC3-I。(e) mir - 149模拟显著降低了P62蛋白表达。
∗
∗
∗
P
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0.001
与对照组;
P
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0.05
,
P
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0.01
,
P
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#
#
<
0.001
与ox-LDL组。
(一)
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(b)
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(c)
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(d)
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(e)
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3.3。mir - 149调制mTOR / Akt通路与Ox-LDL HUVECs
然后我们探索mir - 149是否调节mTOR / Akt通路,包括自噬的过程。免疫印迹是确定一种蛋白激酶的蛋白质表达,mTOR,磷酸化形式(图
3(一个) )。mir - 149显著压抑和磷酸化Akt表达式(数据
3 (b) 和
3 (c) )。同时,mir - 149减少了总mTOR和磷酸化mTOR表达式(数字
3 (d) 和
3 (e) )。定量实时PCR显示mir - 149减少ATK公司与ox-LDL HUVEC的mRNA的表达。结果表明,抑制mTOR / Akt通路可能调解增强自噬mir - 149。
图3
mir - 149模拟增强自噬通过抑制mTOR / Akt通路。(一)免疫印迹进行确定一种蛋白激酶和mTOR蛋白质。相比与ox-LDL HUVECs (100
μ 一种蛋白激酶g / mL),表达式(b), p-Akt (c), mTOR (d),和p-mTOR (e)被mir - 149模拟治疗显著降低。计算所有这些蛋白质被规范化
β 肌动蛋白。RT-qPCR被用来确定AKT的mRNA的表达。
∗
∗
∗
P
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0.001
与ox-LDL组。
(一)
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(b)
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(c)
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(d)
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(e)
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3.4。mir - 149减毒Ox-LDL-Induced细胞损伤通过mTOR / Akt通路促进自噬
HUVECs与3-methyladenine cotreated (3-MA,自噬抑制剂)或胰岛素(一种蛋白激酶的激活/ mTOR途径)。3-MA或胰岛素cotreatment显著逆转mir - 149诱导细胞生存能力(图
4(一) (图)和减少caspase-3活动
4 (b) )。
图4
增强的自噬和抑制一种蛋白激酶/ mTOR调解mir - 149模拟的保护作用。自噬抑制剂(3-methyladenine 3-MA 100
μ 米)和Akt激活/ mTOR通路(胰岛素,200海里)。(一)细胞HUVECs的可行性。(b) Caspase-3 HUVECs的活动。
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∗
∗
P
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0.001
与对照组;
P
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#
<
0.01
和
P
#
#
#
<
0.001
与ox-LDL组;
美元
P
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0.05
和
$ $
P
<
0.01
和mir - 149组。
(一)
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(b)
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4所示。讨论
本研究探讨了mir - 149的功能及其下游通路在内皮损伤。我们的结果表明,mir - 149表达拒绝在HUVECs ox-LDL孵化。此外,mir - 149超表达被发现增加细胞活力,减少ox-LDL HUVECs caspase-3活动引起的。此外,mir - 149 - 5是在一种蛋白激酶,促进自噬,减少表情确诊,p-Akt, mTOR, p-mTOR ox-LDL-treated HUVECs。mir - 149在HUVECs损伤的保护作用可以抑制自噬或mTOR / Akt通路激活。
Ox-LDL介导的动脉粥样硬化的发生和发展具有破坏性的内皮细胞(
16 ]。因此,ox-LDL内皮损伤是一种有效的诱导物,可以模拟动脉粥样硬化起始和发展,这是由我们的结果,ox-LDL HUVECs生存能力降低和增加细胞凋亡引起的。有证据表明,HUVECs孵化ox-LDL可以模拟在动脉粥样硬化内皮细胞损伤。此外,ox-LDL减少HUVECs, mir - 149水平和mir - 149超表达阻止了ox-LDL-induced内皮损伤。最近的一项研究我们有相似的结果,mir - 149 - 5 - p减毒ox-LDL-induced HUVECs损伤(
17 ]。我们的结果也由以前的报告,mir - 149 - 5 - p提升细胞生存在高glucose-induced HUVECs。这种保护与显著减少的水平endothelin-1 (ET-1)、血管性血友病因子(vWF)和ICAM-1水平没有增加,以挪士
18 ]。ET-1、vWF、ICAM-1都是内皮功能障碍的生物标志物和影响动脉粥样硬化进展
19 ]。相反,以挪士能促进一氧化氮(NO)生产和维持内皮体内平衡通过发芽的内皮细胞,修复受损的内皮
20. ]。这表明mir - 149是一种保护性分子在血管内皮损伤的疾病。mir - 149 - 5 - p减毒血脑屏障通透性和改进的结果与脑缺血大鼠(
21 ]。此外,mir - 149 - 3 - p分泌刺激前列腺癌细胞增殖和血管内皮细胞的能动性
22 ]。因此,mir - 149水平是减少ox-LDL感应,我们的研究添加mir - 149作为一种新的治疗代理在动脉粥样硬化内皮保护。
自噬是一种守恒的代谢过程在动脉粥样硬化的发病机制与广泛的监管作用。据报道,Ox-LDL自噬的诱导物和HUVECs [
23 ,
24 ),这是与我们的研究一致,就是明证增强LC3-II免疫荧光染色增加LC3-II / LC3-I率和减少P62 HUVECs蛋白表达。到目前为止,许多microrna,包括mir - 126和mir - 155,已报告,促进自噬在ox-LDL引起的内皮功能障碍(
25 ,
26 ]。然而,mir - 149对自噬的影响的ox-LDL-induced HUVECs仍不清楚。我们的研究表明,mir - 149模拟增加LC3-II +细胞的比例与ox-LDL HUVECs,这结果是由另一个报告,mir - 149提升人类原发性软骨细胞自噬
13 ]。此外,我们的研究表明,自噬的堵塞3-methyladenine (3-MA)逆转mir - 149 mimics-induced抑制ox-LDL-induced HUVECs受伤。这些结果提供的证据表明,自噬促进由mir - 149有有益的影响在动脉粥样硬化内皮细胞损伤。
mTOR / Akt介导多种细胞过程,如细胞凋亡和自噬(
25 ]。它可以抑制自噬在巨噬细胞,增加动脉粥样硬化斑块的脆弱性
27 ]。抑制一种蛋白激酶/ mTOR也促进自噬在HUVECs ox-LDL接触(
25 ,
28 ]。我们的研究表明,mir - 149超表达降低蛋白质含量的一种蛋白激酶,p-Akt, mTOR,和p-mTOR ox-LDL-induced HUVECs,在另一份报告是一致的结果在人类肝细胞癌(HCC)细胞(
28 ]。然而,mir - 126减少p-Akt和p-mTOR,但总Akt和mTOR蛋白质保持不变(
25 ]。这可以解释的事实之间有互补的站点microrna - 149种子区域和3′utr AKT1信使rna。因此,荧光素酶的记者分析表明,mir - 149直接针对Akt1在肝细胞癌(
29日 ]。mir - 149的直接针对证据Akt在HUVECs值得进一步调查。