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JBB.据/journal-id>

生物医学和生物技术杂志据/journal-title>

1110-7251据/issn> 1110 - 7243据/issn>

印度发布公司据/publisher-name>

295167据/article-id> 10.1155 / 2012/295167据/article-id> 295167据/article-id>

研究文章据/subject>

来自脂肪组织衍生的间充质干细胞的调节培养基诱导CD4 + Foxp3 +细胞并增加IL-10分泌据/article-title>

Ivanova-todorova据/surname> Ekaterina据/given-names> ^1据/sup> Bochev.据/surname> 伊万据/given-names> ^2据/sup> Dimitrov.据/surname> 瘤胃据/given-names> ^3.据/sup> BELEMEZOVA据/surname> Kalina据/given-names> ^3.据/sup> Mourdjeva.据/surname> 米尔娜据/given-names> ^3.据/sup> Kyurkchiev据/surname> Stanimir据/given-names> ^2据/sup> Kinov据/surname> Plamen.据/given-names> ^4.据/sup> altankova.据/surname> 伊斯克拉据/given-names> ^1据/sup> Kyurkchiev据/surname> Dobroslav.据/given-names> ^1据/sup> isobe.据/surname> 肯伊希据/given-names>

^{1据/sup>

临床免疫学实验室据/addr-line>

大学医院“圣Ivan Rilski，“索非亚医科大学据/addr-line>

15阿卡。Ivan Geshov Street据/addr-line>

1431索菲亚据/addr-line>

保加利亚据/country>

mu-sofia.bg据/ext-link>} ^{2据/sup>

生殖健康研究所据/addr-line>

ob / gyn医院“博士Shtererev，“25-31 Hristo Blagoev街据/addr-line>

1330年索菲亚据/addr-line>

保加利亚据/country>

secoduktivnozdrave.org.据/ext-link>} ^{3.据/sup>

分子免疫学实验室据/addr-line>

生殖研究所和繁殖的免疫学据/addr-line>

保加利亚科院据/addr-line>

73 Tsarigradsko Shosse Street据/addr-line>

1113年索菲亚据/addr-line>

保加利亚据/country>

bas.bg据/ext-link>} ^{4.据/sup>

骨科和创伤学系据/addr-line>

大学医院“Tsaritsa Yoanna，”医科大学索非亚据/addr-line>

拜洛莫尔街8号据/addr-line>

1527索菲亚据/addr-line>

保加利亚据/country>

mu-sofia.bg据/ext-link>}

2012据/year>

20.据/day> 11.据/month> 2012据/year>

2012据/volume> 12.据/day> 06.据/month> 2012据/year> 05.据/day> 10.据/month> 2012据/year>

这是在Creative Commons归因许可下分发的开放式访问文章，其允许在任何介质中不受限制地使用，分发和再现，只要正确引用了原始工作。据/license-p>

