2。材料和方法
2.1。在硅生物微阵列数据集的分析
为了确定候选基因参与电视的神经营养特性,基因列表ATSC-specific基因通过基因芯片分析相比,电视从骨髓间充质细胞(bmsc)和成纤维细胞(
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds ,加入GSE8954) [
3 )接受了
特别的 生物分析,旨在发现神经相关的基因。为此,441个基因的列表在电视专门调节(
P
值< 0.01),结果的统计分析(见[
3 )用于数据分析的统计方法),是根据分类实施“生物功能”注释基因本体论注释(果)数据库(
http://www.ebi.ac.uk/GOA/ )。特定的神经、神经发育和/或神经营养功能进一步研究使用“基因参考到功能”工具在基因库(
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/about-generif )。
2.2。病人和标本
脂肪组织()获得的标本lipoaspiration从健康志愿者(平均年龄40.2±14.2年)获得书面同意。皮肤活检retroauricular地区获得一个健康男性捐赠者的隔离(45岁),人类皮肤成纤维细胞(HDF)。个人数据保密和匿名处理。在这项研究中使用的程序都是通过罗马的天主教大学的伦理委员会(意大利罗马;P552 (A.779) / CE2007)。
2.3。化学药品和试剂
细胞培养基和补品是从Lonza购买(瑞士巴塞尔)。酶、生长因子和其他化学物质用于本研究从σ购买(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),除非另有说明。
2.4。电视文化隔离和
间充质基质细胞分离从lipoaspirates小学文化,正如已经描述的其他地方(
3 ]。短暂,在广泛洗,机械分离,并使用0.1%胶原酶消化类型八世。细胞溶解组织是100年然后过滤
μ m网格,细胞悬液离心。细胞颗粒镀在T75组织培养瓶使用修改后杜尔贝科的鹰的血压得到较好的控制介质(DMEM),补充了10%的边后卫,青霉素100单位/毫升,100年
μ g / mL链霉素和0.2 ng / mL纤维母细胞生长因子β(bFGF)。细胞被亚文化如前所述[
3 ),然后使用
在体外 和
在活的有机体内 实验,详细在以下段落。电视增长动力学十五文化段落及其immunophenotype评估已经描述的其他地方(
6 ]。
2.5。HDF隔离和文化
真皮成纤维细胞被孤立在初级文化从皮肤活检和培养如前所述
8 ]。这些细胞作为mesodermal-derived分化控制生产条件培养液(HDF-CM)中使用
在体外 实验(见下面的段落)。
4所示。体内<斜体> < /斜体>实验程序:新生儿老鼠大脑电视接种
4.1。Adenoviral-Mediated细胞转导
为了使电视生活的可辨认的组织,使用有缺陷的细胞转染adenoviral向量携带增强型绿色荧光蛋白作为报告基因(AdEGFP)。AdEGFP股请提供的向量的核心设施匹兹堡大学(美国宾夕法尼亚州)。细胞被镀在104 /厘米2 播种密度和对待AdEGFP使用感染复数(MOI) 100点状单位(pfu) /细胞。细胞转导效率评估观察荧光细胞48小时后使用一个invertoscope配备了日光灯。EGFP-expressing细胞接种在新生儿的老鼠,进一步描述。
4.2。细胞移植
人类电视转导与广告。eGFP 48小时之前
在活的有机体内 移植。手术进行新生儿老鼠在产后第一天(P1),深麻醉诱导后的体温过低。小壁孔制成额叶皮层上方的头骨,和细胞慢慢注入侧脑室(1毫米后,前囱1毫米侧中线,2 - 2.5毫米,腹软膜的表面)使用玻璃微量吸液管耦合汉密尔顿微量调节注射器。对于每个动物治疗,
5
×
10
4
电视悬浮在1
μ L冰球的盐水(表达载体,卡尔斯巴德,Ca)。Sham-operated动物注射同样体积的生理盐水。治疗后,皮肤迅速缝合,小狗一盏灯下温暖,回到了爵士。所有动物协议的动物实验委员会已经批准使用罗马的天主教大学。
4.3。组织处理
这些动物牺牲注入(7和15天后
n
=
6
电视的每组治疗大鼠
n
=
3
为每个组sham-treated动物)。深麻醉下(氯胺酮/安定1:1 i.p),他们通过主动脉灌注生理盐水100毫升,其次是100毫升0.01 M, pH值7.4 PBS和4%多聚甲醛。灌注后30分钟,大脑从头骨,后缀在PBS 4%多聚甲醛2 h,沉浸在30%蔗糖。连续40
