近年来,三维光学成像技术已经成为流行(SPIM共聚焦显微镜、双光子显微镜,选择,和multifocel显微镜)( 1- - - - - - 4]。他们中的大多数已经成为标准的成像技术。还并发高分辨率成像的趋势(SIM, STED还是棕榈,和风暴)( 5- - - - - - 8]。这些都是能产生大量的数据形式的三维数据集。但随着问题和解决它们生成的数据集通常非常多样化,一般很少解释工具。有许多标准的图像处理程序,商业(伊万里瓷器,Volocity、惠更斯等)( 9- - - - - - 11),免费软件(MevisLab Drishti,等等)。 12, 13),以及开源(斐济、ImageJ、冰冷、BioImageXD等等。)( 14- - - - - - 17];然而,他们大多为可视化和一些常见的分析而设计的。通常所需的工具或算法分析一个给定的数据集是没有现成的,必须实现内部用户。量化和空间定位在3 d数据集可以告诉我们关于交互的结构成像,可以推导机制功能所必需的可见的图像。纯数据可视化本身通常是非常翔实,但量化和统计分析的数据可以显示特性或趋势不是显而易见的目视检查。

在适应性免疫反应,特殊细胞位于真皮称为树突状细胞(dc),使用淋巴管运输pathogen-derived材料消耗周围淋巴结(pln),在那里他们激活T淋巴细胞靠近中心的淋巴组织(T细胞区或副皮质区)。DC迁移从皮肤到PLN需要promigratory受体CCR7表达,对分泌蛋白质配体CCL19和CCL21表示在淋巴管以及t细胞区( 18]。在他们的旅途中,真皮DCs需要穿过内皮细胞层形成真皮的淋巴管腔。在很大程度上是被动运输最近端排水PLN DCs穿过第二个障碍PLN的外缘,被膜下的窦(SCS) [ 19]。CCR7参与都被认为是真皮DCs进入淋巴管以及他们轮回通过SCS进入深t细胞区。实验,这个过程可以通过皮下注射完成 在体外激活DCs,然后迁移以下12-36小时之内向最近的pln排水。虽然这些实验CCR7在这个过程中,发现了一个绝对要求CCR7的精确的贡献及其配体的两个processes-lymphatic条目与SCS egress-has迄今为止未被彻底调查。

我们使用选择性平面照明显微镜(SPIM)生成的三维体元数据集荧光标记DCs和高内皮小静脉(HEV)在小鼠淋巴结。分析这些数据,有足够的分辨率解决单一DCs,我们实现了一个算法在MATLAB量化DCs的空间分布和戊肝病毒在完整的淋巴结。我们使用这个算法比较野生型小鼠之间的空间分布和plt / plt突变,而缺乏CCR7受体的配体。这不仅使我们能够量化DCs的数量在每个PLN-a衡量能力的迁移从真皮淋巴节点但他们的器官内的分布,这使我们能够确定有效的DCs在发现他们的t细胞区。

实现高分辨率成像深处完整器官(效果对象)或组织( 20.),SPIM是最方便的成像技术 2]。这项技术是基于照明荧光标记在以下方式:一张激光穿透整个样本,照亮一个平面成像的组织。检测到荧光体发射信号的入射光正交表。只有荧光团位于飞机的光表感到兴奋,我们实现光学切片。通过光表扫描样本结果在3 d立体像素数据堆栈。这种成像的一个重要的先决条件是要有一个透明的样品;作为淋巴结情况调查在这项研究中,如果原生状态的组织是不透明的,它必须是清除化学,执行 体外成像。关于SPIM的更多详细信息,请参阅[ 2]。标签有不同荧光标记的不同特征在样本生成3 d数据集与多个频道。我们应用SPIM技术来定位和量化白细胞亚种群在完整的小鼠淋巴组织和血管网络为了检查我们的生物成像方法的有用性相关的问题。特别是,我们测试了其配体的相关性在淋巴管和深t细胞区域高效直流积累。

量化直流积累及其与戊肝病毒,PLN的中心的距离和距离最近的邻国戊肝病毒计算。所需的最近邻计算找到最接近的戊肝病毒是通过创建和比较体素列表,列表的质量中心的坐标(分段DCs的CoMs),和所有的分段压在戊肝病毒。分段和过滤后强度和大小,为每一个对象 p CH1 (DCs)的坐标CoM比较所有signal-containing像素点的坐标 我 CH2 (HEV),计算各自的距离( d p , 我 = ( x p - - - - - - x 我 ) 2 + ( y p - - - - - - y 我 ) 2 + ( z p - - - - - - z 我 ) 2 CoM对象之间的欧式距离吗 p (CoM_p)和体素 我 CH2)。每个对象的最小距离 p CH2体素, 最小值 我 ( d p , 我 ) ,然后用于构造直方图。注意,方法是快速只有稀疏数据集(应用)但不是最有效的关于最近邻搜索(NNS)一般(例如,一个八叉树方法是快速密集的情况下)。详情,请参阅部分 3。距离的计算中心的淋巴结是类似的:我们假设PLN的中心的CoM戊肝病毒(CoM_戊肝病毒),然后计算dist (CoM_p,CoM_戊肝病毒)为每一个对象 p 。CH2有效成为一个元素的体素列表,一个元素被CoM_戊肝病毒。

