Hyperfolin /羟丙基- β 环糊精制备的络合hyperforin(开曼化工、安阿伯、MI)和羟丙基- β 环糊精(HP - β cd;CycloChem、东京、日本)如下所述。其他化学药品和试剂如下:生胃酮二钠盐(CBX) apyrase(从土豆),GdCl₃、U73122 Cremophor EL (Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼);圣地亚哥ionomycin (Calbiochem CA);苏拉明hexasodium (RBI,纳蒂克,MA);GsMTx-4(肽研究所,日本大阪);diC8-PIP₂(雁行生物科学,盐湖城,UT);dispase(戈蓝Shusei、东京、日本);Fluo-8点(AAT Bioquest,桑尼维尔CA);Cellmatrix IA型(Nitta明胶、大阪、日本);英杰公司Lipofectamine(18324年,卡尔斯巴德,CA);测距装置/ F12 (D9785;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州);的边后卫(12483;卡尔斯巴德,Gibco CA)。

4.66×10的解决方案⁻⁴M hyperforin(1毫升甲醇)和1.86×10⁻³M惠普- β cd(1毫升乙醇)涨跌互现,然后搅拌30分钟。溶剂被移除在真空离心蒸发器(0.1 Mpa, 2800 rpm, 90分钟,wkn - pv - 1200, Wakenyaku,京都,日本)在环境温度。得到白色固体是由声波降解法溶解在水里Milli-Q至少10分钟。结果hyperforin / HP -水溶液 β cd是syringe-filtered 0.20 μ米孔隙大小和保存在冰箱里,直到使用。所有的程序在light-shielded条件下进行。

hyperforin和惠普-化学计量学的反应 β cd光谱方法确定。的浓度hyperforin这些研究为4.66×10⁻⁴而惠普- β cd使用浓度在0 - 8.0等价物。的紫外光谱hyperforin记录使用UV / VIS扫描分光光度计(基因规范三世,日立纳卡仪器、日立、日本)。吸光度的变化后hyperforin添加不同浓度的惠普- β cd络合剂测定 λ 马克斯 ⁡ 281±7海里。

辐照测试执行使用6-watt LED灯泡(480 lm总光通量,色温:6700 K,松下、大阪,日本),放置14厘米以上样品。进行了辐照温度控制在一个黑暗的房间里(25°C)。能整除的40 μL是每30分钟的分析。所有的定量测量进行了使用日立LaChrom精英高效液相色谱系统(日立高新技术、东京、日本)配备了四元泵(l - 2130),一个autosampler (l - 2200),一个列烤箱(l - 2300)和二极管阵列检测器(父亲/ l - 2450)。分离进行了使用TSKgel ods - 100 z反相列(4.6毫米×250毫米,5 μm,但,日本东京)流动相组成的acetonitrile-water-methanol-trifluoroacetic酸(72:18:10:0.5,v / v / v / v)。流量为1.6毫升/分钟。紫外检测器是设定在270海里。曲线拟合进行了使用Excel (MS Office 2013)最小化 R 2 价值。

HaCaT人类角化细胞细胞( 19在段落36和37]从细胞系购买服务(CLS,海德堡,德国),生长在测距装置/ F12(0.07毫米^{2 +})补充2%的边后卫在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司₂。测距装置的生长介质准备/ F12 (D9785;通过添加0.07毫米Ca Sigma-Aldrich)^{2 +},365 mg / L谷酰胺,59.05 mg / L L-leucine 91.25 mg / L赖氨酸·HCl、61.2 mg / L MgCl₂h·6₂啊,48.84 mg / L MgSO₄(无水),17.2 mg / L L-methionine和1.2 g / L NaHCO₃并调整与1毫米氢氧化钠pH值7.4。实验,细胞被播种在collagen-coated (Cellmatrix IA型)硅胶拉伸室(参见下面)或15毫米圆形玻璃盖玻片(Matsunami、大阪、日本)和培养在测距装置/ F12(1.05毫米^{2 +}附件)补充10%的边后卫,允许细胞。一天后,介质是测距装置/ F12(0.07毫米Ca所取代^{2 +})补充2%的边后卫,细胞进一步孵化1天实现融合。

