Fabry疾病(FD;MIM # 301500)的x染色体溶酶体储存障碍造成溶酶体酶的缺乏 α牛乳糖( α-Gal-A)。这个赤字影响某些鞘糖脂的代谢,主要globotriaosylceramide (Gb3),积聚在许多细胞的溶酶体。

Fabry疾病最初报道的发病率之间1:40000年和170000年( 1- - - - - - 3),但最近估计新生儿筛查项目表明发生率要高得多,1:3100在意大利 4在台湾)和1:1500 ( 5]。大部分新生儿在这两项研究发现被发现携带突变预测晚表型。经典影响半合子的男性,没有或少残留 α牛乳糖活动,可以显示所有特征的神经(疼痛),皮肤(血管角质瘤)、肾(蛋白尿、肾功能衰竭)、心血管(心肌病、心律失常),cochlear-vestibular,和脑血管(短暂性脑缺血发作,中风)疾病的迹象,而雌性杂合的症状非常轻微到严重不等( 6]。

最早的和最独特的眼部FD的结果是一个双边,whorl-shaped角膜病称为角膜verticillata积累的结果上关,沉积在缘的血管上皮基底膜和可视化为黄棕色夹杂物发出径向从一个漩涡。角膜基质和内皮幸免( 7]。角膜verticillata和后白内障晶状体中大约有70%的女性和载体是有用的在杂合子检测( 8]。

人类的 杯子基因,在Xq22.1本地化,是12 kb的长度,由7个外显子( 9]。到目前为止,超过六百人致病突变已确定,绝大多数的错义( http://www.hgmd.cf.ac.uk/)。

管理疾病的主要症状,直到酶替代疗法(ERT)成为可供临床使用。几个临床试验证明了有效性的ERT防止或减缓主要器官功能障碍但无法治疗某些症状如血管扩张性疣,听力障碍,高血压,和角膜verticillata [ 10]。早期诊断是外部重要的为了管理治疗和预防疾病的最有害的后果 11]。

渊源者,一名17岁的女性,被确认为有涡角膜病后常规眼科检查和临床遗传学评估,随后被称为自FD长大的可能性。她也偶尔抱怨感觉异常在她的手指和脚趾。没有报告听觉、视觉或出汗异常。过去病史是不起眼的。广泛的临床和实验室调查未能揭示皮肤,心脏,肾,或者神经参与。更具体地说,渊源者接受了心脏评估的。在临床检查没有发现异常。12导心电图,有窦性心律,正常的房室传导,不完全右束支块(基本正常发现),没有复极化异常,正常的QT间隔。超音波检查发现在,有正常的心脏结构和功能。的渊源者进行了24小时节律霍尔特记录期间她正常窦性心律失常的节奏没有任何证据。 There was no renal participation, as documented by the normal serum creatinine and estimated GFR (MDRD and EPI formula), the absence of proteinuria and hematuria, and the normal kidney size and echogenicity on a renal ultrasound scan. Blood pressure was repeatedly evaluated and was found to be within normal limits. Mental status was normal. There were no cutaneous stigmata. Extraocular movements were full. Pupils were equal and reactive. Visual fields were full to confrontation. There was no objective hearing loss. Sensation over the face and limbs was not impaired. Reflexes were 2+ and symmetric. There was no focal weakness or atrophy. Plantar responses were flexor bilaterally. There was no cerebellar dysfunction. Her gait was normal and Romberg test was negative. Routine biochemical and hematological test results were normal. Lyso-Gb3 in plasma was 5.9 ng/mL (normal range: 0.1–0.9 ng/mL).

的活动 α牛乳糖在病人的白细胞是化验使用标准荧光法( 12并发现53 nmol /人力资源/毫克蛋白(正常范围:33 - 134 nmol /人力资源/毫克蛋白;承运人范围:4.3 -73 nmol /人力资源/毫克蛋白)。酶测定在第二个示例中,再次发现属于FD杂合子和正常对照组之间的重叠范围。的活动 β牛乳糖酶也测量控制溶酶体酶,在正常范围内。

基因组DNA提取外周血白细胞使用Puregene血液工具包(猫。158467号)。所有的 杯子基因外显子,包括他们的侧翼区域,通过PCR扩增和测序。使用的引物是那些以前发表的莫龙et al。 13]。因为没有致病性突变被直接测序,确定多个Ligation-dependent探测器放大(MLPA)是为了确定删除或重复使用P159杯子probemix (MRC-Holland荷兰阿姆斯特丹)。MLPA执行根据制造商的协议使用200 ng基因组DNA反应。所有运行包含DNA从四个不相关的正常对照组。病人被发现港口一个外显子7删除,显示的平均比例相应的探针(图0.51 1)。孕产妇样本还测试了,发现是负的删除。父亲是不能用于测试,我们不知道他是否有任何Fabry疾病的症状。

