RNA表达和临床神经胶质瘤数据访问的癌症基因组图谱(TCGA)数据库。然后,边缘 R 采用微分表达分析( ∣ logFC ∣ > 2 , padj < 0.01 )。lncRNAs特异表达(DElncRNAs)和microrna (DEmiRNAs)结合位点被miRcode筛选数据库( http://www.mircode.org/?gene=%20&mirfam=&class=&cons=%20&trregi%20on=)。miRDB、TargetScan mirDIP数据库应用于预测下游基因mir - 424 - 5 - p。预测结果的重叠与差异表达mrna (DEmRNAs)收购的目标mir - 424 - 5 - p。

76对配对主要神经胶质瘤组织和相应的邻近的正常组织。手术切除患者的样本收集在西安国际医疗中心医院从2018年10月到2019年10月,证实了和他们的疾病经验丰富的病理学家。获得组织很快就在液态氮冷冻,然后存储在一个冰箱-80°C。患者知情同意签署。患者在临床病理资料 补充表 1。

人类星形胶质细胞来和人类神经胶质瘤细胞株T98G A172, SNB19, U251由中国科学院细胞提供银行(上海,中国)。杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM) + 10%胎牛血清(的边后卫)是用于细胞培养。盘子是培养经常。信息的细胞系是展出 补充表 2。

mir - 424 - 5 - p的超表达是通过转染mir - 424 - 5 - p模仿(Genepharma、上海、中国)。FAM87A-pcDNA3.1向量(GeneCopoecia、广州、中国)是用于FAM87A的过度。PPM1H淘汰赛是通过使用pLent-PPM1H-shRNA向量(广州)。Lipofectamine 2000(英杰公司)是用于细胞转染。然后,细胞培养24 h或48 h为进一步检测或提取的RNA /蛋白质。

试剂盒试剂是用于总RNA提取(表达载体、钙、美国)。mir - 424 - 5 - p表达式被Hairpin-it量化TM microrna qPCR工具包(GenePharma、上海、中国)U6作为内部参考。SYBR绿色qPCR(豆类,大连,中国)是用来检测FAM87A和PPM1H。36 b4, GAPDH是利用内部引用FAM87A PPM1H,分别。引物被列在 补充表 3。

细胞细胞溶解phenylmethanesulfonyl radioimmunoprecipitation分析缓冲区包含1%氟化(PMSF)。蛋白溶解产物是十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶上加载。然后,蛋白质被转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。后,膜与主要栽培抗体在一夜之间在4°C,之后是一个培养与次要用辣根过氧化物酶标记抗体。最后,发射极耦合逻辑基板被应用到可视化蛋白质乐队(微孔、马、美国)。抗体的信息被提供 补充表 4。

简单地说,100年 μl核提取物稀释1毫升核裂解缓冲。样本孵化与琼脂糖珠anti-AGO2抗体或非特异性鼠免疫球蛋白在一夜之间在4°C (Calbiochem、圣地亚哥、钙、美国)。样本清洗后,免疫沉淀反应RNA与试剂盒提取试剂(豆类生物)和溶解在nuclease-free水。然后,RNA被存在测量。

细胞接种于96孔板。在每一个特定的时间,细胞与100年孵化 μL MTT的解决方案,然后培养在37°C 3 h。培养后,在150年 μl溶剂,用铝箔包裹,动摇了15分钟。吸光度测量490海里。每个试验进行了3次。TMZ的治疗组(美国Sigma-Aldrich), TMZ的最终浓度为80 μmol / L TMZ时添加到实验细胞。在对照组药物二甲亚砜(DMSO)。

EdU工具包(RiboBio、广州、中国)应用于测量细胞DNA合成速率。EdU-positive显微镜下的细胞数量3个随机选择的字段。EdU-positive细胞的比率(红色荧光)Hoechst-stained细胞(蓝色荧光)是用来评估细胞增殖活动。

细胞迁移和侵袭性能力被发现通过24-well transwell腔。在迁移试验,1×10⁵细胞接种200 μL在参议院和DMEM细胞无血清培养基中加上10%的边后卫是放在下议院。在37°C孵化后24 h,入侵细胞用4%多聚甲醛和结晶紫。接下来,染色细胞数量的清点,显微镜的成像。在入侵测试中,参议院是涂以矩阵(美国BD生物科学),剩下的步骤是一样的迁移试验。

细胞被cotransfected mir - 424 - 5 - p模仿和相应的荧光素酶记者向量(FAM87A和PPM1H)。荧光素酶活性研究与荧光素酶检测试剂(美国WI Promega,菲奇堡)转染后48 h。

鱼进行了测定日博荧光原位杂交工具包和日博lncRNA鱼探针组合(日博,广州,中国)。细胞核和细胞质的分离进行了使用巴黎工具包(美国生活技术,卡尔斯巴德)符合规范。

