Imrecoxib收购从Biofount生物技术有限公司(中国,北京)。这些抗体都从Abcam获得。

小鼠治疗百草枯被杀,他们的肺部被取出,切成小块。然后,我们消化肺胰液素和孤立肺纤维化细胞样品。然后,我们培养和筛选主肺纤维化(PPF)细胞可以在体外增殖稳定。

HFL1细胞起源于上海四新生物技术有限公司有限公司HFL1细胞和孤立的原发性肺纤维化细胞在DMEM培养基培养是含10%胎牛血清的边后卫在无菌孵化器在37°C和5%的股份有限公司₂的气氛。人肺腺癌上皮细胞系A549 rpmi - 1640年培养基培养。

肺腺癌上皮细胞A549接种在6-well板该文就近年来关于百草枯所致。发生并设置对照组,对照组与正常培养rpmi - 1640中,该文就近年来关于百草枯所致组发生但rpmi - 1640年培养基培养了20 μmol / L百草枯。A549细胞培养5天在37°C和5%的股份有限公司₂条件。第三天,对照组的介质代替了新鲜培养基,该文就近年来关于百草枯所致集团发生的媒介与20代替新鲜培养基 μmol / L百草枯。直到第五天A549细胞培养。

HFL1细胞和PPF细胞与imrecoxib或没有imrecoxib接种于96孔板和培养一定时间37°C和5%的公司₂条件。24或48小时后,MTT试剂放入,然后细胞保持在黑暗的另一个4 - 6小时。此后,DMSO溶液添加到反应10分钟,96 -孔板都摇动了充分溶解的水晶细胞。然后,在波长570 nm,每个的光吸收值被标仪测量。对照组细胞生存能力和imrecoxib-treated组graphpad棱镜5计算软件。

马克用记号笔在无菌6-well板的底部。然后,HFL1或PPF细胞被添加在一个无菌6-well板和培养在一个孵化器。细胞confluency接近100%时,一条直线与无菌吸管刮在细胞表面技巧。然后,细胞无血清培养系统在有或没有imrecoxib 24小时,和6-well板被0,6日,12日和24小时,分别和细胞迁移距离的不同群体在不同时间点被记录。

提前准备人工基底膜和无血清培养基稀释,把它放到Transwell的上院,然后用imrecoxib添加细胞悬液或没有imrecoxib凝固后的基底膜基质。无血清培养基放入上方,含有血清培养基是众议院。文化的细胞条件37°C, 5%的公司₂为24小时。Transwell室被与戊二醛固定,然后多余的戊二醛溶液被PBS洗。此后,细胞被hexamethylpararosaniline染色,用棉签擦上细胞。最后,入侵细胞在显微镜下拍摄,和入侵细胞的数量在不同的组被记录。

准备治疗或未经处理的细胞样本,提取RNA与试剂盒试剂。RNA浓度确定后,PCR反应体系制定基于荧光RT-qPCR工具包的协议,和PCR循环进行。蜗牛的序列是F: 5 ′ -TCGGAAGCCTAACTACAGCGA ′ R: 5 ′ -AGATAGCATTGGCAGCGAG-3 ′ 。的引物序列 β肌动蛋白F: 5 ′ -CCTGTACGCCAACACAGTGC-3 ′ R: 5 ′ -ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3 ′ ;钙粘蛋白的引物序列F: 5 ′ -TGGACAGGGAGGATTTTGAG-3 ′ R: 5 ′ -ACCTGAGGCTTTGGATTCCT-3 ′ 。的引物序列波形蛋白F: 5 ′ -GAGAACTTTGCCGTTGAAGC-3 ′ R: 5 ′ -CTCAATGTCAAGGGCCATCT-3 ′ 。反应条件如下:95°C predenaturation 10分钟,95°C 10年代,60年代60°C, 40个循环进行。三个复制井每个基因,基因表达计算使用2^{- - - - - - ΔΔCt}方法。实验重复三次。

治疗或未经处理的细胞被放置在冰和对待里帕溶解产物为20分钟。和EP的细胞收集管和离心获得蛋白质样品。所有蛋白质样本调整到相同的浓度,和聚丙烯酰胺凝胶电泳一步进行单独的不同分子量的蛋白质。然后,凝胶的蛋白质转移到硝化纤维素(NC)的电影。硝化纤维素膜的疏水结合位点被封锁BSA为5%。阻塞后,膜与初级抗体NF -补充道 κB (Abcam, 1: 1000),蜗牛(Abcam, 1: 500), GAPDH (Abcam, 1: 2000)和孵化一夜之间在4°C。然后,添加相应的辣根过氧化物酶标记二次抗体反应在黑暗中1小时。最后,根据蛋白质检测和拍照BeyoECL +化学发光试剂盒的操作(Beyotime)。

所有记录的数据分析了SPSS19.0软件,和所有的数据被记录的 的意思是 ± SD 。一个 P 被认为具有统计显著性值小于0.05。

探讨百草枯对A549细胞epithelial-mesenchymal转换的影响,我们对A549细胞分为对照组该文就近年来关于百草枯所致组织发生和。两组A549细胞的RNA提取RT-qPCR试验,和内容的钙粘蛋白和波形蛋白A549细胞的两组是由蛋白质印迹。数据表明,该文就近年来关于百草枯所致组发生钙粘蛋白的表达在低得多,但恰恰相反,波形蛋白的表达明显高于(数字 1(一)- - - - - - 1 (c))。这些结果表明,百草枯在A549细胞,可以抑制钙粘蛋白的表达而促进波形蛋白表达,百草枯可以诱导A549细胞的epithelial-mesenchymal转换。

