犬皮肤肥大细胞肿瘤(MCT)是第二个最皮肤肿瘤中发现狗。发病率可能是中等高的一些品种,如拳击手,牛狗,哈巴狗,贵宾犬,拉布拉多寻回犬,金毛猎犬。一般来说,所有特定患者需要积极的诊断和治疗,因为疾病的发展是非常迅速的 1]。在掩盖其特定的肿瘤发生,然而,有很多信息从不同的研究表明,exon-11的突变,叫做internal-tandem-duplication (ITD),原癌基因, c - kit,参与MCT的形成。主要是, c - kit蛋白质编码基因负责工具包(CD117)形成和它通常表示在许多细胞的物种,如正常的肥大细胞,黑色素细胞、浦肯野细胞包括特定细胞( 2]。

装备属于受体酪氨酸激酶第三类(rtk第三类),它包含三个功能域,细胞外(ectodomain)、跨膜(TM)和胞内域,分别 3]。胞内域进一步分为两个子公司部分;近膜由exon-11编码和激酶域由剩下的外显子编码。工具包的功能触发当ectodomain绑定到特定的配体, 干细胞因子(SCF),紧随其后的是包二聚和cross-autophosphorylation酪氨酸残基的化学用品。结果是激活下游信号传导瀑布,负责的生长和增殖以及antiapoptosis肥大细胞。在特定的情况下,ITD突变异常的exon-11结果自主装备二聚作用没有任何特定的配体结合。这种机制导致无法控制自身磷酸化MCT形成紧随其后。然而,这种类型的突变也会影响其特定疗法酪氨酸激酶抑制剂(TKI)时,使用su - 11654等( 4]。因此,检测ITD-mutant exon-11是临床上重要的MCT诊断和治疗计划。然而,利用其特定细胞收集的FNA)的检测ITD-mutant exon-11最近没有任何报道。

本文的目的是报告的就业CD117 immunocytofluorescence和FACS-cell排序的快速识别和隔离特定细胞收获FNA)。此外,我们还证明了使用这些细胞诊断ITD-mutant exon-11 PCR在复发性其特定情况。

poodle-mixed 13岁,公狗被称为肿瘤诊所,小动物教学医院,兽医学院科学,朱拉隆功大学,复发MCT-grade II(基于Patnaik病理分级)的颈部和背内侧左手掌(图 1)。狗是沿着年与预防性化疗手术切除。然而,疾病的治疗是无效的,进展迅速。最后,业主和负责任的兽医计划用一种酪氨酸激酶抑制剂(TKI)在这种情况下。然而,业主不愿意重复他的狗的皮肤活检。因此,之前的组织切片被送到我们的组织病理学实验室重新评估基于小说层病理评分系统( 5)和兽医利用FNA无菌收集细胞样本质量在左手掌(图 1)调查ITD-mutant exon-11。

识别MCT-cell人口,几滴肿瘤细胞从FNA)涂抹在清洁silane-coated载玻片。细胞被保存在4°C冷丙酮一会儿他们孵化1%牛血清白蛋白(BSA)在室温下30分钟块特异性的蛋白质。肿瘤细胞进一步孵化PE-conjugated鼠标单克隆抗体反CD117(克隆Y.B5。美国Becton和Dickinson B8)浓度的30分钟1:100年在室温下在一个黑暗的房间。的特异性抗体已经批准我们实验室之前的研究。特定细胞被4′,复染色6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI、表达载体、美国),他们是在荧光显微镜下可视化与575 nm光源。在这项研究中,我们还用正常的肥大细胞和组织细胞瘤细胞由相同的方法,分别为积极的和消极的控制。

itd突变评估,肿瘤细胞首先纯化使用FACS-cell排序。简单,细胞之前收获FNA)在500年resuspended μL无菌PBS。细胞悬液的红细胞被根除通过添加10毫升的BD流式细胞仪赖氨酸溶液10分钟(Becton和Dickinson,美国)。此外,细胞悬液在4000×g离心5分钟,上层清液离心后丢弃。细胞颗粒被添加到500年 μ美国L BD FacsPerm解决方案(Becton和Dickinson) 10分钟增加膜透性,它是由PBS洗两次。肿瘤细胞培养,在黑暗中,到100年 μL (PE直接共轭鼠单克隆抗体反CD117(克隆Y.B5。B8,正欲和迪金森,美国)的浓度1:200 20分钟。这些细胞被清洗和离心机在4000 g×5分钟,上层的套利交易。细胞沉积物在10毫升无菌resuspended PBS。执行数据采集使用BD-FACScalibur与BD Cell-Sorting细胞分选仪软件系统(美国Becton和Dickinson)和CD117-immunopositive细胞被封闭的细胞呈现高于阈值线,点第二象限的情节(图 2)。这些细胞被整理出来并收获到一个收集管进行PCR分析。单克隆免疫球蛋白是用作isocontrol建立阈值线点阴谋。