间充质干细胞（MSCs）是一种用于治疗自身免疫障碍的新的和有前途的工具。近年来，讨论了参与免疫应答调查的可能性。通过MSCs实现的免疫调节的确切机制尚不清楚，但是与其他免疫调节细胞的相互作用可能参与该过程。MSCs对T辅助细胞对Foxp3和细胞因子分泌表达的影响是本研究的目的。通过磁性分离从PBMC中分离T辅助细胞，并从人脂肪组织中分离MSC，并用条件的MSC培养基培养CD4 + T细胞。使用的方法包括流式细胞术，ELISA和人蛋白质组分布器试剂盒。结果表明，MSCs条件培养基中的分泌因子导致Foxp3的表达增加，并通过T佣工增加了IL-10的分泌。获得的结果为我们提供了讨论两种免疫调节细胞之间的相互作用：MSC和FOXP3 + T帮助者。我们认为这种相互作用导致分泌IL-10的免疫抑制助剂数量增加。MSCS提供了一些作用于T调节细胞的免疫抑制功能，我们认为MSCs分泌的IL-6参与了该过程。据/p> 1.介绍据/title> <p>免疫调节的方法是非常重要的用于维持在生物体的免疫稳态，和详细的知识了解这个过程的精确机制能够带来自体免疫疾病的更好和更有效的治疗。免疫反应的调节是由许多细胞亚型的完成和分泌的因素在过去几年大量的注意力都集中在间充质干细胞（MSCs）的作用据xref ref-type="bibr" rid="B1"> 1据/xref>-据xref ref-type="bibr" rid="B3"> 3.据/xref>］.众多论文报告了证明人体MSCs的重要免疫调节功能的数据。已经确定MSCs抑制T和B细胞的增殖，H据sub>2据/sub>O.据sub>2据/sub>从嗜中性粒细胞，免疫球蛋白，T和NK细胞毒性的分泌以及单核细胞分化为树突细胞的分化和成熟。此外，由MSCs引起的免疫抑制会影响细胞因子的分泌，其在IL-10和IL-4的分泌中偏离至TH2的优势，而IFN的分泌物据italic> γ.据/italic>和tnf.据italic> α.据/italic>被抑制[据xref ref-type="bibr" rid="B3"> 3.据/xref>-据xref ref-type="bibr" rid="B7"> 7.据/xref>］.MSCs免疫抑制效果的确切机制尚未澄清。特定的分泌因子的角色，如IDO，IL-6，TGF据italic> β据/italic>，LiF，Inos，PGE2，HLA-G [据xref ref-type="bibr" rid="B3"> 3.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B5"> 5.据/xref>-据xref ref-type="bibr" rid="B8"> 8.据/xref>，并讨论了MSCs和靶向细胞之间直接细胞间接触的作用[据xref ref-type="bibr" rid="B9"> 9.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B10"> 10.据/xref>］.但是，除了MSCs的直接抑制作用的数据外，也有发表的一些间接抑制作用的数据，这些间接抑制作用是通过影响其他免疫调节细胞介导的。本实验室前期研究表明，MSCs可抑制单核细胞向树突状细胞分化，下调抗原提呈相关分子表达及CCL-3、CCL-4表达。这些实验表明，从脂肪组织分离的MSCs (AT-MSCs)比从人骨髓分离的MSCs (BM-MSCs)的作用更强[据xref ref-type="bibr" rid="B11"> 11.据/xref>］.MSCs的一些间接免疫抑制作用似乎是由于它们对通常称为Tregs的经典免疫调节CD4 + Foxp3 +细胞的影响。过去十年目睹了T监管细胞的想法的重大发展。以及分泌TGF的TH3细胞据italic> β据/italic>和分泌IL-10的Tr1 [据xref ref-type="bibr" rid="B12"> 12.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B13"> 13.据/xref>]为CD4 + CD25 + T淋巴细胞建立了作用，该淋巴细胞通过CTLA-4，TGF施加免疫抑制据italic> β据/italic>，和/或IL-10 [据xref ref-type="bibr" rid="B14"> 14.据/xref>-据xref ref-type="bibr" rid="B17"> 17.据/xref>］.后来在细胞内转录因子Foxp3被鉴定为T调节群的更精确标记[据xref ref-type="bibr" rid="B18"> 18.据/xref>-据xref ref-type="bibr" rid="B20"> 20.据/xref>］.已经确定约2％的CD4 +细胞表达FOXP3 [据xref ref-type="bibr" rid="B18"> 18.据/xref>]，与treg细胞分化有关，直接发挥功能性免疫抑制作用[据xref ref-type="bibr" rid="B13"> 13.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B17"> 17.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B21"> 21.据/xref>］.最近，CD25分子作为抑制亚群标记的作用引起了一些质疑。显然，CD127表面表达的缺失更准确地与FoxP3相关，甚至在CD25阴性细胞中也可以发现这一点[据xref ref-type="bibr" rid="B18"> 18.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B22"> 22.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B23"> 23.据/xref>］.鉴定了甚至更多的患有系统性红斑狼疮（SLE）的患者CD4 + CD25 + Foxp3 +和CD4 + CD25-Foxp3 +细胞已鉴定出具有表达的免疫抑制性质的[据xref ref-type="bibr" rid="B24"> 24.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B25"> 25.据/xref>］.这就是Tregs更常用为CD4 + Foxp3 +的原因。通过CD4 + Foxp3 +细胞施加的免疫抑制的分子机制尚未鉴定，但它们非常明显，这些机制包括TGF的分泌据italic> β据/italic>和/或IL-10 [据xref ref-type="bibr" rid="B12"> 12.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B17"> 17.