如前所述的生理实验( 2]。下面是一个简单的解释。

细胞培养在一段室型Silpot 184 W / C硅酮弹性体(道康宁东丽、东京、日本)。与培养细胞室在拉伸机(ns - 600 w或st - 600 w, STREX,大阪,日本)安装在倒置显微镜的阶段(ix - 70、奥林巴斯、东京、日本)细胞内Ca^{2 +}成像或立式显微镜(BX51WI,奥林巴斯)细胞外ATP成像。HaCaT细胞被播种collagen-coated硅胶拉伸钱伯斯在3×10或15毫米的圆形玻璃盖玻片⁵细胞/厘米²和融合发展。一条狭窄的间隙游离(约250 μ米)成立于一个完全汇合的单层通过移除硅胶带,在拉伸室的底部在细胞播种。伤口闭合过程监控每3 h划痕后使用一个倒置显微镜(ix - 70奥林巴斯)4 x (UPlanFL N, 0.13)的目标。伤口闭合速度定义为伤口闭合区域的比例,从最终的比例计算颗粒面积的地区迁移到最初。

在3 h后,拉伸HaCaT细胞室装有1 μM Fluo-8我使用的是0.1的-0.2% Cremophor EL (Sigma-Aldrich) - min在孵化器37°C。洗后的染料和测距装置包含2.0毫米Ca / F12^{2 +}室的细胞在舞台上的拉伸装置的倒置显微镜4 x (UPlanFL N, 0.13)或10 x (UPlanFL 0.30)的目标。每隔0.5秒延时Fluo-8荧光图像获得使用MetaMorph软件(v6.3和7.5、分子设备、唐宁敦PA)。

stretch-induced释放ATP使用成像系统实时测量,如前所述[ 20.]。短暂,luciferin-luciferase ATP生物荧光检测使用一个高灵敏度与红外摄像系统同时DIC成像监测精确细胞位置在延伸和扩展。在3 h后,细胞拉伸室被附加到拉伸装置的舞台上一个正直的显微镜(BX51WI,奥林巴斯)4 x客观(340萤石XL, 0.28)和测距装置/ F12培养基中取代(2.0毫米^{2 +}玫瑰和10毫米,pH值7.4)包含高灵敏度luciferin-luciferase解决方案(60315;路西法HS,龟甲万Biochemifa,日本东京)。获得使用MetaMorph软件图像流收购模式(曝光时间100毫秒)。

TRPC6 shRNA质粒,coexpressed RFP (TF308626;OriGene技术,马里兰州罗克维尔市)。59-AAGCAGGACATCTCAAGTCTCCGCTATGA-39 shTRPC6目标序列。炒无效的质粒与相同的核苷酸内容作为消极的控制。每个成分的浓度45 nM制程使用Lipofectamine转染到HaCaT细胞试剂,根据制造商的指示。

活检是过敏性皮肤的外层前臂的一名志愿者。从志愿者书面知情同意了。这项研究是调皮捣蛋的中央机构伦理委员会的批准,2009年。皮肤组织的样品放置在PBS dispase治疗之前。与500 U /毫升dispase一夜消化后在无血清F12 /测距装置有或没有hyperforin / HP - β cd在4°C,表皮剥落的真皮钳。分离的表皮与皮内针固定在一个弹性硅胶室,并进一步在37°C在湿润的环境中5%的股份有限公司₂大气12 h。表皮组织是含有1 μM Fluo-8使用0.2%的培养基Cremophor EL 1 h在37°C。洗后的染料和测距装置包含2.0毫米Ca / F12^{2 +},包含细胞室是附加到pulse-motor-driven拉伸机(ns - 600 w或st - 600 w, STREX)安装在舞台上的反向激光扫描共焦显微镜(LSM510 10倍镜头,卡尔蔡司,耶拿,德国)。延时Fluo-8荧光和Nomarski微分干涉对比图像获得每隔1 s。Ca^{2 +}成像实验在室温下进行( 24 ± 2 °C)。

