1。介绍
小肠移植(SBT)是唯一明确的治疗晚期肠衰竭患者。而新的免疫抑制药物和先进的外科手术的临床结果有了很大的提高,成功的主要障碍继续存在SBT。然而,SBT仍然干预后的第二选择全肠外营养(TPN)在大多数情况下。两个最重要的障碍是细菌感染和同种异体移植物排斥有67%的病人死亡归因于脓毒症(55%)或拒绝(12%)(
1 ]。移植后,脓毒症的直接后果是细菌易位在小肠移植的受伤的粘膜屏障。此外,受伤的腐败加剧同种异体移植物排斥反应,因为黏膜下组织抗原暴露(
2 ]。因此,治疗策略保护移植的粘膜屏障在移植是一个持续努力的关键因素临床小肠移植的成功。
当前文献表明,冠脉内管理没有捐助,S-nitroso-N-acetyl-D, L-penicillamine (SNP),在缺血前一段时间可以减少梗塞大小,减弱中性粒细胞聚集,改善内皮功能(
3 ]。大量的研究也表明,体内一氧化氮(NO)管理可以减轻实验性肝、肺、肠、肾I / R损伤,表明没有可以发挥重要作用在衰减在再灌注阶段组织损伤(
4 - - - - - -
7 ]。基于这些先前的研究,我们设计了实验探索外生的治疗潜力的上下文中没有SBT在老鼠模型中。
2。材料和方法
2.1。动物和试剂
男性Sprague-Dawley (SD)大鼠(220 ~ 300克)从上海得到Songlian实验动物中心(上海,中国)。这项研究是区域伦理委员会批准的实验室动物实验和实验按照中国动物保健委员会的法规和政策。动物禁食过夜,住在预防粪食性wire-bottomed笼子。水是免费提供的。手术进行大鼠麻醉乙醚和维护间歇醚补充。
所有化学品都AR-grade。Coomassie蓝染色设备获得了来自南京建成生物工程研究所(中国南京)。PCR引物的设计和合成
鼠属 层粘连蛋白cDNA序列由上海Sagon(上海,中国)。RT工具包和HotStarTaq主混合买来试剂盒(德国的杜塞尔多夫);试剂盒试剂获得从英杰公司(美国加州)。免疫组织化学和
原位 杂交试剂盒来自博士德(中国南京)和SNP购买σ(上海,中国)。
2.2。实验小组
八十四名男性Sprague-Dawley (SD)大鼠体重220 ~ 300 g作为供体或受体被随机分配构造一个异位SBT (H-SBT)模型建立。动物被分配到三组。异位移植组包括(1)SBT没有SNP处理(
N
=
12
)和(2)pre-SNP集团(
N
=
14
),在治疗由SNP注入阴茎静脉在三个时间点之前(6 3和0小时)捐赠器官收获和异位移植。短暂,SNP是溶解在乳酸林格氏液(LR)解决方案,作为丸剂量的5
μ g (5
μ 0.5 g / mL)。(3)Post-SNP集团(
N
=
16
),在治疗由阴茎静脉注入SNP (5
μ 0.5 g / mL)后异位SBT(0) 3,移植后6小时。受者生存72小时后手术成功的气孔被用于实验分析。
2.3。为异位小肠移植手术
经典H-SBT模型是基于修改后的方法(
8 ),一直由同一手术团队执行。袖口的技术被用于静脉重建。简单地说,捐赠者小肠血管灌注了LR解决方案通过肠系膜上动脉
在活的有机体内 上级伪劣分支结扎和夹紧后主动脉离开门静脉专利。二十厘米的小肠5厘米远的韧带Treitz孤立的肠系膜上血管蒂附在树桩上动脉和门静脉用于移植。收获后,肠道内腔与LR轻轻清理解决方案和贪污是存储在冰在4°C到移植。供体门静脉铐(手动袖口是用2毫米DSA管)和结扎,收件人左肾静脉(左肾切除)重建静脉流出,和一个主动脉斑块是网状结束到收件人肾下的通过运行缝合重建动脉流入主动脉。口服的移植小肠被关闭和远端形象化的通过左下腹壁皮肤的气孔(图
1 )。肠样品分子分析收获通过贪污气孔移植后72小时,在液态氮冷冻,直到进一步使用储存在−80°C。