据/xref>-据xref ref-type="bibr" rid="B19"> 19.据/xref>］.据/p> <p>一些公布的数据似乎表明，MSC的CD4 +的FoxP3 +细胞的数量增加的影响下，这些细胞产生的免疫抑制性细胞因子IL-10，且因此施加的MSC间接免疫抑制作用[据xref ref-type="bibr" rid="B2"> 2据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B7"> 7.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B9"> 9.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B10"> 10.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B26"> 26.据/xref>］.据/p> <p>本研究的目的是分析AT-MSCs条件培养基对CD4+ T淋巴细胞亚群FoxP3分子表达和细胞因子分泌的影响。此外，还分析了AT-MSCs分泌的因子对CD4+ T淋巴细胞群变化的推测影响。据/p> </sec> <sec id="sec2"> <title>2.材料和方法据/title> <sec id="sec2.1"> <title>2.1。材料据/title> <p>通过静脉血血管从12个健康的志愿者进行外周血样品，在髋关节手术期间收集12种人脂肪组织样品。在这两种情况下，在根据该国的法规签署捐助者的签署知情同意后，采取了样品。据/p> </sec> <sec id="sec2.2"> <title>2.2。间充质干细胞据/title> <p>间充质干自脂肪组织的细胞中分离，培养，和表型严格遵循普遍接受的实验室规程和最重要的协议在我们实验室开发[据xref ref-type="bibr" rid="B4"> 4.据/xref>］.据/p> </sec> <sec id="sec2.3"> <title>2.3。条件培养基据/title> <p>在形成单层后，胰酶EDTA (1:25 0) (PAA，奥地利)处理后分离at - mscs，并以3-5 × 10的浓度接种于6孔板(第1代)据sup>4.据/sup>细胞/孔的DMEM培养基中补充有10％胎牛血清和抗生素（PAA，奥地利）。将细胞培养，直至培养基每48小时更换达到80％汇合。介质的最后变化之后，将80％汇合的细胞进一步培养48小时，并收集指定为“空调AT-MSC介质”的平台。因此，空调的AT-MSC培养基含有DMEM，FBS，和由未活化的AT-MSC分泌的任何因素。该过程严格遵循在与T细胞分离并从12个单独的供体和上述得到的条件培养基的12个不同的样品中纯化进行12个独立的实验。据/p> </sec> <sec id="sec2.4"> <title>2.4。T辅助淋巴细胞的分离据/title> <p>采用密度梯度离心法(Ficoll-Paque PLUS, GE Healthcare)从外周血中分离出PBMCs(外周血单核细胞)。将分离的细胞用MACS试剂盒(Miltenyi Biotec, bergishi - gladbach, Germany)磁性分离纯化CD4+ T淋巴细胞。首先，通过抗CD14-微珠的阳性选择从PBMCs中去除CD14+单核细胞，收集流过的部分。使用抗CD4-微珠从得到的CD14−细胞部分富集CD4+细胞，并通过流式细胞术进一步对富集的CD4+细胞部分进行表征，主要是关于CD3/CD4标记物的表达。据/p> </sec> <sec id="sec2.5"> <title>2．5．细胞培养据/title> <p>将分离的T助佣金（Th）在第一次培养48小时的第一通道中在条件培养基中培养48小时。控制T辅助细胞在补充有10％胎牛血清（Paa，奥地利）的DMEM低葡萄糖培养基中培养。将细胞浓度接种据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M1"> <mml:mn> 5.据/mml:mn> <mml:mo> ×据/mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10.据/mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 6.据/mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>细胞/孔进入24孔板（Paa，奥地利）。据/p> </sec> <sec id="sec2.6"> <title>2.6。流式细胞仪据/title> <p>用单克隆抗体抗人CD3 FITC和抗人CD4 PE证明了纯化的T辅助群的均匀性。抗人CD4 FITC，抗人HLA-DR PE和抗人CD69 PE抗体用于评估活化标志物的CD4 + T淋巴细胞的表面表达，CD4 + T淋巴细胞在AT-MSC条件培养基中以及对照T助手中文化。使用CD4 PERCP-CY 5.5，抗人CD25 FITC，抗人FOXP3 PE和FOXP3缓冲液组成，进行表达表面CD25和细胞内FOXP3的T辅助细胞的鉴定。所有使用的抗体和机器（FacScalibur）购自美国加州加州北迪金森购物。据/p> </sec> <sec id="sec2.7"> <title>2.7。酶联免疫吸附试验(ELISA)据/title> <p>用AT-MSC调节培养基或来自对照细胞培养物培养的TH淋巴细胞的上清液以及AT-MSCS条件培养基的样品进行IL-2，IFN据italic> γ.据/italic>严格制造商的指示，IL-10和人类即时ELISA（BENDER MEDSYSTEMS，奥地利）的TGFB。据/p> </sec> <sec id="sec2.8"> <title>2.8。蛋白质组分布器套件据/title> <p>使用Human Cytokine array panel A array kit (R&D Systems, MN, USA)分析AT-MSCs培养上清中的细胞因子，该试剂盒可检测36种不同的细胞因子、趋化因子和生长因子(C5a, CD40L, G-CSF, GM-CSF, GRO)据italic> α.据/italic>，I-309，SICAM-1，IFN据italic> γ.据/italic>，IL-1据italic> α.据/italic>，IL-1据italic> β据/italic>、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-16、IL-17、IL-17E、IL-23、IL-27、IL-32据italic> α.据/italic>， ip-10, i-tac, McP-1, mif, mip-1据italic> α.