改进的耐光性和溶解度hyperforin,在环糊精分子封装。Hyperforin与羟丙基-复合体 β 环糊精(HP - β cd)使用溶剂蒸发法在不同的摩尔比率。hyperforin / HP - β cd复合物进行了UV / Vis光谱学在水溶液中。摩尔比率的方法被用来确定hyperforin形成的包含复杂的化学计量学和惠普- β cd。Δ 一个,不同的吸光度hyperforin有无惠普- β cd,是对惠普的摩尔比率——绘制 β cd hyperforin 280纳米(图 1(a))。hyperforin / HP -曲线 β cd显示一个拐点的比率1:4,表明包含复杂的惠普——形成的 β cd tetracapped hyperforin半松油精终端(图半个 1(b))。接下来,我们检查的光稳定性1:复杂hyperforin / HP - 4 β 使用高效液相色谱的cd。图 1(c)显示了可见的光致退化曲线hyperforin hyperforin / HP - β cd复杂。明显半衰期hyperforin 30分钟,而hyperforin / HP - β cd复杂长时间180分钟。通过单指数衰减曲线拟合分析基线显示一个大基线(44%),曲线hyperforin / HP - β cd,暗示nondegraded的存在(photoprotected)形式的复杂(图 1(c)拟合线)。

我们之前证明伤口关闭加速角质细胞的伸展和hyperforin治疗进一步增强效应( 2)(图 1(d))。在目前的研究中,我们审查的影响hyperforin / HP - β cd上的伤口关闭。HaCaT的汇合的单层细胞培养在硅胶膜线性挠创建读~ 250的缺口 μ米宽度,和在不同条件下允许伤口愈合。图 1(d)显示代表伤口关闭图像捕获在0和抓挠后6 h和的平均值计算比例的伤口闭合区域。相比20%的持续促进伤口关闭nonstretched细胞(控制)和hyperforin (1 μ米)治疗进一步提高拉伸的效果,如图所示。Hyperforin / HP - β cd (1 μ米)也同样(或更多)有效促进伤口关闭。

据报道,拉伸刺激诱导细胞间Ca^{2 +}波在hyperforin-treated HaCaT细胞,启动从伤口边缘上的主要细胞,这发生由于ATP的释放的主要细胞,激活TRPC6在背后的细胞前缘通过激活P2Y与ATP ( 2]。我们评估是否hyperforin / HP - β cd也同样影响HaCaT角质细胞。3 h后狭窄瘢痕的汇合的单层hyperforin / HP - β -CD-treated细胞,拉伸(20%为1 s,垂直于线性gap)诱导细胞内钙的增加^{2 +}在几乎所有的主要细胞在伤口边缘和Ca^{2 +}增加对传播背后的后细胞边缘波模式(图 2(一个);网上电影S1)(见补充材料 https://doi.org/10.1155/2017/8701801)。Ca^{2 +}波发生由于主要细胞释放ATP及其背后的扩散到周围的细胞边缘,如图 2 (b)电影(S2)。应用平行延伸到线性差距对ATP-Ca本质上相同的效果^{2 +}信号和伤口愈合HaCaT细胞( 2]。

hyperforin / HP -一个明显的优势 β cd是影响stretch-induced ATP和Ca^{2 +}信号比获得简单hyperforin更可再生的。这可能是由于耐光性的提高和hyperforin / HP -的溶解度 β cd。