图1
血管重建 :移植物铐门静脉插入左肾静脉的接受者和端侧吻合术SMA和腹主动脉之间执行。正确的图片显示了一个典型的贪污20秒后动脉吻合和静脉插入和演示了贪污良好的血液循环。
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2.4。组织学
全厚度移植物移植后72小时内收集样品缓冲福尔马林固定在10%,嵌入在石蜡,切4 - 5
μ 米厚的部分,并与hematoxylin-eosin染色。组织学损害使用公园的组织学分级分类肠道组织损伤的病理学家(蒙蔽了
8 ]。样本的得分如下:0:正常粘膜;1:牙龈空间;2:牙龈扩展空间;3:上皮起重绒毛的一面;4:裸露的绒毛;5:绒毛组织的损失;6:地下室层梗塞;7:transmucosal梗塞;和8:透壁的梗塞。
2.5。贪污粘膜Na <一口> + < /一口> - k <一口> + < /一口> atp酶活性
Na+ - k+ 使用Na atp酶活性进行了分析+ - k+ 腺苷三磷酸酶检测设备根据制造商的指示(南京建成生物工程研究所、中国)。短暂,冷冻肠道样本解冻和10卷的生理盐水稀释10%匀浆。然后,9卷的生理盐水被添加到匀浆1%匀浆前检测。样本与Ultra-Turrax均质机均质(Labassco、瑞典)。匀浆是离心机在5000 g 30分钟2°C。吸光度是读的分光光度计(Victor 2 Wallac瑞典)在636海里。分光光度测量与样本归一化组织蛋白质含量检测到Coomassie蓝染色。贪污Na+ - k+ atp酶活性表达单位/毫克(蛋白质)/ h。一个单位的Na+ - k+ atp酶被定义为数量的酶水解1
μ 摩尔ATP在一小时25°C。
2.6。层粘连蛋白的表达
接枝层粘连蛋白的表达被半定量rt - pcr量化每个样本
原位 杂交和蛋白质免疫组织化学根据制造商的协议。以下引物。
层粘连蛋白引物序列:
5′-GTGTCTTCAGAGGTGACTGTATTCG-3′,
5′-TTCTCCCGGTTCTTGATGCT-3′,
β 肌动蛋白引物序列:
5′-ACATCTGCTGGAAGGTCCAC-3′,
5′-GTACCACCATGTACCCAGG-3′。
2.7。统计分析
Na+ - k+ 腺苷三磷酸酶活动意味着±SE。统计学意义的差异测试Newman-Keuls方差分析。
P
<
0.05
被认为是具有统计学意义。收件人和气孔死亡率被精确概率分析方法。所有使用SAS9.3软件进行统计分析。
3所示。结果
3.1。收件人死亡率
我们观察到一个明显降低死亡率pre-SNP组(21.4%)相比SBT组(58.3%)和post-SNP组(56.3%)在观察3周(
P
<
0.05
)。SBT之间没有差别在生存组和post-SNP组(
P
>
0.05
)。有趣的是,大多数动物在移植后10天内死于SBT和post-SNP组。存活率相对稳定在2周后所有组(图
2 )。
图2
存活曲线的三组 :pre-SNP组死亡率明显降低(
n
=
14
)相比,在SBT组(
n
=
12
)和post-SNP集团(
n
=
16
在3周的观察()
P
<
0.05
)。
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3.2。组织病理学
组织损伤评估小肠移植术后72小时按照公园的分类系统。得分3到6标本都归类为气孔发病率和那些得了7或8被归类为气孔死亡率。
类似于接受者的发病率,气孔发病率显著低于pre-SNP组相比SBT组和post-SNP集团(
P
<
0.05
)。SBT之间没有差别在生存和post-SNP组移植后10天内(
P
>
0.05
)(表
1 )。
表1