实时定量PCR(存在)进行了耐心和母亲,为了证实存在/没有删除。中存在的引物序列设计使用引物3软件( http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)。引物组设计的扩增子的长度大约100个基点定位删除区域连同一套控制底漆(Metabion,德国)。中存在的分析,下面的寡核苷酸引物被使用:AA1-F 5′-GTCTCAAAGTCCCGACCTCA-3′和AA1-R 5′-CCTGTCCACCTTTTTCTCCA-3′(chrX: 100652650 - 100652767);AA2-F 5′-TTTACCCAGGGAAGCAACTG-3′, 5′AA2-R -AGCCTGGGCTGTAGCTATGA-3′(chrX: 100652965 - 100653046);Control-F 5′-GGCCCAGGACTTATCTCGAC-3′, 5′Control-R -GTACAGGATGCCACCCCTCT-3′(chr18: 31301854 - 31301978)映射使用构建GRCH37 (HG19)。PCR检测,荧光数据分析进行了CFX96实时C1000热循环(Biorad Inc .)使用Sso快速Evagreen Supermix (Biorad Inc .)根据制造商的建议。存在分析使用引物AA1和AA2在病人和显示删除确认正常拷贝数状态的母亲,和MLPA结果一致。

远程PCR行走策略是用于地图删除断点。使用一对引物5′-TCAAGCCAAAGCTCTCCTTC-3′, 5′-CGCTTGTGGGGAAATTTATG-3′,周围地区的外显子7删除 杯子基因被KAPALongRange放大DNA聚合酶(美国波士顿KapaBiosystems)根据制造商的建议。确定删除断点的位置,异常(短)远程删除等位基因的PCR产物1%琼脂糖凝胶上分离和纯化PCR凝胶使用NucleoSpin凝胶和清理设备(MACHEREY-NAGEL)。纯化的片段是使用相同的一对引物测序。删除被发现跨越1182个基点,以其5′末端位于外显子6的 杯子基因和3′末端位于下游的外显子7(图612个基点 2)。

x染色体的失活(XCI)模式是由甲基化分析为该地区的侧面的外显子1的多态CAG重复 基于“增大化现实”技术基因,修改后的方法由艾伦et al。 14]。X-inactivation病人的分析显示随机(不倾斜)XCI模式(比58:42)。

我们报告的第一个确诊病例Fabry疾病载体在塞浦路斯人口。没有塞浦路斯男性病人诊断在我们实验室在过去25年(我们实验室是唯一参考实验室岛上的遗传性代谢疾病)。此外,在以前的研究中,我们筛选140年塞浦路斯男性终末期肾病或心肌病,病因不明,通过测量 α牛乳糖外周血白细胞的活动,没有Fabry疾病患者检测(未发表的数据)。

的 α牛乳糖活动在这里介绍之间重叠范围内Fabry杂合子和正常对照组。有缺陷的 α牛乳糖活动白细胞或成纤维细胞通常用于诊断男性患者,但这是一个不可靠的诊断方法,女性杂合子,是他们的 α牛乳糖缺乏由于活动范围可以从正常的非随机X-inactivation [ 15]。因此,它是至关重要的结合生化与分子分析化验以确定杂合的FD女性。然而,使用外显子突变分析筛选可能无法检测到突变等位基因的大基因内删除防止删除地区引物退火。检测基因重组通常需要更大的替代技术,如多路复用Ligation-dependent探测器放大(MLPA)。这允许同时杂交和结扎的几个探测器在一个反应管,其次是PCR和毛细管电泳分析。MLPA的有效性涉及删节和重复分析 杯子基因已经被其他组织报告( 16, 17]。使用MLPA,我们还发现了一个新外显子7删除我们的病人中证实了存在。我们的研究结果提供了一个强有力的理由检查所有可能的FD患者,在他没有发现致病突变,其实 杯子删除。这在女性中尤为重要,因为它可能是唯一的方法来证实诊断。变异识别允许筛查影响个人的大家庭和促进了产前诊断。

我们描述小说中删除渊源者使用远程PCR和序列分析作为跨越1182个基点(g。25012 _26194del1182,根据人类的编号 杯子NCBI参考U78027.1), 5′末端位于外显子6的 杯子基因和3′末端位于下游的外显子7 612个基点。具体来说,删除之前包括9个核苷酸的3′端外显子6,内含子,外显子7,612个基点的下游外显子7。这个删除没有报道之前,预计将致病性,因为它导致的部分损失 杯子编码序列。

超过600致病突变(人类基因突变数据库,HGMD http://www.hgmd.cf.ac.uk/)已确定到目前为止在人类 杯子基因。大基因删除一个或多个外显子涉及 杯子基因不是一般描述。然而,大型缺失的频率可能被低估,因为他们逃避检测通过测序分析。大量删除由外显子5、6和7在西班牙男性患者( 18]。

Fabry疾病携带者可以影响不同程度取决于X-inactivation的模式。如果X染色体携带突变优先灭活,女性将影响最小,而如果正常X染色体是优先灭活,女性可能会受到严重影响。之间的这种相关性的临床表型和X-inactivation发现了一些研究[ 13, 15, 19),而其他的研究没有发现相关( 20., 21]。X-inactivation渊源者中显示一个随机模式;然而,它是不可能预测的临床表型。最初的诊断评估,一年后,她在18岁仍无症状。她将密切跟进相应的出现任何症状和治疗。

总之,我们想强调的重要性,认识到涡角膜病作为Fabry疾病的迹象,尤其是在女性杂合子,其他症状可能缺乏。我们还想强调应用MLPA技术的重要性,在这种情况下,没有使用Sanger测序确定突变。