在当前的研究中使用的老鼠是由复旦大学实验动物中心提供。成年男性Sprague-Dawley老鼠重230 - 250克(8 - 10 w)被用于这项研究。动物被安置与12 h light-12 h暗周期和免费获取标准颗粒食物和水在整个实验过程。所有的实验都是复旦大学的经当地伦理委员会批准。

实验,成年男性Sprague-Dawley老鼠被随机分为五组:一个虚假的操作组,MI组和MI与药物治疗组(15、30和60毫克/公斤)。药物溶解在DMSO(二甲亚砜)。药物注射腹腔手术后6周每天一次。虚假的操作组和MI组注射只有DMSO根据动物的体重。诱导心肌梗死前,动物被插管和人工通气啮齿动物呼吸机(dhx - 150,中国)与7%水合氯醛麻醉(60毫克/公斤i.p)。左前降枝冠状动脉的结扎了5缝合,1 - 2毫米低于左心房附件( 19]。六周后手术,后测量血流动力学参数,代表每组大鼠的心脏切除和PBS洗。整个LV是储存在-80°C。

左心室压力测量通过一个盐水填充插管插入正确的颈动脉和连接到一个压力传感器。套管是插入到左心室监测左心室收缩压(LVSP)和左室舒张末压(LVEDP),以及测量的最大速度上升的左心室压力上升速率( d P / d t )。

手术六周后,大鼠的全血是离心机(3000 r / min, 10分钟,4°C)获得血清。抗氧化剂酶活性的丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH),谷胱甘肽过氧化物酶(氧化酶),以及谷胱甘肽S-transferase(销售税)测定血清。猫MDA, SOD、谷胱甘肽氧化酶,销售税水平衡量使用商用设备根据制造商的指示(南京建成生物技术研究所,中国)。

MDA活性测定通过添加1毫升标准管标准的代理。接下来,1毫升无水乙醇添加到空白管。然后,1毫升的样本添加到样品管和控制管。很长一段的管子都摇动了。然后,3毫升的试剂2添加到所有的管子,然后,1毫升的试剂3添加到标准管,空白管,样品管。接下来,1毫升50%冰醋酸是添加到控制管。管是混合和覆盖着塑料包装。一个小洞在塑料包装。管是在95°C的环境为40分钟,冷却流的水。管是在3000 - 4000转离心10分钟。 The absorbance of the supernatant was measured using a plate reader at 532 nm.

猫的活动是衡量第一次准备积极控制管和样品管。然后,0.1毫升的血清添加到样品管,和1.0毫升的试剂1和0.1毫升的试剂2,都保持在37°C,被添加到每个管。他们被孵化瓶在37°C 1分钟。之后,1.0毫升的试剂3和0.1毫升的试剂4被添加到所有管。然后,0.1毫升的血清添加到积极的控制管。最后,吸光度是使用板读者阅读405海里。

测定谷胱甘肽活动,样品的准备如下:0.5毫升的样品和试剂的缓冲区1混合,在3000 - 4000转离心10分钟。然后,1毫升的样品上层清液加入样品管,而1.0毫升的试剂1和1.0毫升的标准20 μmol / l水谷胱甘肽被添加到空白管和积极控制管。1.25毫升的试剂2,0.25毫升的试剂3和0.05毫升的试剂4被添加到每个管。吸光度是使用板读者阅读420海里。

SOD活性测定如下:0.5毫升的样品和缓冲1.0毫升试剂1涨跌互现;与此同时,0.5毫升的水和1.0毫升的缓冲试剂1阳性对照为涨跌互现。0.1毫升的试剂2,3和4是添加到样品管和积极控制管。然后,所有的管道都是在37°C的环境正是40分钟。2.0毫升的颜色试剂添加到每个管。最后,所有的管道都是在室温下放置15分钟。吸光度是使用板读者阅读550海里。

氧化酶活力测定首先添加0.2毫升的水1 l更易与谷胱甘肽的控制管和样品管。然后,0.1毫升的样本添加到样品管。所有的管道和试剂1保持在37°C 5分钟。然后,0.1毫升的试剂1添加到每个管。所有的管道都是在37°C的环境正是5分钟。两种试剂2毫升被添加到每一个管,和0.1毫升的样本添加到控制管。管是在3000 - 4000转离心10分钟。一毫升的上层清液控制管和样品管被转移到新管标签一样旧的管子。同时,1毫升的谷胱甘肽标准缓冲添加到空白管和1毫升的水20 μmol / l谷胱甘肽是添加到标准管。然后,1毫升的试剂3、0.25毫升的试剂4和0.05毫升的试剂5添加了所有的管子。板上覆盖和孵化瓶在室温下15分钟。最后,吸光度是使用板读者阅读412海里。