据/italic>，mip-1据italic> β据/italic>， Serpin E1, RANTES, SDF-1, TNF据italic> α.据/italic>，TREM-1）。据/p> <p>目的是评估的任何迹象凋亡AT-MSCs CD4 + T细胞培养的条件培养基或CD4 +控制细胞蛋白质组分析器人类细胞凋亡工具包(研发系统、MN、美国)被用来作为这个测试能够建立细胞内的表达不好,伯灵顿,bcl - 2, Bcl-x, Pro-Caspase-3, Caspase-3裂解,过氧化氢酶,clap-1,Claspin, Clusterin, Cytochrome C, TRAIL R1/DR4, TRAIR R1/DR5, FADD, Fas/TNFSF6, HIF-1据italic> α.据/italic>，HO-1 / HMOX1 / HPS32，HO-2 / HMOX2，HSP27，HSP60，HSP70，HTRA2 / OMI，LIVIN，PON2，P21 / CIP1 / CDNK1A，P27KIP1，磷光P53（S15），磷酸P53（S46），磷酸-P53（S392），磷酸-RAT17（S635），SMAC /暗黑破坏神，Survivin，TNF RI / TNFRSF1A，XIAP。据/p> </sec> <sec id="sec2.9"> <title>2.9。软件据/title> <p>程序CellQuest和WinMDI 2.9用于分析流式细胞术数据。Image J Program（NIH，Bethesda，MD，USA）用于分析人细胞因子阵列面板的结果A阵列试剂盒和蛋白质组分布者人凋亡试剂盒。据/p> </sec> <sec id="sec2.10"> <title>2.10。统计数据据/title> <p>使用配对的学生进行细胞因子浓度的统计分析据italic> T.据/italic>-测试。数据显示为平均值±标准偏差（SD）。统计显着性成立于据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M2"> <mml:mi> P.据/mml:mi> <mml:mo> 据据/mml:mo> <mml:mn> ０．０５据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>。据/p> </sec> </sec> <sec id="sec3"> <title>3.结果据/title> <sec id="sec3.1"> <title>3.1。在MSCs条件培养基中存在的分泌因子导致表达FOXP3的T辅助细胞的数量增加据/title> <p>我们的实验中随后的程序导致分离非常均匀的CD3 + CD4 + T辅助淋巴细胞（图据xref ref-type="fig" rid="fig1a"> 1（a）据/xref>和据xref ref-type="fig" rid="fig1b"> 1（b）据/xref>）.在-MSCS条件培养基中培养这些细胞不会导致活化标志物CD69和HLA-DR的表达中的任何改变（数据未显示）。然而，条件培养基中的Th细胞的培养导致表达Foxp3的CD4 + T淋巴细胞的数量增加（图据xref ref-type="fig" rid="fig1d"> 1（d）据/xref>）与对照单元中相同的参数相比（图据xref ref-type="fig" rid="fig1c"> 1（c）据/xref>）.发现该效果对于CD25的表面表达和CD25的阴性助剂产生阳性，并记录在各个供体检测的所有样品中（表据xref ref-type="table" rid="tab1"> 1据/xref>）.因此，很明显，在-MSCs条件培养基中存在的一些分泌因子诱导转录因子Foxp3的特异性上调，所述转录因子Foxp3定义Treg亚泊素，无论CD25的表达如何。据/p> <table-wrap id="tab1"> <label>表1据/label> <p>AT-MSCS条件培养基对不同供体获得的T辅助细胞培养物中CD4 + Foxp3 + T淋巴细胞百分比值的影响。与各自的对照培养相比，所测试的所有受试者的数据揭示了在AT-MSC条件培养基存在下增加CD4 + CD25 + Foxp3 +和CD4 + CD25-Foxp3 +细胞数的稳定趋势。据/p> <table> <thead> <tr> <th align="left"></th> <th align="center" colspan="2">CD4 + CD25 + FoxP3 +据/th> <th align="center"></th> <th align="center" colspan="2">CD4 + CD25-FOXP3 +据/th> </tr> <tr> <th align="left"></th> <th align="center">W / O AT-MSC的C.M。据/th> <th align="center">在AT-MSCS C.M.据/th> <th align="center"></th> <th align="center">W / O AT-MSC的C.M。据/th> <th align="center">在AT-MSCS C.M.据/th> </tr> </thead> <tbody> <tr> <td align="left">捐赠者1据/td> <td align="center">3.45％据/td> <td align="center">4.42％据/td> <td align="center"></td> <td align="center">2.12%据/td> <td align="center">4.12％据/td> </tr> <tr> <td align="left">捐赠者2.据/td> <td align="center">2.19％据/td> <td align="center">2.91％据/td> <td align="center"></td> <td align="center">1.72％据/td> <td align="center">2.37％据/td> </tr> <tr> <td align="left">捐助者3.据/td> <td align="center">5.04％据/td> <td align="center">5.52%据/td> <td align="center"></td> <td align="center">1.74％据/td> <td align="center">2.26％据/td> </tr> <tr> <td align="left">捐助者4.据/td> <td align="center">1.47％据/td> <td align="center">2.48%据/td> <td align="center"></td> <td align="center">2.84％据/td> <td align="center">3.06％据/td> </tr> <tr> <td align="left">捐助者5.