μ 米厚的日冕部分冷冻切片机被削减。第一个系列的部分是安装在Vectashield(荧光eGFP-expressing评价向量,英国)细胞。其他系列的相邻部分是免疫组织化学处理。
4.4。免疫组织化学
Anti-GFAP(多克隆、Dako斯特鲁普、丹麦、1:1000一夜之间在4°C), -Doublecortin (policlonal Chemicon,泰梅库拉,Ca, 1: 3000年,一夜之间在4°C), -NeuN(单克隆,Chemicon泰梅库拉,Ca, 1: 500年,48小时在4°C), - o4(单克隆,Chemicon泰梅库拉,Ca, 1: 500年,一夜之间在4°C),和-TrKA(圣克鲁斯生物技术、海德堡、德国,1:1000一夜之间在4°C)显示使用青蓝fluorochromes-labeled二级抗体(驴anti-mouse Cy3或驴anti-rabbit Cy3,杰克逊Immunoresearch实验室、西树林,Pa, 1: 400)孵化后1小时在rt,部分安装在Vectashield荧光可视化的标记细胞。控制由省略主要抗体。
eGFP的colocalization上述标记检查了蔡司LSM 510共焦激光扫描显微镜系统。
5。结果
5.1。电视表达Neurospecific基因
从之前发布的微阵列数据中提取数据显示441个基因的选择性upregulation (
P
<
0.01
)相比,电视BMSC与人类成纤维细胞MRC5细胞(图
1 )。的
在网上 生物微阵列数据的分析(地理数据集GSE8954)允许确定一个简短的列表与生物相关的基因,参与神经保护、神经发育过程中,神经营养功能(见表
1 )。特别是,这个12-transcript列表包括基因,即神经生长因子β(NGFB) neuropilin 1 (NRP1)和三磷酸鸟苷cyclohydrolase 1 (GCH1),编码溶性神经营养因子来调节神经元生长,分化,迁移和神经保护
9 ,
14 ,
15 ]。神经元钙粘着蛋白CDH2属于主要transmembranar信号复杂的钙粘着蛋白/连环蛋白神经过程在早期发展中扮演着重要角色。它被激活在神经回路的形成和成熟调节轴突和arborisation产物
16 ,
17 ]。此外,几乎所有的基因列表中涉及神经系统发育过程中,神经发生等神经元分化,axonogenesis,轴突引导,神经生长,神经胶质细胞分化和迁移(表
1 )。的phosphoribosyl焦磷酸合成酶1 (PRPS1)和磷酸甘油酸酯变位酶1 (PGAM1)基因与代谢途径至关重要的神经功能和维护功能细节和引用表
1 )。
表1
选择ATSC-specific调节基因neurospecific函数(
P
<
0.01
)。
基因符号
基因库
基因名字
Neurospecific功能
过程
引用
保护
发展
营养作用
新陈代谢
SLC1A1
NM_004170.5
溶质载体家族,成员1
+
防止谷氨酸神经毒性
(
18 ]
CDH2
NM_001792.3
钙粘着蛋白2 1型N-cadherin(神经元)
+
Pre-to-postsynaptic粘附神经元迁移Axonogenesis突触的组装
(
19 ]
CELF2
NM_001025077.2
CUG三个一组重复,RNA结合蛋白2
+
+
在开发过程中运动神经元生存拼接控制
(
7 ]
VLDLR
NM_003383.3
极低密度脂蛋白受体
+
+
+
防止低氧和葡萄糖饥饿神经系统发育在神经元和星形胶质细胞脂质吸收
(
20. ]
NRP1
NM_003873
Neuropilin 1
+
+
+
轴突细胞生存指导迁移和入侵
(
15 ]
NGFB
NM_002506.2
神经生长因子β多肽
+
神经元分化神经生长
(
9 ]
ENC1
NM_003633.2
Ectodermal-neural皮层
+
+
抗凋亡神经系统发育
(
21 ]
GCH1
NM_000161.2
三磷酸鸟苷cyclohydrolase 1
+
+
保护大脑损害事件由星形胶质细胞分泌
(
14 ]
FGF2
NG_012449.1
纤维母细胞生长因子2
+
+
神经发生迁移
(
22 ]
NDN
NM_002487.2
Necdin同族体(鼠标)
+
+
保护神经元免受氧化应激神经元发展神经胶质细胞迁移
(
23 ]
PRPS1
NM_002764.3
Phosphoribosyl焦磷酸合成酶1
+
+
嘌呤合成神经系统的发展
(
24 ,
25 ]
PGAM1
NM_002629.2
磷酸甘油酸酯变位酶1(大脑)
+
+
针对Aß-toxicity能量代谢调节神经保护
(
26 ]
图1
微阵列数据的分层聚类。441个基因差异表达的系统树图显示所有电视(选中