GST活性测定首先添加0.3毫升的水1 l更易与谷胱甘肽的控制管和样品管。然后,0.1毫升的样本添加到样品管。管是混合和孵化37°C 30分钟。然后,2毫升的试剂2添加到所有的管子。接下来,0.1毫升的样本添加到控制管。管是在3000 - 4000转离心10分钟。一毫升的上层清液控制管和样品管被转移到新管标签一样旧的管子。然后,2毫升的谷胱甘肽缓冲区和2毫升的水20 μmol / l谷胱甘肽被添加到空白管和标准管。最后,2毫升的试剂3和0.5毫升的试剂4被添加到所有的管子。管是在室温下15分钟,孵化和吸光度是使用板读者阅读412海里。

心脏细胞总RNA分离用试剂盒(表达载体,卡尔斯巴德,CA)如前所述。RNA浓度决定通过测量吸光度在260海里。逆转录(RT)是由使用PrimeScript™第一链cDNA合成装备根据制造商的推荐协议。由上海Sangon rt - pcr引物的合成生物工程技术服务有限公司,有限公司,中国。用于放大合成的引物如下:TNF - α前5 ′ -ATGAGCACGGAAAGCATGATCCGA-3 ′ 5、反向 ′ -CCAAAGTAGACCTGCCCGGACTC-3 ′ ;il - 1 β前5 ′ -ATGGCAACTGTCCCTGAACTCAACT-3 ′ 5、反向 ′ -CAGGACAGGTATAGATTCAACCCCTT-3 ′ ;bcl - 2前5 ′ -CGGGAGAACAGGGTATGA-3 ′ 5、反向 ′ -CAGGCTGGAAGGAGAAGAT-3 ′ ;伯灵顿向前5 ′ -GCAGGGAGGATGGCTGGGGAGA-3 ′ 5、反向 ′ -TCCAGACAAGCAGCCGCTCACG-3 ′ ;caspase-3向前5 ′ -CTGGACTGCGGTATTGAG-3 ′ 5、反向 ′ -GGGTGCGGTAGAGTAAGC-3 ′ ;TGF - β前5 ′ -CGCAACAACGCAATCTATG-3 ′ 5、反向 ′ -AGCCCTGTATTCCGTCTCC-3 ′ ;collagen-1向前5 ′ -CATAAAGGGTCATCGTGGCT-3 ′ 5、反向 ′ -TGTTCTCAATCTGCTGGCTCA-3 ′ ;和GAPDH向前5 ′ -TTCAACGGCACAGTCAAGG-3 ′ 5、反向 ′ -CGGCATGTCAGATCCACAA-3 ′ 。PCR产品被在1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。每个乐队被拍到和量化的强度通过使用Bio-Rad iQ5系统(Bio-Rad实验室、CA、美国)作为目标的比率在GAPDH基因。

冷冻LV标本在溶解分散机械缓冲。溶菌产物离心机在10000 r / min 10分钟在4°C,和上层的收集。蛋白质浓度量化使用一个增强BCA蛋白质分析工具包(Beyotime生物技术、海门、中国)。蛋白质浓度测定后,30 - 50 μ克蛋白质由sds - page分离,electrophoretically转移到PVDF膜和阻塞在一夜之间1%的脱脂牛奶TBS在4°C。这些墨迹孵化与特定的bcl - 2主要抗体,伯灵顿,一种蛋白激酶,在室温下和p-Akt 2 h,水洗,然后用适当的孵化peroxidase-conjugated二级抗体。bcl - 2、Bax、Akt phosphor-Akt抗体和山羊anti-rabbit免疫球蛋白与过氧化物酶共轭从圣克鲁斯生物技术,获得圣克鲁斯,CA,美国,和细胞信号技术,分别Inc .)、美国。免疫复合物被使用ECL可视化检测试剂后,制造商的协议。光密度分析是进行免疫印迹检测系统(αInnotech,美国)。每个样品的带强度进行了分析,蛋白表达是GAPDH规范化。

并给出了数据 的意思是 ± SD 。使用SPSS 15.0版执行统计分析。组之间的差异决定为重复使用单向方差分析的措施。的值 P < 0.05 被认为是具有统计学意义。

的合成路线 Z4-dihydroxyphenyl) 2-acetoxy-3 -(3)丙烯酸进行详细描述之前在我们的实验室 18]。

表 1列表的影响( Z4-dihydroxyphenyl) 2-acetoxy-3 -(3)丙烯酸对大鼠生理和血流动力学参数MI后4 - 6周。与虚假的操作组相比,MI组显著增加LV舒张末压(LVEDP),此外,降低左心室收缩压(LVSP)和最大速度 d P / d t 。MI组 d P / d t 作为心肌收缩性指数与虚假的操作组相比显著降低。此外,15毫克/公斤( Z4-dihydroxyphenyl) 2-acetoxy-3 -(3)丙烯酸酸洗,显著改善 d P / d t 观察( P < 0.05 )。这些数据表明,( Z4-dihydroxyphenyl) 2-acetoxy-3 -(3)丙烯酸促进心脏功能较低浓度。