分析stretch-induced Ca的特点^{2 +}反应,不同抑制剂对Ca的影响^{2 +}在hyperforin / HP -响应进行评估 β -CD-treated HaCaT细胞。细胞内钙的时间进程^{2 +}反应诱导20%拉伸测量在不同的距离(0 - 240 μ从疤痕(图) 3(一个)、控制;hyperforin / HP - β -CD-treated细胞)。在0 μ米(伤口边缘),Ca^{2 +}后立即反应是诱发拉伸延长几分钟。从边缘的距离增加时,发现了一个长时间延迟发病前的活动;然而,高原期的振幅几乎是相同的。这些结果与Ca的想法一致^{2 +}波简单扩散造成的ATP释放的主要细胞在伤口边缘和激活P2Y在周围细胞背后伤口边缘。当Gd^{3 +}(10 μ米),一种抑制剂stretch-activated频道,是应用,Ca^{2 +}响应峰值降低,衰减的速度显然更快,尤其是在遥远的地区(图 3 (b))。Ca^{2 +}反应也测量了在不同条件和抑制剂,并由峰值响应的平均跟踪反应在不同的距离(图 3 (c))。压制在Ca^{2 +}在hyperforin / HP -无介质 β 在shTRPC6-treated -CD-untreated细胞和细胞,建议的涌入Ca的参与^{2 +}通过TRPC6。抑制的治疗与苏拉明(P2-receptor拮抗剂,100 μ米),apyrase (ATP-hydrolyzing酶,20 U /毫升)和CBX (hemichannel拦截器,100年 μ米)建议在这个过程中ATP信号的贡献。减少由每个治疗U73122 (PLC)抑制剂,10 μ米)和diC8-PIP2(水溶性皮普₂抑制活性的PLC的模拟与皮普竞争₂,10 μ米)建议P2Y receptor-Gq-PLC-DAG-mediated信号级联参与TRPC6的激活。这些结果一样通过治疗hyperforin (nonencapsulate)和拉伸刺激 2]。这表明释放ATP的参与通过hemichannels P2Y的主要细胞,激活细胞在伤口边缘长期Ca的涌入^{2 +}通过TRPC6 Gq-PLC-DAG级联。

确认是否hyperforin / HP - β 通过放大ATP-Ca cd促进伤口关闭^{2 +}信号,我们评估的各种抑制剂的影响在伤口上面使用闭包在持续延伸。伤口的差距几乎是收在约6小时(图 3 (d)抓挠后控制),而使用Ca进行治疗^{2 +}损耗(名义上Ca^{2 +}无),CBX (100 μ米),apyrase (20 U /毫升),苏拉明(100 μ米),Gd^{3 +}(10 μGsMTx-4(5米) μ米),shTRPC6治疗延迟伤口闭合(图 3 (d))。这表明伤口闭合过程需要ATP-Ca^{2 +}信号,尤其是Ca的涌入^{2 +}通过TRPC6。

接下来,我们评估hyperforin / HP -的影响 β cd治疗和拉伸机械刺激体外表皮的过敏性皮炎。脱离的表皮,真皮与dispase隔夜治疗后,满载着Fluo-8AM和激光共焦显微镜观察。正常皮肤表现出频繁的自发的Ca^{2 +}振荡和Ca^{2 +}拉伸刺激(1个)和随后的Ca^{2 +}波与Ca的持久的高度^{2 +}(图 4(一)、电影S3)。相比之下,过敏性皮炎的表皮显示一些振荡和只有一个小响应拉伸波(图 4 (b)、电影S4)。相比之下,过敏性皮肤hyperforin / HP -处理 β cd 24 h展出自主Ca^{2 +}振荡和瞬态长期增加Ca^{2 +}更频繁的Ca^{2 +}振荡后拉伸刺激(图 4 (c)、电影S5)。hyperforin / HP -的应用 β -CD-treatment为24小时导致过敏性皮肤的复苏mechanosensitive ATP-Ca^{2 +}信号,功能失调的治疗过敏性表皮。