C57 / BL6小鼠(6 - 8周,22 g)购买的第二军医大学实验动物中心和驯化实验前1周(生产许可证。SCXK(胡)2012 - 0003)。动物保健设施被批准的动物保健和使用委员会长征医院,跟着导游。

老鼠放在热板,热刺激老鼠的脚疼痛反应。老鼠舔脚的时间作为指标的疼痛反应,确定药物镇痛效果。我们首先选择了正常小鼠疼痛反应在30年代,把鼠标放在一个 55 ± 0.5 ° C 热板装置,并使用鼠标作为一个观察的hindfoot指数来确定小鼠的痛阈。测量每5分钟执行两次。

老鼠注射LPS或福尔马林茎,然后对待CY-09通过胃内的管理。爪子舔时间后被蒙蔽的方式测量有限合伙人或福尔马林的挑战。观察每组的老鼠,数了数舔时间在60分钟。

RNA提取工具包(试剂盒、德国)介绍了孤立从脚组织总RNA。逆转录数组后,实时定量PCR进行使用SYBR绿色PCR主结构,分析了光周期计480(罗氏公司、德国)。表达式是使用特定的引物进行了测试。il - 6意义上底漆是5 ′ -TAAGCCTCCGACTTGTGAAGTGGT-3 ′ 5,反义底漆 ′ -ATCCAGTTGCCTTCTTGGGACTGA-3 ′ ;的il - 1 β意义上底漆是5 ′ -CAGGCAGGCAGTATCACTCA-3 ′ 5,反义底漆 ′ -AGCTCATATGGGTCCGACAG-3 ′ ;肿瘤坏死因子- α意义上底漆是5 ′ -CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA-3 ′ 5,反义底漆 ′ -TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC-3 ′ ;NLRP3意义上底漆是5 ′ -ATGCTGCTTCGACATCTCCT-3 ′ 5,反义底漆 ′ -AACCAATGCGAGATCCTGAC-3 ′ ;caspase-1意义上底漆是5 ′ -CACAGCTCTGGAGATGGTGA-3 ′ 5,反义底漆 ′ -TCTTTCAAGCTTGGGCACTT-3 ′ ;NF - κB底漆是5 ′ -CTCCCTGACAAGCCTGCTAC-3 ′ 5,反义底漆 ′ -TCTTCCTTCAGCGTCTGGAT-3 ′ ;TRPA1意义上底漆是5 ′ -CTACTGGCTTTTGGCCTCAG-3 ′ 5,反义底漆 ′ -CCAAAGGTCAGGACTGGGTA-3 ′ ;GAPDH意义上底漆是5 ′ -CCGCATCTTCTTGTGCAGT-3 ′ 5,反义底漆 ′ -GGCAACAATCTCCACTTTGC-3 ′ 。

细胞内钙的^{2 +}浓度均质和离心机的组织样本测定使用BioVision工具包。然后,吸光度测量通过标在575海里。

组织收集和里帕细胞溶解。蛋白质浓度检测后,蛋白质样本加载和膜与初级抗体TRPA1孵化(pa1 - 29421,英杰公司)和GAPDH (ab181602 Abcam)。

老鼠脚组织收割,碎成小块,然后用胶原酶消化二世和dispase II(美国密苏里州Sigma-Aldrich) PBS为30分钟37°C。细胞悬液的过滤、离心、resuspended,阻塞CD16/32抗体。然后,主要抗体的细胞被染色流式细胞仪缓冲30分钟在黑暗中在4°C。流式细胞术分析在BD流式细胞仪石中剑使用6天后软件(BD生物科学,圣何塞、钙、美国)。结果分析了使用FlowJo软件V10.2(美国或TreeStar)。

8.0数据分析使用GraphPad棱镜。所有数据了 意味着 ± 扫描电镜 。所有的实验都重复三次。比较组是使用一个未配对的学生执行 t 以及。 ∗ P < 0.05 , ∗ ∗ P < 0.01 , ∗ ∗ ∗ P < 0.001 显示统计学意义。

CY-09-pretreated小鼠接受有限合伙人或福尔马林,和两个不同的模型被用来诱导炎性疼痛。与formalin-induced炎症相比,有限合伙人是缓慢和持续时间。疼痛的程度是由热板和脚舔时间评估。注射后,老鼠疼痛行为明显和脚组织变得肿胀。5毫克/公斤CY-09明显抑制LPS引起的热痛觉过敏在5 h(图 1(一)1 h(图)和福尔马林 1 (b)),分别。此外,CY-09显著抑制疼痛,其镇痛的行为始终存在在60分钟。

白细胞浓缩在炎性疼痛发生和修复受损的组织。炎性细胞因子的生产是在炎症性疼痛的过程中一个重要指标。我们进一步评估炎性因子的表达通过RT-qPCR足底组织。我们第一次发现il - 6和TNF - α在急性炎症的过程中,两个指标。数据显示CY-09可以缓解炎性细胞因子释放(数字 1 (c)和 1 (d))。然后,我们测试了il - 1 β表达水平。结果表明,细胞外分泌il - 1的水平 β是调节在LPS诱导的两个模型和福尔马林,但后来,它被CY-09抑制(数据吗 1 (c)和 1 (d))。因此,CY-09缓解疼痛,减少炎症的水平。

探索的底层机制CY-09 antinociceptive效果,我们对经典的炎症通路的激活NF - κB和inflammasome通路。rt - pcr数据表明CY-09减少NLPR3, ASC, caspase-1表达式在有限合伙人或formalin-induced老鼠(数字 2(一个)和 2 (b))。此外,CY-09显著抑制核NF - κB (p65)转录(数字 2(一个)和 2 (b))。接下来,我们研究巨噬细胞激活的NLRP3脚组织招募。我们使用CD45和F4/80两个指标来区分白血细胞的总量和定义伊诺+ M1极化和CD206 + M2极化。与:组相比,M1的比例下降,M2标记增加(图 2 (c))。这些发现表明CY-09应用减少巨噬细胞M1极化并削弱了促炎因子的分泌。

据报道,TRPA1通道的激活参与NLPR3 inflammasome,我们假设CY-09可以调节TRPA1的表达。有限合伙人管理后,表达TRPA1的拦路强盗组织显著调节。然而,CY-09显著降低TRPA1表达式(数字 3(一个)和 3 (b))。TRPA1是一个钙离子通道。我们进一步评估组织中的钙离子水平。与单一注射LPS组相比,CY-09治疗显著降低细胞内钙^{2 +}浓度(图 3 (c))。formalin-treated模型中,我们也发现类似的结果LPS-treated模型(数据 3 (d)- - - - - - 3 (f))。

TRPA1以来可能是细胞内钙高程的主要原因,AITC TRPA1受体激动剂和抑制剂HC030031被用来进一步评估。AITC CY-09的抑制作用降低LPS-induced热痛觉过敏和舔,尽管老鼠AITC单独处理(数据没有明显的影响 4(一)- - - - - - 4 (c))。如图 5,AITC特定受体激动剂显著增强的表达TRPA1(图 5 (b))。此外,AITC逆转CY-09在抑制细胞内钙的活性^{2 +}水平和il - 1 β和肿瘤坏死因子- α生产(数据 5(一个)和 5 (c))。最后,NLPR3 inflammasome激活也被评估。结果表明,AITC可以逆转减少细胞质和NLPR3激活引起CY-09(图 5 (d))。