1.介绍
在西方社会，脑出血(ICH)占所有中风的8-15%，在亚洲地区占20-30%，目前尚无明确有效的治疗方法[
1，
2]。了解ICH后脑损伤的复杂病理生理学对开发减少其有害影响的新方法至关重要。
ICH的发生始于血脑实质内一个巨大的释放[
3，
4]。红细胞，如血肿，溶解并释放血红蛋白（Hb）随后在几天之内可以细分为血红素铁和脑出血后的主要细胞成分[
五]。这些细胞毒素主要导致脑出血后继发性脑损伤[
6]。触珠蛋白 - 血红蛋白，CD163以及血红素结合蛋白血红素LRP1（低密度脂蛋白受体相关蛋白-1）被认为是其在血肿/血液成分分辨率参与以下ICH [最重要的内源性清除通路
6]。无细胞血红蛋白可以触发氧化损伤caspase激活，血 - 脑屏障破坏和神经元死亡，造成不可逆的脑损伤[
7]。CD163是单核吞噬细胞系统中唯一表达的血红蛋白清除受体，在红细胞溶血过程中形成，介导Hb的内吞作用，导致配体蛋白和细胞质血红素加氧酶降解[
8]。结合珠蛋白(Hp)是一种主要的血红蛋白结合蛋白，可减弱血浆中血红蛋白的破坏作用[
6，
9，
10]。血浆中过量的Hb可上调神经元中Hp和Hb-Hp受体CD163的表达[
11]。马力势必游离血红蛋白和一次HP-血红蛋白复合物通过内吞CD163可能引起抗炎应答。对HP-HB-CD163充当血红蛋白清除的主要途径，并发挥了关键保护作用[
9，
12]。
PPAR-γ
γ是它可以调节过氧化氢酶的这是两个重要的抗氧化基因[表达和超氧化物歧化酶的转录因子
13，
14]。它也与促进血肿清除和减少神经功能障碍有关[
15]。作为PPAR-γ
γ激动剂，monascin是红曲米与中国传统技术的主要成分，并已显示出具有通过促进血肿清除和ICH [后减少大鼠脑水肿有保护作用
13]，但monascin在ICH的具体机制尚未到目前为止澄清。
我们推测，PPAR-γ
γ将通过CD163和Hp上调促进血肿清除，从而减少脑水肿，改善血脑屏障完整性。所以我们设计了这项研究来测试PPAR-的效果
γ在通过PPAR-的Hp-Hb-CD163途径上
γ激动剂monascin及其拮抗剂格列卫，其介导PPAR-
γ通过减少的磷酸化水平[
16]在胶原酶诱导的ICH大鼠模型。
2。材料和方法
2.1。动物的制备
本研究采用107只成年雄性Sprague-Dawley大鼠，体重约250~300 g(山西医科大学动物实验室)。这些动物的使用方案是按照山西医科大学动物利用管理委员会制定的。所有大鼠均可自由获得饲料和水。
2.2。动物治疗和实验组和对照组
所有大鼠随机分为以下几组：假手术组（
ñ
=
25
)、车辆组别(
ñ
=
27
), monascin-treated group (10 mg/kg twice a day,
ñ
=
26
), and Glivec-treated group (100 mg/kg/day,
ñ
=
29
)。动物尸体最终评估之前被替换。All gavages were administered by gastric perfusion 6 h after ICH until the endpoint.