据/td> <td align="center">3.95%据/td> <td align="center">5.73%据/td> <td align="center"></td> <td align="center">1.88％据/td> <td align="center">2.25％据/td> </tr> <tr> <td align="left">捐赠者6.据/td> <td align="center">2.87％据/td> <td align="center">4.55％据/td> <td align="center"></td> <td align="center">1.01％据/td> <td align="center">1.95％据/td> </tr> <tr> <td align="left">捐助者7.据/td> <td align="center">5.80％据/td> <td align="center">7.65％据/td> <td align="center"></td> <td align="center">2.84％据/td> <td align="center">4.32％据/td> </tr> <tr> <td align="left">捐赠者8.据/td> <td align="center">5.69％据/td> <td align="center">5.81％据/td> <td align="center"></td> <td align="center">3.13%据/td> <td align="center">3.78％据/td> </tr> <tr> <td align="left">捐赠者9.据/td> <td align="center">1.30%据/td> <td align="center">3.33％据/td> <td align="center"></td> <td align="center">1.41%据/td> <td align="center">2.32％据/td> </tr> <tr> <td align="left">捐赠者10.据/td> <td align="center">1.77%据/td> <td align="center">2.03％据/td> <td align="center"></td> <td align="center">0.7％据/td> <td align="center">1.10％据/td> </tr> <tr> <td align="left">捐赠者11.据/td> <td align="center">1.90％据/td> <td align="center">5.39％据/td> <td align="center"></td> <td align="center">0.7％据/td> <td align="center">0.92％据/td> </tr> <tr> <td align="left">捐赠者12.据/td> <td align="center">2.92%据/td> <td align="center">5.06%据/td> <td align="center"></td> <td align="center">1.6％据/td> <td align="center">1.7％据/td> </tr> </tbody> </table> </table-wrap> <fig-group id="fig1"> <p>有代表性的点图显示CD25和FoxP3标记在T辅助细胞中的表达。图(a)和(b)显示纯化CD4+人群的同质性;(c)显示对照培养中FoxP3+细胞的百分比;(d)在AT-MSCs条件培养基中培养后，表达FoxP3的细胞百分比增加。据/p> <fig id="fig1a"> <label>（一种）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/bmri/2012/295167.fig.001a"></graphic> </fig> <fig id="fig1b"> <label>（b）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/bmri/2012/295167.fig.001b"></graphic> </fig> <fig id="fig1c"> <label>（C）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/bmri/2012/295167.fig.001c"></graphic> </fig> <fig id="fig1d"> <label>（d）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/bmri/2012/295167.fig.001d"></graphic> </fig> </fig-group> <p></p> </sec> <sec id="sec3.2"> <title>3.2。在MSCs条件培养基中存在的分泌因子导致T辅助淋巴细胞的IL-10分泌的上调据/title> <p>对分泌的细胞因子的研究发现TGF的存在据italic> β据/italic>在在-MSCS条件培养基中培养的CD4 + T细胞中的非常低的浓度并在所有案例中对CD4 + T中等样品进行控制（图据xref ref-type="fig" rid="fig2a"> 2（a）据/xref>）.IFN浓度差异无统计学意义据italic> γ.据/italic>或在每个实验中的实验或对照样品中的IL-2，供体淋巴细胞的实验中（图据xref ref-type="fig" rid="fig2b"> 2 (b)据/xref>和据xref ref-type="fig" rid="fig2c"> 2 (c)据/xref>）.与这些发现相比，与对照上清液相比，在-MSC条件培养基中培养的CD4 + T细胞的上清液中检测到统计学上显着的IL-10浓度的IL-10。（图据xref ref-type="fig" rid="fig2d"> 2 (d)据/xref>）.在MSC条件培养基中培养的所有病例中，记录了IL-10的这种增加的分泌。应该指出的是，AT-MSCS条件培养基本身不含任何IL-10，这使我们得到了地面，得出结论，在-MSCS条件培养基中培养的T佣金的T助剂的增加浓度是由于其分泌通过活化的TH淋巴细胞。据/p> <fig-group id="fig2"> <p>通过CD4 + T细胞分泌细胞因子淋巴细胞AT-MSC的条件培养基或DMEM控制培养基中培养。