t
以及,
P
值0.01)的统计分析(
3 ]。每一行代表一个单基因,在细胞类型分组列。根据显示的颜色的表示基因表达的规模在右边图。综合:从骨髓基质细胞;MRC5:人类肺纤维母细胞细胞系。参见[
3 详情)。
![]()
5.2。电视诱导神经突LAN5和PC12细胞产物
为了评价电视的神经营养特性的影响,诱导的能力可见神经细胞细胞形态学的变化首先是评估
在体外 。为此,LAN5细胞培养在ATSC-CM或cocultured与人类电视三天。细胞培养在ATSC-CM(图
2 (b) )和那些在coculture(数字
2 (c) - - - - - -
2 (d) )显示明显的形状和形态的变化,而那些生长在标准培养基(图
2(一个) )。的形成和伸长的形态变化由neurite-like过程离散轨迹的观察到培养板。神经突长大似乎建立接触神经细胞和电视文化(图
2 (d) )。
在体外 神经营养电视的影响。LAN-5人类成神经细胞和老鼠PC12细胞培养ATSC-conditioned介质或电视培养和形态随时间修改监控:(一)LAN5标准培养基;(b)在ATSC-CM LAN5培养72小时;(c)和(d) LAN-5电视使用细胞培养密度104 cell /厘米2 两个细胞群;(e) PC12标准培养基;在ATSC-CM (f) PC12培养4天;(g) PC12培养
β 神经生长因子100 ng / mL 4天;(h)在HDF-conditioned培养基培养PC12 4天。箭头显示的证据神经突产物;星号(*)表示电视文化。规模100酒吧
μ 米板除了面板
d
=
10
μ m。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
(e)
![]()
(f)
![]()
(g)
![]()
(h)
![]()
此外,肾上腺素的PC12细胞株培养在ATSC-conditioned介质的存在(ATSC-CM)四天。PC12满怀
β 神经生长因子和PC12培养HDF-CM作为积极和消极neuro-differentiation控制,分别。形态分析显示,丰富和扩展neurite-like结构的产物
β 神经生长因子和ATSC-CM-treated细胞表现出本质上重叠的特性(图
2 (f) - - - - - -
2 (g) ),而在标准培养基培养细胞(图
2 (e) )。细胞生长在HDF-CM明确的形态表现出痛苦,成为小圆并细胞,明显倾向于分离(图
2 (h) )。
5.3。体内<斜体> < /斜体> ATSC-Specific神经营养特性的分析
的功能意义ATSC-specific upregulation神经血统基因的进一步研究
在活的有机体内 移植后的电视新生儿老鼠大脑。电视和广告有效转导。eGFP之前
在活的有机体内 移植(图
3 )。
图3
高效的电视adenoviral-mediated转导。电视与100微升/细胞转染AdEGFP和荧光细胞48小时后观察:近80%细胞EGFP-positive如图。
![]()
组织学检查ATSC-transplanted年轻大鼠移植后7天牺牲了显示集群eGFP-positive电视,特点是圆形形态、本地化的墙侧脑室,针道附近包围GFAP阳性astroglial末梢(图
4(一) a - c)。特别是,基于观察的结果
在体外 ,我们评估anti-NGF——的表达
β 受体,进一步研究神经生长因子/ TRKA信号通路的重要性。电视展示immunopositivity TRKA抗体的移植后7天(图
4(一) D-F)。在这个时间点,没有co-localization神经元(Doublecortin NeuN) astroglial (GFAP),或oligodendroglial (O4)标记观察(没有显示)。
移植的人类刚出生的老鼠大脑内电视。(a)共焦显微镜显微图显示eGFP-positive移植(绿色;A, D)电视在新生大鼠大脑细胞移植后1周。电视展现出一个圆形形态(a、C),四周都是GFAP-positive星形胶质细胞(红色;B、D)和表达TRKA(红、B、D,箭头)。(b)移植
在活的有机体内 新生大鼠海马内分化的人类电视植入后2周。GFAP的共焦图像(红色;一)或TRKA(红色;D) immunolabeled eGFP(绿色;B, E)表达电视。道细胞GFAP表达星形标志(黄色,C)和TRKA受体(黄色,F)。规模酒吧:(a) a - C 120
μ m (a) D-F 420
μ 80米,(b)得了
μ m, (b) D-F 60
μ m。