代的树突细胞从骨髓(BMDCs)和PLN样品制备完成如下:DCs被培养骨髓细胞生成的C57BL / 6小鼠胫骨和股骨7 - 8天RPMI 1640/10%胎牛血清(FCS)补充FLT3配体为DC成熟的代理。在文化的最后24小时BMDCs与脂多糖(LPS)刺激(1 μg / mL;σ)。激活BMDCs被有力的收获从盘子移液和洗磷酸盐(PBS) w / o Ca^{2 +}和毫克^{2 +}。激活和表型的BMDCs经流式细胞术与直流染色标记CD11c (HL3) CD11b (M1/70)和CD86 (GL1 mab)。收获BMDCs RPMI1640/10% FCS贴上CellTracker橙色(CMTMR;5 μ米30分钟),清洗和皮下注射(1 × 10⁶在20 μL RPMI 1640/10% FCS)进入后及其sex-matched接受者C57BL / 6小鼠C57BL / 6^{plt / plt}老鼠。一天后BMDCs转移,10 - 15 μ克Alexa594-coupled台面式晶体管- 79马伯静脉注射到老鼠收件人以可视化戊肝病毒网络淋巴结。20分钟后,老鼠牺牲,footpad-draining腘pln PFA切除和固定在0.4% / PBS一夜之间。固定pln被转移到冰冷的PBS和立体显微镜下仔细清洗从周围的脂肪组织。清洗和固定pln存储在0.1%叠氮化钠在4°C / PBS脱水在甲醇和清算在巴伯所描述的 21]。

我们拍摄整个排水pln隔绝老鼠收到preactivated荧光标记DCs 18 h老鼠前牺牲了(我们的第一频道:CH1)。此外,我们成像的广泛PLN-specific postcapillary网络戊肝病毒作为解剖学标志(第二个渠道:CH2)。见图 1SPIM重建明确确定单一DCs,大多位于对野生型老鼠pln的中心。我们也能够发现从中央积累的DCs PLN的边缘附近的一个位置,SCS所在地。这种条纹最有可能反映了道路中央DCs到来后取自SCS向中央t细胞区。

手动检查的单片给出了一个渠道的相对分布在这个特定的切片,但是很难捕捉到3 d上下文(数字 1(c)和 1(d))。最大值投影创建一个图像,显示了更多的示例,但是它是不可能告诉任何关于第三个维度(数字 1(一)和 1(b))。我们开发了一个算法量化收养DCs转移到最近的点的距离在戊肝病毒网络以及PLN的中心作为积累在深的替代标记t细胞区域。处理数据,算法管道(图 2)使用标准的图像处理方法,如26-connectivity分割对象和CoM或卷( V)计算分割对象。内在的知识对象的大小用来丢弃信号强度阈值过程中幸存下来。阈值水平的选择影响CoM估计的准确度和精密度 22),但将在稍后讨论。在左边的路径处理管道(CH1,数据处理DCs),小物体要么源自像素错误,组织自体荧光,或其他文物,而大型对象可以是荧光杂质(如粉尘)已经嵌入在示例安装过程( 23]。这两种情况下必须排除在外,留下一个窗口中的对象大小DCs的政权。我们一直保守3.2通过指定一个窗口 μ米至18.5 μm直流直径计算的一个有效信号,直流平均直径约为 12 ± 2 μ米( 24]。正确的路径图 2(CH2,戊肝病毒),应该有理想情况下只有一个对象,因为它是一个连接管穿透整个PLN网络。因此,小物体可以在下游计算CH2被排除在外。

探讨的影响受体CCR7在淋巴结内的免疫功能,我们利用C57BL6^{plt / plt}(plt / plt)老鼠,一种天然的变异老鼠应变,缺乏CCL19和CCL21蛋白质在PLN的t细胞区,同时保持表达式的第二个CCL21同种型淋巴管。虽然之前已经报道过,皮下注射DCs积累较低效率的t细胞区plt / plt pln与野生型相比pln [ 25),目前还不清楚到什么程度的减少累积的DCs plt / plt PLN是由于进入受损皮肤淋巴管和减少通过SCS屏障迁移。因此,我们做了个实验,相同数量的DCs应用于野生型老鼠注入脚垫plt / plt老鼠,之后动物祭祀18 h和随后SPIM分析。