CD4 + T细胞在AT-MSC的培养条件培养基不诱导变化TGF分泌据italic> β据/italic>（a），ifn据italic> γ.据/italic>（b），或il-2（c）。相比之下，IL-10的分泌在统计学上显着上调（据inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M3"> <mml:mmultiscripts> <mml:mrow> <mml:mi> P.据/mml:mi> </mml:mrow> <mml:mprescripts></mml:mprescripts> <mml:none></mml:none> <mml:mrow> <mml:mi> *据/mml:mi> </mml:mrow> </mml:mmultiscripts> <mml:mo> 据据/mml:mo> <mml:mn> ０．０５据/mml:mn> </mml:math> </inline-formula>）与对照（D）相比，在AT-MSC条件培养基的存在下。显示了来自不同供体细胞的12个独立实验的平均值±SD。据/p> <fig id="fig2a"> <label>（一种）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/bmri/2012/295167.fig.002a"></graphic> </fig> <fig id="fig2b"> <label>（b）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/bmri/2012/295167.fig.002b"></graphic> </fig> <fig id="fig2c"> <label>（C）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/bmri/2012/295167.fig.002c"></graphic> </fig> <fig id="fig2d"> <label>（d）据/label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/bmri/2012/295167.fig.002d"></graphic> </fig> </fig-group> </sec> <sec id="sec3.3"> <title>3.3。条件培养基AT-MSC分泌的因素并没有引起在亲任何更改，并在T辅助淋巴细胞抗凋亡因子据/title> <p>MSCs改变T辅助细胞的一种可能方式是凋亡过程的影响，为了验证这种可能性，我们在相同的实验设计中检测了细胞内促凋亡或抗凋亡因子的存在和变化。然而，在AT-MSCs培养基中培养的Th细胞与对照细胞之间没有显著差异(数据未显示)。据/p> </sec> <sec id="sec3.4"> <title>3．4．AT-MSCs条件培养基含有一些趋化因子和IL-6据/title> <p>对AT-MSCs条件培养基的重复测试表明，它含有几种具有已知效果的趋化因子对T辅助细胞和具有经过验证的免疫调节作用的单一细胞因子。趋化因子是gro据italic> α.据/italic>，rantes，serpine，IL-8和SDF-1和来自细胞因子的IL-6被发现在AT-MSCS条件培养基中具有相当高的浓度。这些趋化因子和IL-6在对照培养基中的可忽略浓度下被发现，该培养基通过AT-MSCs分泌出来（图据xref ref-type="fig" rid="fig3"> 3.据/xref>）.据/p> <fig id="fig3"> <label>图3.据/label> <p>与对照DMEM培养基(灰色柱)相比，在at - mscs条件培养基(黑色柱)中发现显著水平的细胞因子和趋化因子。图中仅代表已知影响辅助T细胞活动的细胞因子和趋化因子。据/p> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/bmri/2012/295167.fig.003"></graphic> </fig> </sec> </sec> <sec id="sec4"> <title>4。讨论据/title> <p>得到的结果表明，当在MSC条件培养基中培养CD4 + T淋巴细胞的均匀群时，表达FOXP3的T助剂的百分比随着CD25 +和CD25-细胞亚群而增加。CD4 + CD25 + Foxp3 +细胞作为主要免疫抑制因子的作用是相当长的时间已知的。已经描述了这些细胞可以直接从胸腺发起，并且被称为天然（NTREGS），或者可以在周边细胞因子的影响下分化，并且称为诱导（ITREGS）[据xref ref-type="bibr" rid="B13"> 13.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B19"> 19.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B27"> 27.据/xref>］.负责诱导ITREG的分化的主要细胞因子最可能是IL-2和TGF据italic> β据/italic>[据xref ref-type="bibr" rid="B28"> 28.据/xref>］.我们无法在AT-MSCs条件培养基中检测到这些细胞因子，但从CD4+CD25+FoxP3+的百分率来看，我们推测其他细胞因子可能参与了这个过程，如下所述。据/p> <p>此外，我们的结果表明，AT-MSC的影响下条件培养基，近期描述的亚群CD4 + CD25-FOXP3 +增加的百分比为好。发现这些细胞在SLE患者中增加，且被认为是CD25 +细胞[祖细胞的据xref ref-type="bibr" rid="B24"> 24.据/xref>］.在专业文献中讨论了不同的意见，因为一些作者表示一些怀疑这种亚贫困是自身免疫调节的[据xref ref-type="bibr" rid="B18"> 18.据/xref>]，但普遍的观点独立地是CD25，所述的FoxP3本身的表达发挥功能抑制[据xref ref-type="bibr" rid="B13"> 13.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B17"> 17.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B21"> 21.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B29"> 29.据/xref>］.基于这种假设，调节细胞更常用为CD4 + Foxp3 + [据xref ref-type="bibr" rid="B18"> 18.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B19"> 19.据/xref>］.