2.3。大鼠脑出血模型
脑出血模型是由一个头部立体定位仪下注射胶原酶IV到纹状体制成[
13]。简单地说，实验大鼠用水合氯醛(300-350 mg/kg)腹腔注射麻醉。大鼠麻醉后置于立体定向仪(江湾型1c仪，中国上海)。一枚1毫米的针通过颅钻孔插入纹状体到以下参考框架:前0.5毫米，腹侧5.8毫米，外2.3毫米bregma。然后用5
μL flat-headed microsyringe (Hamilton 600, Switzerland) to infuse 0.5 U type IV collagenase (Sigma-Aldrich, USA) which was dissolved in 2.5
μL生理盐水。输注完毕后，需要在针内多维持3分钟，然后慢慢拔出。假手术组为2.5
μ使用相同的L-氨基酸的方法的盐水溶液输注。手术后，头骨的孔密封，使头皮以及缝合。动物在其中自由病原体的特定设施中饲养。此外，他们能得到食物和水不受控制。
2.4。脑含水量
大鼠脑组织含水量按前文所述进行[
13]。我们使用4％水合氯醛为腹腔注射麻醉深大鼠，然后将大鼠断头，测定脑的水含量。The brain tissue was removed from the skull rapidly and then divided into 4 mm sections in the portion around the puncture point. All brain tissue samples we got from the ipsilateral basal ganglia were instantly weighed by an electric microbalance to know the wet weight (Ww). Then tissues were placed in a 100°C drying oven for 48 hours to desiccation. After that, we can obtain dry weight (Dw). The brain water content was calculated by the following formula: (Ww − Dw)/Ww × 100%.
2.5。血红蛋白检测法
脑出血后的脑血红蛋白的定量血红蛋白测定的制造商的说明指导下进行测量。简而言之，成功的模型大鼠处死，脑组织，迅速取出，并分别把四个玻璃餐具。共有1000
μL在每个玻璃皿中加入预冷藏的PBS缓冲液。超声破碎脑组织，收集于离心管中，4℃12000 rpm离心30分钟。25
μ将各组上清液L置于96孔板中，按1:4的比例加入Drabkin试剂。室温孵育5分钟后，用分光光度计在400 nm处测定OD值。每个样品的OD值由空白组校准。
2.6。Western Blot检测各组PPAR-<italic> (italic)、CD163、Hp的表达
粉碎脑组织，加入PMSF RIPA裂解缓冲液，提取总蛋白，进行Western blot分析。用BCA法测定蛋白浓度。50
μ将每个裂解样品g装在10%十二烷基硫酸钠凝胶上，在90伏特电泳2小时。带经电泳后转移到聚偏氟乙烯膜上。膜用5% BSA封闭缓冲液在37℃下封闭2小时，并与第一抗体孵育:多克隆抗ppar -
γof rabbit (1 : 1000, Bioss), anti-CD163 of rabbit (1 : 500, Bioss), and polyclonal anti-Hp of rabbit (1 : 500, Bioss) at 4°C in a thermostat shaker overnight. Meanwhile, other membranes were probed with
β-actin (1:3000, Bioworld)作为内部控制。TBST缓冲液洗涤后，所有膜与第二抗体在37℃孵育2小时。免疫反应膜采用ECL +化学发光检测试剂盒处理。然后通过成像系统(Bio-Rad, ChemiDoc)进行可视化。最后，波段强度分别用内部控制进行正态化，并使用ImageJ软件进行数字化。
2.7。MRI测量血肿和脑水肿的体积
所有大鼠在山西医科大学附属第二医院接受1.5 T临床扫描仪(GE Signa HDx, GE healthcare Milwaukee)的脑MRI扫描，并在术后3天进行膝关节线圈治疗。MRI影像学扫描时，大鼠俯卧位使用5%水合氯醛后保持良好麻醉状态。在我们的研究中获得了一系列MR序列，方案包括T2加权成像(T2WI)和T2 Flair来评估水肿，以及扫描参数[
13] are listed as follows: repetition time (TR)/echo time (TE) = 2400/129 ms, field of view (FOV) = 18 × 18 mm, slice thickness = 2.0 mm, matrix size = 512 × 448, and interval = 0.2 mm. In T2 fluid-attenuated inversion recovery (T2 Flair), TR/TE = 8502/128.6 ms, FOV = 12 × 12 mm, slice thickness = 2.0 mm, matrix size = 512 × 448, and interval = 0.2 mm. T2
*
三成像(T2
*
WI）和易感性加权成像（SWI）被用来确定血肿大小;扫描参数如下：在T2
*
WI, TR/TE = 400/15 ms, FOV = 18 × 18 mm, slice thickness = 2.0 mm, matrix size = 448 × 384, interval = 0.2 mm, and flip angle = 15°. In SWI: TR/TE = 49.9/4.5 ms, FOV = 18 × 18 mm, slice thickness = 1.5 mm, flip angle = 15°, and matrix size = 448 × 448. MRI postprocessing was performed on an off-line workstation by two experienced neurologists who were blinded to the group set and scan date. The absolute volume of intracerebral hemorrhage area which contains the outer amount of edema and hematoma was adopted during the measurement process. The total value of the absolute volume was calculated by integrating injured areas of brain hemorrhage slices. All the assessments were repeated three times, respectively. The results were shown as the mean and standard deviation.