气孔发病率和死亡率。
集团
N
气孔
发病率(
n
)
死亡率(
n
)
(总
n
,%)
SBT集团
12
3
8
11 (91.7%)
Pre-SNP集团
14
2
6
8 (57.1%)
Post-SNP集团
16
5
9
14 (87.5%)
正如所料,移植物植入和再灌注导致重大损伤粘膜结构SBT组。然而,接近正常粘膜结构只有最小的损伤和减少绒毛长度pre-SNP组(图中可观察到
3 )。相反,更高程度的组织学损伤被发现post-SNP组样本表现出巨大的绒毛和牙龈的空间。
SBT贪污72小时后的组织学检查。(一)具有代表性的SBT集团(
n
=
12
):明显的小肠绒毛萎缩,摧毁了绒毛,裸露的绒毛,扩张毛细血管,一些地下室层损伤。(b)的代表性pre-SNP集团(
n
=
14
):一些轻度上皮损伤的存在。(c) Post-SNP集团(
n
=
16
):明显的破坏,萎缩,裸露的绒毛和扩张毛细血管是可见的和一些地下室层损伤存在(他×200)。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
3.3。贪污粘膜Na <一口> + < /一口> - k <一口> + < /一口> atp酶活性
平均Na+ - k+ 腺苷三磷酸酶活性的贪污粘膜移植pre-SNP集团(
4.106
±
0.3957
U / mg)移植后收获72小时显著高于SBT组(
2.867
±
0.2741
U / mg) (
P
<
0.05
)。post-SNP(没有区别
3.1425
±
0.6664
U /毫克)和SBT组(图
4 )。
图4
贪污粘膜Na+ - k+ atp酶活性。pre-SNP组(B) Na+ - k+ atp酶活性显著高于SBT组(A) (
P
<
0.05
)。没有区别post-SNP组(C)和SBT组(A) (
P
>
0.05
)。
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3.4。层粘连蛋白的表达
如数据所示
5 ,
6 ,
7 pre-SNP集团表现出更高的层粘连蛋白表达水平的量化的半定量rt - pcr
原位 杂交和蛋白质免疫组织化学相比SBT和post-SNP组。层粘连蛋白蛋白表达通过免疫组织化学方法检测强pre-SNP组相比SBT和post-SNP组。实验与杂交和免疫组织化学显示,层粘连蛋白的表达是局部粘膜上皮基底膜。SBT之间没有差别在层粘连蛋白的表达和post-SNP组。
图5
半定量rt - pcr分析,层粘连蛋白mRNA的表达。明显高于观察层粘连蛋白mRNA表达pre-SNP组(B)相比,SBT (A)和post-SNP组(C)。
![]()
层粘连蛋白蛋白表达。具有代表性的SBT集团(
n
=
12
):一个缺乏粘膜层粘连蛋白的蛋白表达和严重损伤的肠道绒毛。(b)的代表性pre-SNP集团(
n
=
14
):降低粘膜层粘连蛋白蛋白表达和轻微损伤的肠道绒毛。(c) Post-SNP集团(
n
=
16
):缺乏粘膜层粘连蛋白的蛋白表达和严重损伤的肠道绒毛观察(×200)。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
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Lamininhybridization
原位 。粘膜层粘连蛋白mRNA表达的基底部分肠道粘膜。具有代表性的SBT集团(
n
=
12
):粘膜层粘连蛋白mRNA表达较低与中断的部分表达式。(b)的代表性pre-SNP集团(
n
=
14
):表达式是连续的。(c) Post-SNP集团(
n
=
16