通常接受CD4 + Foxp3 +细胞通过TGF的分泌表达其免疫抑制作用据italic> β据/italic>和/或IL-10 [据xref ref-type="bibr" rid="B12"> 12.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B15"> 15.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B17"> 17.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B18"> 18.据/xref>］.在我们的研究中，我们没有记录TGF的分泌增加据italic> β据/italic>通过在MSC培养基中培养的CD4 + T淋巴细胞。在我们实验中使用的实验设计下，这种细胞因子在CD4 + T淋巴细胞表面表达为膜结合形式，因为已经针对CD4 + Foxp3 +细胞描述了这种机制，并且仍然能够表达其抑制性影响 [据xref ref-type="bibr" rid="B14"> 14.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B19"> 19.据/xref>］.然而，统计上显著上升发现通过在AT-MSCs条件培养基中培养的CD4 + T淋巴细胞分泌的IL-10。IL-10的CD4 +的FoxP3 +细胞的分泌被认为是最重要的机制之一经由该细胞亚群施加的免疫抑制功能[据xref ref-type="bibr" rid="B30"> 30.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B31"> 31.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B31"> 31.据/xref>］.IL-10是一种抗炎细胞因子，可抑制巨噬细胞和树突状细胞分泌促炎细胞因子[据xref ref-type="bibr" rid="B30"> 30.据/xref>］.它抑制Th17的活动[据xref ref-type="bibr" rid="B31"> 31.据/xref>]血液单核细胞的分化为树突细胞[据xref ref-type="bibr" rid="B11"> 11.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B30"> 30.据/xref>］.最重要的免疫调节作用之一是通过抑制对抗原呈递(如B7复合体)至关重要的分子来诱导树突状细胞的耐受[据xref ref-type="bibr" rid="B11"> 11.据/xref>］.此外，IL-10直接抑制钍表面上的CD28的表达，该分子是用于B7复杂的特异性配体。我们以前的结果表明，AT-MSC的单核细胞通过树突状细胞上调IL-10的分泌[据xref ref-type="bibr" rid="B11"> 11.据/xref>］.然而，在所描述的实验条件下，不能要求CD4 + Foxp3 +电池是IL-10的唯一来源，但是考虑到这些细胞的数量增加，因此增加了增加的致病联系CD4 + Foxp3 +细胞的数量和培养基中的IL-10的增加浓度。可以进一步推测，在AT-MSC的影响下，分泌IL-10的CD4 + FoxP3 +细胞的数量增加，这可能导致树突细胞表面上的共刺激分子表达的抑制作用助手是在T辅助细胞中诱导盲肠的最重要条件。因此，与其他用于免疫抑制的机制，AT-MSCs通过影响其他免疫调节细胞如树突细胞和CD4 + Foxp3 +淋巴细胞来实现间接免疫抑制（图据xref ref-type="fig" rid="fig4"> 4.据/xref>）.AT-MSCs通过CD4 + Foxp3 + T细胞诱导IL-10的分泌。该细胞因子抑制抗原呈递关键分子的表达，并且该过程导致T淋巴细胞的盲肠。可以推测由AT-MSCs分泌的IL-6是负责这种效果的关键元件之一。据/p> <fig id="fig4"> <label>图4.据/label> <p>AT-MSCs分泌因子的免疫调节效果的可能间接机制。据/p> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/bmri/2012/295167.fig.004"></graphic> </fig> <p>众所周知，与其抗炎作用平行，IL-10对树突细胞具有促凋亡效应，如前一篇论文所示[据xref ref-type="bibr" rid="B11"> 11.据/xref>］.本研究未发现在AT-MSCs条件培养液中培养的CD4+ T淋巴细胞胞内促凋亡因子或抗凋亡因子表达有任何变化。据报道，MSCs一般通过细胞之间的直接接触来实现其免疫调节功能[据xref ref-type="bibr" rid="B6"> 6.据/xref>或通过分泌细胞因子。据/p> <p>如上AT-MSC的提及是在我们的实验中，这意味着所观察到的影响是由于分泌的因子在培养基中的存在下使用条件培养基。趋化因子如格罗据italic> α.据/italic>影响T淋巴细胞的趋化性的咆哮，衍生物E，IL-8和SDF-1存在于调节培养基样品中存在。因此，可以假设通过将T淋巴细胞作为该方法的第一步，开始通过募集T淋巴细胞来启动由AT-MSCS实现的免疫抑制过程。据/p> <p>在文献中报道了MSCs分泌的几种类型的分泌因子，可以影响CD4 + Foxp3 +细胞的形成，并且这些包括IDO，TGF据italic> β据/italic>、INOs、PGE2、HLA-G5、I-309、IL-10、IL-6 [据xref ref-type="bibr" rid="B6"> 6.据/xref>-据xref ref-type="bibr" rid="B9"> 9.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B31"> 31.据/xref>］.据/p> <p>在我们的实验中，虽然我们搜索了TGF，但IL-6的存在仅记录在AT-MSC条件培养基的样本中据italic> β据/italic>，I-309和IL-10。对此事实的可能解释是假设MSCs在被其他细胞因子刺激后分泌许多细胞因子[据xref ref-type="bibr" rid="B3"> 3.据/xref>］.因此，在IFN刺激后据italic> γ.据/italic>MSCS分泌I-309，其侧面诱导Tregs的形成[据xref ref-type="bibr" rid="B8"> 8.据/xref>而直接接触和IL-10的分泌则在诱导HLA-G5的分泌中起关键作用，而HLA-G5的分泌也具有同样的作用[据xref ref-type="bibr" rid="B9"> 9.据/xref>］.我们的结果表明，通过AT-MSCs的IL-6分泌不需要这样的诱导。