冰冻的神经胶质瘤或鼠标肿瘤标本切成5 μ米部分,放在载玻片覆盖着赖氨酸(Sigma-Aldrich)。然后,他们被风干,用丙酮固定。在文献[包含IHC进行了描述 12]。Image-Pro + v.6.2软件(媒体控制论,罗克维尔市,医学博士,美国)来评估积极的像素强度光集成密度,用统一设置为所有幻灯片。比例的免疫反应性的区域中每个蛋白质的总截面面积计算。值了 的意思是 ± 标准 偏差 。

十二个雌性BALB / C裸小鼠(5周大;至关重要的河流,北京)在某些无菌条件下保存。体内试验进行了符合实验动物的使用指南。具体地说,一个稳定的转导细胞过表达FAM87A和控制细胞线构造,然后他们,分别接种到老鼠的左腋下。老鼠分为实验组和对照组。然后,按照体积公式( 1 / 2 × 长度 × widt h 2 ),肿瘤的大小是每周用游标卡尺测量。在第一周,所有老鼠都牺牲了,肿瘤称重。切除肿瘤是用于后续实验。

执行数据分析利用GraphPad棱镜7。数据被列为 的意思是 ± 标准 偏差 从至少3复制,通过未配对的双尾学生组之间的差异进行了比较 t 以及。皮尔森相关系数应用于评估FAM87A之间的关系和mir - 424 - 5 - p。使用kaplan - meier和Cox回归分析来确定FAM87A和神经胶质瘤的总体生存和预后之间的关系。 p < 0.05 被认为是具有统计学意义。

的边缘 R 差异分析,共有557名DElncRNAs和59 DEmiRNAs获得(图 1(一))。miRcode数据库的差异比较。然后,35 lncRNAs和8个microrna结合位点被发现。FAM87A DElncRNAs之一。生存曲线表示,神经胶质瘤患者的总体生存时间克制FAM87A短比少表达FAM87A(图 1 (b))。FAM87A表达式在76对神经胶质瘤组织和邻近的正常组织中存在了。与对应的相邻正常组织相比,FAM87A表达式很低在神经胶质瘤组织(图 1 (c))。此外,与神经胶质瘤nonmetastatic肿瘤患者相比,FAM87A抑制转移性肿瘤患者(图 1 (d))与病理阶段的增加明显降低(图 1 (e))。结合临床样本信息,我们公布了FAM87A不与患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置、和分化程度。然而,FAM87A突出与淋巴转移、TNM(补充表 1)。此外,我们分析了低品位之间的表达差异FAM87A神经胶质瘤(LGG)和胶质母细胞瘤(GBM) TCGA基于数据库,其结果是与之前的实验(图一致 1 (f))。最后,存在检测结果表明,人类神经胶质瘤细胞系FAM87A非常表达下调(图 1 (g))。4神经胶质瘤细胞系中,FAM87A T98G和A172相对较低。因此,他们选择后续在体外实验中,当T98G用于体内实验。

细胞系的FAM87A过度构建进行进一步检测。MTT检测结果表示,FAM87A超表达明显减少T98G和A172细胞生存能力(图 2(一个))。的EdU试验也表明生殖活动T98G A172细胞明显抑制过度后FAM87A(图 2 (b))。transwell化验发现,迁移和入侵细胞的数量明显减少FAM87A过度后(图 3(一个))。免疫印迹检测入侵和metastasis-related蛋白质的表达水平,而结果也表明,fibronection N-cadherin,波形蛋白、MMP9, MMP2表情拒绝而过度后的钙粘蛋白增加FAM87A(图 3 (b))。的影响促进FAM87A细胞TMZ的电阻进行了测试,发现两种癌细胞的耐药性TMZ FAM87A的过度表达(图后显著降低 3 (c))。根据上述实验数据,FAM87A会部分作为一个肿瘤抑制神经胶质瘤的恶性发展。鱼和亚细胞分离的结果表明FAM87A基本上是分布在细胞质(图 2 (c))。

首先,下游调节microrna FAM87A miRcode数据库中的预测和交叉DEmiRNAs获得5 microrna (mir - 424, mir - 96, mir - 195, mir - 497,和mir - 93)(图 4(一))。只有mir - 424与预后呈负相关(图 4 (b)),可以促进各种类型的癌症的发生,可以使用作为一个潜在的标记( 13, 14]。因此,mir - 424 - 5 - p被选中作进一步探索。与paracancerous组织相比,mir - 424 - 5 - p的表达在神经胶质瘤组织调节和消极的表达水平与FAM87A(数字 4 (c)和 4 (d))。结合位点的FAM87A和mir - 424 - 5 - p利用miRcode预测。dual-luciferase报告基因的结果显示,加速mir - 424 - 5 - p克制的表达与野生型细胞(WT) FAM87A但没有影响细胞的表达和突变FAM87A(狗)。之间的绑定关系mir - 424 - 5 - p和FAM87A显示(图 4 (e))。结果进一步证实了撕裂试验(图 4 (f))。此外,影响了FAM87A在T98G mir - 424 - 5 - p和A172细胞被发现。结果公布,mir - 424 - 5 - p细胞中的表达与过表达FAM87A显著降低(图 4 (g))。这些发现提出,在神经胶质瘤,mir - 424 - 5 - p被FAM87A直接行动,和FAM87A与mir - 424 - 5 - p限制活动mir - 424 - 5 - p。