2.8。Real-Time PCR检测不同组的结合珠蛋白和CD163
使用TRIzol试剂(Takara Inc.， Japan)按照说明书从血肿周围脑组织中提取不同组的总RNA。提取完成后，使用nanodrop 2000 (Thermo Fisher, USA)测定总RNA，紫外吸光度为260 nm，以确保纯度。使用PrimeScript™RT Master Mix一次性试剂盒(Takara Inc.， Japan)逆转录互补DNA，共20个
μL含1
μg总RNA在37℃下进行15分钟;最后，互补DNA被保存在零下80℃的环境中。Real-time PCR分析采用BIO-RAD iCycler热循环器进行RT-PCR (BIO-RAD，美国)，使用互补DNA和SYBR®Premix Ex Taq™试剂盒(Takara Inc.，日本)。基于pcr的寡核苷酸引物如下:结合珠蛋白:5
“
-gaaaggcgctgtaagtcctg-3
“
(正向引物)和5
“
-tcctcttccagggtgaattg-3
“
（反向引物）和CD163：5
“
-gacagacccaacggcttaca-3
“
(正向引物)和5
“
-ggtcacaaaacttcaaccgga-3
“
（反向引物）。实验采用25
μ含有2升体积的总反应混合物的反应体系
μL的稀释互补DNA产物，12.5
μL SYBR预混Ex Taq Mix (Takara Inc.， Japan)， 1
μL的正引物/逆引物分别为L, 8.5
μL的无rnase水。real-time PCR反应条件为:95℃预变性1分钟。延长工艺设置变性为95℃30秒，退火和延伸为55℃45秒，延长工艺重复40个循环。每个样本进行3次逆转录PCR。为了标准化结合珠蛋白和CD163 mRNA的表达，参照基因的水平
β肌动蛋白被测定每个样品平行。最终结果表达目的基因拷贝数的比率
β肌动蛋白的转录本。靶基因的表达是由（2）计算-ΔΔCT方法。
2.9。统计分析
Quantitative data were sorted out as the mean ± SD. One-way ANOVA was taken for multiple comparisons. The SNK-q test was adopted for the comparison of the differences between groups of brain water content, hemoglobin levels, and real-time PCR assay, while the differences of MRI parameter and Western blot results were determined by Tukey’s post hoc test.