(一)
![]()
(b)
![]()
移植后组织学检查的年轻老鼠牺牲15天确认电视的生存在大脑中注入动物。移植细胞在这个时间点检查主要是局部脑实质内,靠近脑室系统和经常在海马体。他们表现出双极或多极形态与流程在各个方向扩展。有趣的是,共焦显微镜检查发现,许多这些eGFP -积极的电视也coexpressed GFAP astroglial标志(图
4 (b) a - c),而没有colocalization eGFAP和Doublecortin NeuN或O4被发现(没有显示)。几乎所有的道电视表示immunopositivity anti-TRKA抗体(图
4 (b) D-F))。Sham-operated动物表现出只有轻微GFAP-stained胶质反应在针道(没有显示)。
6。讨论
不同的证据表明,移植msc促进内源性修复神经受损区域和神经分化,通过可溶性营养因子和细胞因子的释放
27 ]。
尤其值得一提的是,最近的研究表明,电视文化中应该包含神经营养因子,它能够诱导PC12细胞neuritogenesis
在体外 和保护大脑缺氧损伤和谷氨酸神经毒性(
28 - - - - - -
30. ]。尽管如此,只有选择分子一直在电视前尽可能神经营养候选人(
28 - - - - - -
31日 ),而更广泛的表达小组neuro-specific分子尚未评估在电视。
可能的神经营养和神经保护的完整列表所表达的因素特别是电视在这项研究中,提出了的结果
在网上 分析差异表达基因在MSC隔绝不同成人组织(
3 ]。这表明电视强烈和明确表达至少三个神经营养因子:NFGB NRP1, FGF2。这些分泌分子代表合理的分子背景ATSC-neurotrophic特性。的
在体外 分析在这项研究中,电视可能事实上诱导神经突生长证明不仅在PC12,而且在人类成神经细胞(LAN5细胞株)。诱导的神经元分化的结果应该证明电视培养基(可溶性分泌的因素
28 与神经细胞以及细胞间接触
在体外 。因此,此事件可以由两个NGFB合理,促进神经元分化(
9 ],NRP1,引导轴突生长
15 ]。也nonneurospecific生长因子FGF2在这一事件中发挥作用,能够促进神经发生(
22 ]。此外,粘附分子CDH2是在质膜上表达和参与axonogenesis和突触组装
19 )可以扮演一个角色在ATSC-mediated LAN-5神经元分化的细胞。尽管如此,其他因素参与调解的可能性不能排除这种影响。
我们的数据也表明,电视神经营养功能驻留在一种astrocyte-like表型,为他们专门表达基因属于胶质表型,包括VLDR FGF2,和NDN果阿注释。为此,necdin同族体(NDN)基因,参与NGFB信号通路,尤其相关,因为它使迁移在神经系统发育和神经胶质细胞中的表达预测(
23 ]。尽管msc的神经分化转化能力很大程度上争论,许多最近的研究强调的可能性骨髓和脂肪组织沿着neuroectodermal derived-undifferentiated基质细胞分化谱系neuronal-like细胞外胚层的血统,主要
在体外 (
32 - - - - - -
42 ]。
最近的数据确实评估和信息交互的重要性以及生长因子的释放从宿主组织电视神经分化转移(
43 ]。根据这些观察,获得的结果
体内, 新生儿在老鼠大脑的细胞植入后,表明电视生存,迁移,本质上区别astroglial命运。综上所述,我们的观察表明,电视显示倾向神经的命运,因为他们表达分子表型类似神经的承诺
在体外 和transdifferentiate神经血统
在活的有机体内 。
最近的报告证据电视的成功植入和迁移
在活的有机体内 使用老鼠大脑缺血的实验模型,他们能够促进功能恢复(
44 - - - - - -
47 ]。此外,不同组的神经分化转移报道电视移植在脊髓受伤的
48 ,
49 ),证明,当脱离生理利基,他们表达外胚层神经标记(
50 ]。我们可以推测,从邻近的细胞分泌的可溶性因子与神经细胞和身体相互接触可能导致/促进分化转化过程,以神经生长因子受体的表达还表示TRKA移植的电视。这个证据,报告
在体外 研究[
51 ),可以建议一个可能的电视自分泌机制,当他们表达NGFB
在体外 ,尽管这个观察的功能意义值得进一步研究。
综上所述,这一研究获得的结果似乎表明,电视神经营养功能存在于他们的特定的表达能力不仅分泌神经营养因子和神经保护分子,而且结构蛋白编码基因,模仿星形胶质细胞功能在维持神经元在中枢神经系统代谢和功能,能够分化为星形胶质细胞。这些属性,连同他们的报道能力迁移受伤的组织,可以显示电视的未来可能应用在许多不同的神经系统上下文。