NF - κB /蜗牛EMT过程中是一个非常重要的信号通路。为了研究在NF -百草枯的功效 κB /蜗牛A549细胞信号通路,我们提取的信使rna和蛋白质该文就近年来关于百草枯所致群发生对照组和A549细胞,分别执行RT-qPCR和免疫印迹试验来研究百草枯的影响在NF -信使rna和蛋白质 κ在A549细胞B和蜗牛。我们的数据表明NF的mRNA水平 κB和蜗牛的A549细胞paraquat-treated组明显高于对照组(数字 2(一个)和 2 (b))。此外,免疫印迹结果也证明了蛋白表达与mRNA(图一致的趋势 2 (c))。上述结果证实,百草枯诱导NF - κB /蜗牛在A549细胞信号通路。

原发性肺纤维化细胞(PPF)是一种细胞与间质表型,从肺中提取的paraquat-treated老鼠。PPF细胞组分为两组:对照组和imrecoxib-treated组。根据麻省理工的结果,PPF细胞的细胞生存能力处理imrecoxib低于没有imrecoxib(图 3(一个))。结果表明,imrecoxib可以抑制PPF细胞的增殖。此外,细胞愈合化验的结果和transwell透露,PPF的入侵和迁移能力细胞imrecoxib-treated组与对照组相比弱得多。换句话说,imrecoxib可以显著抑制PPF的入侵和迁移能力的细胞(图 3 (b))。以上实验表明,imrecoxib可以抑制增殖,PPF细胞的迁移和入侵功能。

HFL1与间充质细胞是一种人类胎儿肺纤维化细胞表型。类似的结果imrecoxib PPF细胞,MTT试验表明,imrecoxib可以抑制HFL1细胞的增殖(图 4(一)),愈合试验表明,imrecoxib可以抑制HFL1细胞的迁移(图 4 (b))。这些结果表明,药物imrecoxib还可以抑制增殖和迁移HFL1细胞。

我们进一步研究了imrecoxib对EMT的A549细胞的影响由百草枯诱导。我们设置三组:对照组(未经处理的A549细胞),imrecoxib-treated集团与imrecoxib该文就近年来关于百草枯所致A549细胞发生(治疗),paraquat-induced集团该文就近年来关于百草枯所致A549细胞发生()。我们测量的内容钙粘蛋白和波形蛋白免疫印迹在三组,分别。结果显示,A549细胞的钙粘蛋白水平在对照组最高,其次是在该文就近年来关于百草枯所致组发生imrecoxib-treated集团和最低的。与钙粘蛋白表达,对照组A549细胞波形蛋白表达的是最低,imrecoxib-treated集团名列第二,该文就近年来关于百草枯所致集团发生的A549细胞波形蛋白表达是最高的(图 5(一个))。上述实验结果表明,imrecoxib可以影响EMT-related蛋白的表达;该文就近年来关于百草枯所致EMT在发生具体来说,imrecoxib可以抑制A549肺上皮细胞。

我们的实验已经证实,百草枯诱导NF - κB /蜗牛A549细胞的信号通路。接下来我们需要学习什么是imrecoxib和信号通路之间的关系。我们将A549细胞分成三组:对照组(未经处理的A549细胞),imrecoxib-treated集团与imrecoxib该文就近年来关于百草枯所致A549细胞发生(治疗),paraquat-induced集团该文就近年来关于百草枯所致A549细胞发生()。首先,我们测量了NF - microrna的转录水平 κB和蜗牛的A549细胞由RT-qPCR三组。结果显示的mRNA水平NF - κ该文就近年来关于百草枯所致组最高,发生B和蜗牛的mRNA水平对照组是最低的,与mRNA水平imrecoxib-treated组该文就近年来关于百草枯所致组织发生,对照组之间。上述结果证实imrecoxib可以抑制NF -的mRNA水平 κ该文就近年来关于百草枯所致A549细胞(图发生和蜗牛 6(一))。我们进一步研究了imrecoxib NF -的影响 κ该文就近年来关于百草枯所致A549细胞发生B和蜗牛蛋白免疫印迹,表明两个蛋白质含量是该文就近年来关于百草枯所致A549细胞组织发生最高的和最低的A549细胞对照组。两个蛋白质含量imrecoxib-treated组该文就近年来关于百草枯所致组织发生和对照组之间。我们的数据表明,imrecoxib可能影响NF -的表达 κ该文就近年来关于百草枯所致A549细胞发生B和蜗牛蛋白;具体来说,imrecoxib可以抑制NF -的表达 κ该文就近年来关于百草枯所致A549细胞发生B和蜗牛蛋白(图 6 (b))。上述实验结果证实imrecoxib不仅可以抑制NF -的转录水平 κ该文就近年来关于百草枯所致A549细胞发生B和蜗牛还可以抑制蛋白表达水平。