):表达低和有干扰(×200)。
(一)
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(b)
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(c)
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4所示。讨论
小肠移植可能是明确的手术治疗肠衰竭疾病尤其是在TPN的设置是不被容忍的。然而,移植肠黏膜的伤害引起的败血症细菌易位仍然是一个主要的问题在这些病人的术后管理和仍然是一个至关重要的死因和贪污损失(
9 ]。更好的理解之间的交互的肠道免疫系统和粘膜在I / R损伤的发展新的治疗策略中获益。此外,这些知识将会显著降低免疫原性,从而改善移植小肠移植的存活。
在目前的研究中,我们利用一个异位SBT鼠模型探讨治疗潜在的SBT。在这个异位模型,移植条件很容易观察和样本可以收获从气孔允许纵向研究。此外,接受者吃自由后不久移植和更快的恢复由于宿主肠道的干扰。
在正常情况下,成人肠之间提供了一个平衡的粘膜细胞增殖和凋亡或坏死。机制和介质调节这些过程目前正在研究。对氧化应激肠道粘膜非常敏感。SBT的一个主要临床情况下I / R诱导氧化应激中发挥着重要作用诱导粘膜损伤可以导致细菌易位(
10 ]。缺血/再灌注会引起粘膜通透性增加,导致“裸区”的妥协屏障功能可将细菌或细菌毒素与其结合,把,引起内毒素的后续发展全身炎症反应综合征(
11 ]。众所周知,结构性肠粘膜屏障丧失和免疫活动负责功能的增加渗透率和细菌易位(
12 ]。
缺血/再灌注损伤肠粘膜屏障的贪污是特异性的。隐窝细胞外基质的显微结构的基站粘膜屏障,这是粘膜细胞再生和细胞分化[所需
13 ]。层粘连蛋白是细胞外基质中最重要的一个元素。它有多个在肠道基底膜和生物功能与胶原蛋白网络。由基底上皮细胞合成,调节细胞粘附、迁移、分化,而分泌胶原酶导致结构可塑性的动态平衡。贪污是一个早期的细胞外基质I / R的焦点目标。减少合成和高水平的层粘连蛋白降解在I / R的衰减,甚至崩溃导致基底膜(
14 - - - - - -
16 ]。在某种意义上,层粘连蛋白肠道粘膜屏障的完整性至关重要,而且,因为它是在我们的啮齿动物模型,移植后移植物损伤的一个重要指标。
没有在I / R的参与仍然是有争议的。一些作者表明,外生管理没有变弱缺血后损伤在某些器官和组织(
3 - - - - - -
5 ]。减少可能是由于没有对微血管功能障碍的保护作用和对白细胞粘附、关键因素与缺血后再灌注(
4 - - - - - -
7 ,
17 ]。然而,其他研究已经表明,过度的生产没有或药物管理的诱发与超氧化物阴离子反应,生成过氧亚硝基,高活性分子参与多种病理反应(
18 ,
19 ]。因此,没有剂量和物种的差异可能导致外源性的不同影响。
根据文献中给出的数据,本研究的目的是探讨移植肠粘膜上的没有保护作用。在三个不同的移植组在这项研究中,高水平的层粘连蛋白cDNA、mRNA和蛋白表达观察移植物pre-SNP组相比SBT和post-SNP组。此外,结果还表明,钠的水平+ - k+ atp酶活性高贪污pre-SNP组相比SBT和post-SNP组。
粘膜屏障完整性和好的能量动态函数与成功有关SBT pre-SNP组显示一个潜在的治疗作用没有贪污预处理试剂。此外,我们的数据表明,post-SNP治疗不会是有益的。
总之,外生管理没有通过供者移植物治疗改善了组织学和能源储备肠移植的预处理试剂,但移植后治疗试剂没有好处。它是合理的假设SNP的保护作用是不存在在整个SBT过程。这些发现打开了有趣的可能性研究新的可行的代理,可以提高移植物和受体组织生存能力在临床SBT。