FACS-sorted肿瘤细胞的基因组DNA (gDNA)提取使用商业DNA-isolation工具包(美国该款)和它的浓度是计算使用紫外分光光度法。正向和反向引物设计的5′末端intron-11 exon-11和3′末端的 c - kit分别为( 6, 7]。序列的引物5′cca TGT ATG亚美大陆煤层气有限公司TAC AGT GGA AG-3′和反向引物5′gtt CCC TAA AGT猫TGT TAC ACG-3′,分别。

PCR鸡尾酒准备在一个戴鸭舌帽的PCR管(美国Axygen)。25 μL (PCR混合器由1.5 μL 10 x氯化钾缓冲溶液(美国Fermantas DreamTaq), 1.5 μL 10 x (NH)₄)₂所以₄缓冲溶液(美国Fermantas DreamTaq) 3 μL MgCl 20毫米₂解决方案(美国Fermantas) 1 μL 2毫米的核苷酸溶液(美国Fermantas), 0.5 μL聚合的聚合酶(美国Fermentas DreamTaq), 2 μL 10毫米的引物的解决方案,2 μL(10毫米反向引物的解决方案,4 μL纯化的DNA模板,和9.5 μL nuclease-free水(该款,美国)。thermocycler DNA模板放大(美国G-Storm)批编程温度为95°C 5分钟首次变性DNA;40的95°C 1分钟周期循环DNA变性,57°C 1分钟循环DNA退火,和72°C循环DNA扩展1分钟;和72°C 5分钟完整DNA伸长( 8]。DEPC水作为消极的控制在这个研究。同时,gDNA non-ITD和ITD-mutant exon-11细胞由兽医学院,密西根州立大学,美国分别是利用正常的和积极的控制。此外,我们还使用了一个积极的标本由相同的协议与本例中排序结果。

最终,扩增子EtBr-mixed分开使用2%琼脂糖凝胶电泳在100 V 40分钟。扩增子被凝胶可视化文档装置(美国Bio-Rad)。信息分析的计算机软件系统,数量一个版本4.6.9(美国Bio-Rad)和转换成JPEG-imaging系统使用微软油漆(微软、美国)。

病理部分研究结果,是高档中华人民共和国交通部负责重新归类为。此外,CD117 immunocytofluorescence显然批准MCT-cell人口送气音。所有肿瘤细胞强烈表现出CD117 immunopositivity等离子体膜和细胞质;与此同时,他们的核被DAPI染色蓝色,如图 3。值得注意的是注意到,有一些CD117-immunonegative细胞涂片中呈现。这些细胞没有特定细胞比消极的控制。

此外,大约400000 FNA-MCT细胞被FACS-cell收获排序。这些细胞的基因组DNA提取使用上述协议及其浓度为156.65 μ克/毫升。没有ITD突变exon-11 c - kit在这种情况下(图 4)。PCR产品的单一乐队相比,在本例中是191个基点的积极控制和积极的标本(2产品乐队在191个基点和250个基点,职责。)和正常的控制(191 - bp)。

的ITD-mutant exon-11在 c - kit是看似必不可少的MCT肿瘤发生这种突变已经被广泛研究[ 3, 6, 8]。此外,exon-11的itd突变也影响TKI管理。基本上,其特定的病人拥有ITD-exon-11,通常回复TKI治疗大于nonmutational患者( 4]。

在这项研究中,我们演示了另一种协议特定的快速诊断。CD117-immunocytofluorescence可以提高我们进行精确识别特定细胞的能力。尤其是中高档MCT的肿瘤细胞通常是多形性和他们的形态可能模仿其他的肿瘤细胞,如圆细胞肿瘤细胞。此外,FACS-cell排序可以迅速帮助我们净化MCT的人口。这些特定细胞的理想来源细胞可以用来检测ITD-mutant exon-11,至少在这种情况下。快速诊断ITD-mutant exon-11可能帮助一名兽医决定自己TKI使用。

在这种情况下,我们认为这种情况下应该突变exon-11由于肿瘤的侵犯行为。然而,ITD-mutant exon-11没有观察到在这种情况下。这可能表明,突变exon-11可能不会与病理级别,但它应该与复发率。然而,我们强烈建议进一步研究基于组合协议必须在一个大的人口,以确保执行这个协议的优势,在此之前组合方法将被用作一个标准协议在未来特定轴快速诊断。