的抗氧化作用( Z4-dihydroxyphenyl) 2-acetoxy-3 -(3)丙烯酸被增强的活动有牵连的猫,SOD,氧化酶和血清谷胱甘肽的水平,以及蛋白质含量的猫,SOD-1, GPx左心室(数字 1(一)- - - - - - 1 (e))。另一方面,( Z()2-acetoxy-3) - 3 4-dihydroxyphenyl丙烯酸治疗剂量依赖性的方式降低血清MDA的水平(图 1 (f))。此外,( Z4-dihydroxyphenyl) 2-acetoxy-3 -(3)丙烯酸也增加并行的总抗氧化能力和降低血清中的脂质过氧化水平和左心室剂量依赖性的方式。谷胱甘肽含量( Z4-dihydroxyphenyl) 2-acetoxy-3 -(3)丙烯酸处理(15、30和60毫克/公斤)组低于对照组( P < 0.05 )。治疗后与三种不同浓度的 Z4-dihydroxyphenyl) 2-acetoxy-3 -(3)丙烯酸治疗,治疗组的谷胱甘肽水平高于MI组( P < 0.05 )。浓度越高( Z()2-acetoxy-3) - 3 4-dihydroxyphenyl丙烯酸(15、30和60毫克/公斤),谷胱甘肽浓度越高。此外,氧化酶和销售税的水平在治疗组高于MI组。第三,许多额外的酶的水平,包括猫、MDA、SOD,也明显不同与MI组相比,治疗组。猫的水平在治疗组明显高于模型组( P < 0.05 )。同样,SOD水平类似猫的水平。最后,心衰的治疗组大鼠的MDA浓度低于检测心肌梗死组。谷胱甘肽的治疗后的值、氧化酶、猫、SOD和MDA暗示( Z4-dihydroxyphenyl) 2-acetoxy-3 -(3)丙烯酸有能力保护从心脏抗氧化效果。

的保护作用 Z4-dihydroxyphenyl) 2-acetoxy-3 -(3)丙烯酸是评估通过分析促炎基因的表达水平peri-infarct地区使用rt - pcr。一位upregulation MI组TNF - α观察mRNA水平而虚假的集团。这种效应被(部分逆转 Z4-dihydroxyphenyl) 2-acetoxy-3 -(3)丙烯酸治疗,特别是在15毫克/公斤剂量(图 2(一个))。同样,il - 1的显著增加 β信使rna表达检测心肌梗死组,减毒的治疗( Z()2-acetoxy-3) - 3 4-dihydroxyphenyl丙烯酸(图15毫克/公斤剂量 2 (b))。这些数据表明,( Z()2-acetoxy-3) - 3 4-dihydroxyphenyl丙烯酸是一种炎症过程的有效抑制剂。

我们下一个决心的抑制效应( Z()2-acetoxy-3) - 3 4-dihydroxyphenyl丙烯酸在心肌细胞凋亡。我们测量了蛋白质和信使rna表达水平的几个apoptosis-related分子peri-infarct地区。rt - pcr显示bcl - 2的表达水平增加心肌梗死组和( Z4-dihydroxyphenyl) 2-acetoxy-3 -(3)丙烯酸酸洗组与虚假的操作组。( Z4-dihydroxyphenyl) 2-acetoxy-3 -(3)丙烯酸治疗导致显著增加bcl - 2 mRNA与MI组相比,治疗组(图 3(一个))。相比之下,proapoptotic的mRNA水平分子伯灵顿,caspase-3, caspase-9显著降低( Z4-dihydroxyphenyl) 2-acetoxy-3 -(3)丙烯酸酸洗组与心肌梗死组(图 3 (b))。免疫印迹分析证实了rt - pcr的结果。事实上,bcl - 2蛋白水平的显著增加和减少伯灵顿蛋白质含量检测( Z4-dihydroxyphenyl) 2-acetoxy-3 -(3)丙烯酸酸洗组与心肌梗死组(数字 3(一个)和 3 (b))。此外,这些变化似乎是与增加的一种蛋白激酶磷酸化MI和( Z()2-acetoxy-3) - 3 4-dihydroxyphenyl丙烯酸酸洗的动物。

免疫印迹分析显示,Akt激活在6周后心肌梗死动物的心。在( Z4-dihydroxyphenyl) 2-acetoxy-3 -(3)丙烯酸酸洗,显著增加一种蛋白激酶的磷酸化是观察与MI组(图 4)。结合本研究的结果表明,Akt介导的激活apoptosis-related分子的表达。

MI六周后,通过测量发现胶原蛋白沉积TGF -的表达水平 β和胶原蛋白I型mRNA在noninfarct地区。rt - pcr显示TGF - β和胶原蛋白I型mRNA在MI组显著调节。( Z4-dihydroxyphenyl) 2-acetoxy-3 -(3)丙烯酸治疗可以降低这两个分子的表达,虽然差异没有统计学意义(图 5)。