p
<
0.05
为表示差值处理各组间有统计学意义。
4.讨论
在我们的研究中，我们证明了PPAR-
γ是通过减少血肿大小和血红蛋白水平从而减少脑水肿来保护神经的。PPAR-γ
γ激动剂monascin增强了结合珠蛋白和CD163的表达，而PPAR-
γ拮抗剂格列卫对大鼠ICH模型中的作用是相反的。
脑出血是一种破坏性疾病，并一直没有具体的治疗，以降低病死率[
17]。它开始于血液大量释放到脑实质[
3，
11，
18]。红细胞在几天内溶解并同时释放血红蛋白[
6]。血肿脑出血后脑损伤的罪魁祸首，所以如何有效地清除血液制品是至关重要的ICH致脑损伤[
19]。
HP是一种糖蛋白，其是在等离子体中丰富[
20]。它主要由肝细胞分泌，单核吞噬细胞系统也可产生[
21]。脑出血后血浆中Hp水平升高，以应对应激反应和抗炎症反应，与游离Hb结合[
14，
19]。Hb -Hb复合物的形成保护Hb免受氧化修饰。氧化修饰会阻碍清除过程，导致游离Hb进入血液循环[
22]。此外，Hp-Hb-CD163复合物具有CD163识别和促进血红蛋白清除率的高亲和力位点[
8，
9，
14]。
CD163作为血红蛋白清道夫受体。它仅在单核细胞 - 巨噬细胞系统中表达[
9] and is a 130 kDa transmembrane glycoprotein which can be combined with a variety of ligands. It also belongs to scavenger receptor superfamily class B [
18]。CD163是ICH后Hp的细胞受体靶细胞[
10]。由HP-血红蛋白复合物的再认识后，HP-HB-CD163复杂系统是红细胞和介导的血红蛋白的内吞作用的溶血过程中形成的，从而导致溶酶体配体蛋白的降解[
8]。对HP-HB-CD163充当血红蛋白清除的主要途径，并发挥了关键保护作用[
9]。
PPAR-γ
γ是一种属于核激素受体超家族的转录因子。近年来，PPAR-的转录因子研究进展缓慢
γ[
19，
23]被验证为在调节吞噬细胞介导的清除过程和重要的参与者能够促进内源性血肿吸收，减少神经元损伤，并且提高在ICH [的啮齿动物模型的功能恢复
24]。它不仅增加了小神经胶质细胞介导的在培养的大鼠原代小胶质RBC的吞噬作用，而且在吞噬过程减少过氧化物的产生[
25]。PPAR-的具体机理
γ在ICH尚未完全到目前为止澄清。
在本研究中，我们发现，PPAR-γ
γ激动剂monascin是通过降低脑含水量和血红蛋白水平的神经保护。此外，还增强了免疫印迹和实时PCR结果CD163和Hp的表达，而格列卫降低Hp与CD163表达。
磁共振成像（MRI）是一种医学成像技术，并已在脑出血的研究被广泛使用[
14]。对颅内出血后血肿和水肿的时空变化具有较高的敏感性。在术后3天，我们通过T2评估血肿和脑水肿的体积
*
WI/SWI及T2WI/T2 FLAIR序列[
7]。结果表明PPAR-γ
γ激动剂monascin明显减少脑出血后血肿体积和脑水肿，胶质细胞扩大血肿和水肿区域。
我们的研究结果表明，PPAR-γ
γ通过组织学、分子生物学和MRI成像方法，激动剂monascin降低了胶原酶诱导的ICH大鼠模型的血肿体积和脑水肿。同时，monascin上调了ICH内源性血红蛋白清除系统中的CD163和Hp的表达。
PPAR-γ
γ激活小神经胶质细胞增强诱导红细胞吞噬。我们以前的研究表明，PPAR-γ
γ激动剂通过减少ICH后血肿体积和水肿形成改善了结果[
13]。虽然巨噬细胞在血肿清除中发挥核心作用，但血红蛋白大多包裹在红细胞内，直到被小胶质细胞和浸润性巨噬细胞吞噬和降解[
1]。CD163是一种血红蛋白清扫剂受体，主要表达在巨噬细胞/小胶质细胞上，在清除ICH后红血球溶解过程中释放的游离血红蛋白中起主要作用。CD163将血红蛋白转运到小胶质细胞/巨噬细胞中，作为一种膜结合清除剂受体清除细胞外结合血红蛋白(Hp-Hb)复合物[
11]。体内和体外，过量的Hb上调了Hp和Hb/Hp受体CD163的表达。游离Hb与Hp结合，一旦Hb -Hb复合物被CD163介导的向巨噬细胞内吞，可能会引发抗炎反应，因为血红素代谢物具有强大的抗炎作用[
6]。因此，PPAR-γ
γ活化可能增强小胶质细胞诱导幽门螺杆菌血红蛋白复合物的吞噬作用通过提高CD163表达。
总之，PPAR-γ
γ可能通过Hp-Hb-CD163通路在大鼠胶原酶诱导的ICH模型中促进血肿清除并发挥保护作用。Monascin，作为PPAR-
γ激动剂，在未来将是一种潜在的治疗ICH的药物。