我们器官数据显示整体显著减少plt的DCs / plt PLN,表明dc迁移到皮肤淋巴管plt / plt减少小鼠(在我们的例子中,我们有5700年和7934年发现细胞wt / wt老鼠相比,2318年和427年细胞plt / plt老鼠)。更重要的是,3 d空间分布中的DCs plt / plt pln戏剧性地从野生类型不同,与大多数DCs在外围地区保留在靠近或在SCS。不同分布的野生型和plt / plt pln直方图图 3清晰地显示出这种效果。野生型的人物 3(一)和 3(c)),平均距离的DCs PLN的中心 330年 ± 130年 μ米,而plt / plt(数字 3(b)和 3(d)) 500年 ± 150年 μm。这个结果是明确尽管plt / plt pln通常比野生型的小老鼠。注意规范PLN的中心是一个粗略的估计。它不需要精确的指定一个真实的空间中心,所以首先我们假设计算持有戊肝病毒,其次瞄准精度高变得过时了。

进一步量化DCs的行为之间的区别在野生型和突变pln,我们评估了分布的DCs有关他们的最小距离下一个戊肝病毒,所以我们有一个NNS-problem 3 d数据集。选择的方法(比较立体像素坐标)之间的权衡计算成本和执行时间。它是一种线性搜索和最简单的方法得到,因为它没有考虑空间依赖关系(我们在一维空间中只考虑距离)。在这项研究中,使用的pln代样品及其制备和扫描过程需要好几天,而执行的计算分析与算法通常需要几十分钟样本。因此,计算时间并不是限制因素在我们的系统吞吐量,所以一个线性搜索算法是完全令人满意。如果应用程序出现要求减少计算时间,更有效的算法对计算时间可以轻松实现,如使用八叉树( 26),或者当我们寻找欧式距离,方法类似于vp-tree算法( 27, 28]。

在野生型,DCs预计将从他们的入口点迁移到副皮质区(或t细胞区),他们将与t细胞相互作用,使一个适应性免疫反应。然而,这种迁移是依赖于直流反应化学引诱物CCL21,生成在野生型PLN的副皮质区,但没有在plt / plt突变。我们观察到plt的DCs / plt老鼠,保持靠近他们的入口点外围SCS-have两个较小的平均距离戊肝病毒(数字 4(b)和 4(d))和一个更大的距离淋巴结(的中心人物 3(b)和 3(d))。他们不迁移远离周围区域的高密度戊肝病毒(可以观察到图 1(d),戊肝病毒非常密集的外围plt / plt PLN)。与 39 ± 31日 μm, plt / plt平均距离小得多比wt / wt的平均距离 66年 ± 31日 μm。广泛分布在wt / wt(比较数据 4(一)和 4(c)的数据 4(b)和 4(d))是由DCs坐落在深t细胞区PLN的核心(戊肝病毒网络密度不如在外围)和附近的SCS(网络非常密集)。

来验证我们的算法,我们数字解剖区域的兴趣足够小的公共科学图书馆手工计数DCs的目视检查。比较人工计数的结果我们的算法取得了协议在2 - 3%(数据没有显示)。我们属性差异的统计变化的直流信号水平和难以区分DCs非常接近。在任何情况下,这些小错误在直流识别预计不会对我们的分析的结果有重大影响。CoM计算引起的误差来确定位置的DCs几乎小到我们有一个球形和高度特定的染色与一个明显的信号。阈值过程离散化偏差和平均偏差的影响 22),但诱导测量距离相比误差很小,不影响我们的结论。出于同样的原因,我们没有目标使用更复杂的定位方法精度更高的定位。

为了得出结论对生物感兴趣的行为,背后的机制是很重要的综合量化细胞分布在一个organ-wide上下文。量化的空间定位的正确理解是至关重要的一个器官之间的相互作用机制不同的组成部分。我们演示了一个免疫问题的定量计算分析的应用,可以用来研究3 d细胞机制。快速和可靠的统计3 d交互属性的相互距离的成员组不同的细胞类型和/或形态学特征在大型数据集获得空间扩展器官或组织可以帮助揭示潜在机制及其功能意义。我们的数据量化的行为的差异在野生型和plt / DCs plt pln老鼠。它表明DCs的运输PLN大约减少80%(如图所示的DCs中发现plt / plt PLN),及其后续迁移在这些器官(如量化表示的DCs的分布,特别是大约50%增加距离PLN)的中心是在突变小鼠受损。的方法可以应用于广泛的生物和医学问题的疾病机制的背景下,特别是考虑到数据从小说深层组织成像技术,如SPIM现在变得容易。特别是,我们的研究结果现在之前挑战场馆的研究可行的,如评估T-lymphocyte-DC互动的频率与生理上低数量的细胞。