然后,救援实验进行了神经胶质瘤细胞系T98G A172。MTT结果显示,细胞活性明显增加过度后mir - 424 - 5 - p时明显抑制过度后mir - 424 - 5 - p和FAM87A同时(图 5(一个))。显然,更多的肿瘤细胞迁移和入侵后培养mir - 424 - 5 - p,而这些能力下降后加速mir - 424 - 5 - p和FAM87A在一起(图 5 (b))。后增加mir - 424 - 5 - p,抵抗细胞TMZ显著增加,而抗细胞TMZ减弱时,mir - 424 - 5 - p和FAM87A同时培养(图 5 (c))。这些结果表明,FAM87A可以直接通过相互作用调节神经胶质瘤细胞的发展mir - 424 - 5 - p。

下游监管目标基因mir - 424 - 5 - p的预测的生物信息学数据库,然后预测结果与DEmRNAs重叠和9 DEmRNAs (PPM1H、ANKRD33B PCDHAC2, RSPO3, SPTBN2, UNC13A, KIF5A, SYT4,和HTR2A)与被收购结合位点(数字 6(一)和 6 (b))。之间存在着高度的相关性FAM87A PPM1H,和PPM1H突出积极与神经胶质瘤患者的存活率(数字 6 (c)和 6 (d))。因此,PPM1H被选为研究对象。存在结果表示,PPM1H特别是压抑的神经胶质瘤组织,积极与FAM87A相关和负相关mir - 424 - 5 - p(图 6 (e))。在细胞水平上,影响FAM87A和mir - 424 - 5 - p PPM1H蛋白表达。结果表明,FAM87A急忙PPM1H的表达,而mir - 424 - 5 - p的过度抑制PPM1H(图 6 (f))。的结合位点mir - 424 - 5 - p和PPM1H Targetscan被发现。Dual-luciferase报告基因分析结果表明,促进mir - 424 - 5 - p细胞的荧光素酶活性下降PPM1H 3 ′ utr WT,荧光素酶的活性细胞PPM1H 3 ′ utr傻瓜没有影响(图 6 (g))。把测试T98G细胞表明FAM87A的过度表达可以抑制PPM1H绑定和mir - 424 - 5 - p(图 6 (h)),这表明FAM87A高度可能竞争性结合与PPM1H mir - 424 - 5 - p,从而调节神经胶质瘤的发展。

此外,sh-PPM1H被用来构造与si-PPM1H细胞系,和角色的PPM1H神经胶质瘤是探索通过一系列细胞功能。MTT测定结果表明,沉默PPM1H提升T98G和A172细胞(图的可行性 6(我))。Transwell结果表明T98G和A172细胞的迁移和入侵后被显著增强PPM1H沉默(图 6 (j))。沉默的影响PPM1H细胞TMZ的电阻进行了测试,发现癌细胞的耐药性TMZ PPM1H安静后(图明显增加 6 (k))。PPM1H这些结果显示,作为一个肿瘤抑制神经胶质瘤,可以抑制神经胶质瘤的生物学功能。FAM87A可能调节PPM1H调解神经胶质瘤的发展通过绑定mir - 424 - 5 - p有竞争力。

以上结果证明,FAM87A / mir - 424 - 5 - p / PPM1H信号轴调节神经胶质瘤的生物学功能。然后,我们进一步探讨了潜在的信号通路。通过基因和基因组的京都百科全书(KEGG)通路富集分析FAM87A / mir - 424 - 5 - p / PPM1H,我们发现三种RNA都丰富的磷脂酰肌醇信号通路(补充图 1)。PI3K / Akt通路是最密切相关的扩散和转移的癌症。挖掘是否FAM87A / mir - 424 - 5 - p / PPM1H信号轴调制PI3K / Akt信号通路,我们急忙FAM87A或沉默PPM1H T98G A172细胞PI3K和Akt上确定它的影响。p-PI3K发现表达,表达水平和p-Akt T98G和A172细胞显著下调后overexpressing FAM87A沉默PPM1H后当他们显著的调节。表达p-PI3K和p-Akt没有明显不同于空白组后沉默PPM1H和overexpressing FAM87A在一起(图 7(一))。这些结果证明,FAM87A / mir - 424 - 5 - p / PPM1H信号轴可能PI3K / Akt信号通路的调节。

细胞与模仿向量注入左腋窝小鼠作为对照。结果公布了,肿瘤生长的超表达非常有限群FAM87A与空白组相比 p < 0.05 )(图 8(一个))。肿瘤与过表达FAM87A比控制肿瘤(数据更小、更轻 8 (b)和8 (c))。此外,包含IHC建议Ki67的表达和提高PPM1H表达在肿瘤中FAM87A(数字 8 (d)和 8 (e))。蛋白质表达水平的入侵,metastasis-related后被发现FAM87A的过度。发现,fibronection的表达,N-cadherin,波形蛋白,MMP9, MMP2被拒绝而过度后的钙粘蛋白表达促进FAM87A(图 8 (f))。通过这些结果,FAM87A体内抑制肿瘤的生长。