IL-6的普遍接受的观点认为，它是一种促炎细胞因子，其在抑制Tregs和Th17免疫反应的刺激中具有作用[据xref ref-type="bibr" rid="B18"> 18.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B33"> 32.据/xref>］.然而，其他数据可能会认为，IL-6的功能应该重新评估，因为其报道的免疫抑制活性。IL-6引起IL-10分泌增加，具有抗凋亡作用[据xref ref-type="bibr" rid="B7"> 7.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B34"> 33.据/xref>］.据报道，MSCs分泌高水平的IL-6，并且这种分泌直接与T细胞的抑制相关，抑制树突细胞的分化，以及抑制促炎细胞因子的分泌[据xref ref-type="bibr" rid="B35"> 34.据/xref>］.类似地，IL-6通过通过自分割机制作用的MSC增加了其他免疫抑制因子的分泌，例如INOS和PGE2 [据xref ref-type="bibr" rid="B36"> 35.据/xref>[还直接导致新描述的CD8 + Foxp3 +免疫调节细胞的数量增加[据xref ref-type="bibr" rid="B29"> 29.据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B37"> 36.据/xref>］.IL-6的许多活动提到地讨论其作为抗炎细胞因子的作用。与上述数据和我们自己的结果一致，可以推测，在IL-6的影响下，在非刺激的AT-MSCs分泌的IL-10分泌的CD4 + FoxP3 +细胞的数量增加，因此在-MSCS实现一个通过Tregs间接免疫抑制作用。真的不应该声称IL-6是该过程中唯一的一个细胞因子，因为调节CD4 + Foxp3 +细胞功能的大多数因素尚未在我们的实验中进行测试。最重要的是MSCs分泌免疫抑制因子的细胞因子诱导以及与随后的HLA-G5分泌的直接细胞对细胞接触是高度的。我们实验室的先前结果显示了在MSC的细胞质中存在HLA-G5 [据xref ref-type="bibr" rid="B38"> 37.据/xref>由于在几篇论文中描述了该分子关于Tregs细胞的影响[据xref ref-type="bibr" rid="B1"> 1据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B5"> 5.据/xref>-据xref ref-type="bibr" rid="B7"> 7.据/xref>］.据/p> </sec> <sec id="sec5"> <title>结论据/title> <p>总之，得到的结果表明，在通过AT-MSCs分泌的因子的影响下，增加CD4 + Foxp3 +淋巴细胞的数量，并且在纯化的CD4 + T细胞群中上调IL-10的分泌。可以假设IL-6的存在对于该过程非常重要。MSCs对FoxP3 +细胞的类似效果并在其他论文中描述了IL-10的分泌[据xref ref-type="bibr" rid="B2"> 2据/xref>那据xref ref-type="bibr" rid="B6"> 6.据/xref>-据xref ref-type="bibr" rid="B9"> 9.据/xref>而骨髓间充质干细胞和脐带间充质干细胞已被使用，并与不同类型的细胞混合培养。我们实验的原始特征是使用AT-MSCs条件培养基和CD4+ T淋巴细胞的同质群体。在这些条件下，没有可能通过其他细胞类型激活AT-MSCs的直接细胞间接触，并且观察到AT-MSCs“天然”或“被动”分泌细胞因子及其对纯化的T辅助细胞的影响。据/p> </sec> <back> <ref-list> <ref id="B1" content-type="article"> <label>1据/label> <nlm-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> Fiorina.据/surname> <given-names> P.据/given-names> </name> <name> <surname> 朱威兹据/surname> <given-names> m据/given-names> </name> <name> <surname> 奥古洛据/surname> <given-names> 一种。据/given-names> </name> <name> <surname> vergani.据/surname> <given-names> 一种。据/given-names> </name> <name> <surname> 达达据/surname> <given-names> S.据/given-names> </name> <name> <surname> La Rosa据/surname> <given-names> S.据/given-names> </name> <name> <surname> 塞利格据/surname> <given-names> m据/given-names> </name> <name> <surname> god据/surname> <given-names> j。据/given-names> </name> <name> <surname> 法律据/surname> <given-names> K.据/given-names> </name> <name> <surname> Placidi.据/surname> <given-names> C。据/given-names> </name> <name> <surname> 史密斯据/surname> <given-names> r . N。据/given-names> </name> <name> <surname> Capella.据/surname> <given-names> C。据/given-names> </name> <name> <surname> Rodig据/surname> <given-names> S.据/given-names> </name> <name> <surname> 阿德拉据/surname> <given-names> C. N.据/given-names> </name> <name> <surname> 阿特金森据/surname> <given-names> m据/given-names> </name> <name> <surname> Sayegh.据/surname> <given-names> M. 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