AV 病毒学的进步 1687 - 8647 1687 - 8639 Hindawi 10.1155 / 2018/4835252 4835252 研究文章 准物种变化以独特的点突变的丙型肝炎病毒内部核糖体进入位点(IRES)源自PBMCs和等离子体 http://orcid.org/0000 - 0001 - 9076 - 5717 麦古利 卢卡 1 汤姆森 艾玛·C。 2 休斯 约瑟夫 2 Karayiannis 彼得 3 巴纳吉 Amiya K。 1 肝脏病学节 医学部门 医学院 帝国理工学院 伦敦 英国 imperial.ac.uk 2 格拉斯哥大学MRC病毒研究中心 格拉斯哥 英国 3 尼科西亚大学医学院 尼科西亚 塞浦路斯 unic.ac.cy 2018年 19 11 2018年 2018年 09年 09年 2018年 11 11 2018年 19 11 2018年 2018年 版权©2018卢卡·麦克利et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

5 '非翻译区(UTR)丙型肝炎病毒(HCV)基因组包含内部核糖体进入位点(IRES),一个高度保守的RNA结构必不可少的cap-independent病毒多蛋白的翻译。丙肝病毒,除了肝脏,被认为是与淋巴细胞亚群的外周血单核细胞(PBMCs),在淋巴结和脑组织。在这项研究中,rt - pcr、克隆和序列分析被调查的准物种性质5 'utr后提取病毒RNA PBMCs和等离子的丙肝病毒感染者。从PBMCs IRES-derived序列之间的核苷酸变异和等离子显示多态网站内IRES的存在。丙肝病毒分离株与独特的突变尤其是不同变体在107位置,204年和243年的忿怒。大多数PBMC-derived序列包含一个一百一十一的变体在这些位置。与ires建议相关的突变的存在独特的准物种种群PBMCs相比,等离子体。

 肝脏研究基金会 1。介绍

丙型肝炎病毒(HCV)的一员 Hepacivirus属的 黄家庭,是一个包裹和一个二十面体病毒衣壳,包含一个单链的积极意义基因组RNA的长度大约9.5 kb ( 1, 2]。病毒基因组包含一个大的开放阅读框(ORF)两侧高度保守的区域(UTR)出席5’和3’末端( 3]。5 'end UTR, 341元,包含一个内部核糖体进入网站(IRES),一个高度保守的区域与广泛的二级结构形成的回文序列互补形成四个结构域( 4]。IRES的结构和功能的研究表明,其结构是必需的调制cap-independent IRES-mediated翻译过程由最初招募细胞因子和核糖体亚基( 5]。丙肝病毒主要是hepatotropic,但其RNA与淋巴结,有关大脑组织和外周血单核细胞(PBMCs)特别是巨噬细胞,b细胞和t细胞(CD8 +) [ 6, 7]。丙肝病毒复制已发表在成纤维细胞,建立人类B细胞系(例如,Rajii和Daudi), t细胞(例如,Molt-4和Jurkat),和PBMC的亚种(CD4细胞+,CD8+,CD19+当患者感染丙肝病毒)( 8- - - - - - 11]。丙肝病毒RNA的存在肝外网站也被发现在丙肝病毒感染者丙肝病毒负链与PBMCs相关(复制的中间),CD4 +、CD8 +、CD19 +、t细胞,单核细胞和巨噬细胞 12]。近年来,该病毒已被证明的PBMCs坚持与Pegylated-IFN收到成功的抗病毒治疗的患者 α(Peg-IFN α)结合利巴韦林。在这样的病人,丙肝病毒RNA与PBMCs但没有出现在血清( 13- - - - - - 15]。

丙肝病毒RNA源自PBMCs、肝组织和慢性感染患者血清样本已被证明显示由于存在异质性突变5 'utr [ 16- - - - - - 18]。占主导地位的存在准物种限制数量的点突变,不同于肝脏和血清,和相同的核苷酸替换IRES地区如G107→, C204→a和G243→,俗称一一一变体中发现病人派生细胞之前检测到在细胞系如Daudi B淋巴母细胞和人类t细胞行( 19]。这种变体与淋巴细胞室有关感染( 17)包括monocyte-derived树突状细胞( 20.)、单核细胞/巨噬细胞( 12]和PBMCs [ 16]。IRES转化效率的研究表明,一一一变体翻译活动增加与野生型相比,淋巴细胞系G-C-G变异而不是细胞系来源于单核细胞、粒细胞、肝细胞( 21]。Raji IRES翻译活动大大增强,Bjab,和Molt4但不是Jurkat细胞,肝细胞(Huh-7)、单核细胞、粒细胞细胞系如HL-60,公斤,或者THP-1 [ 21]。一一一变体也被发现在大脑A204和A243突变从HCV RNA在小脑缺席serum-derived丙肝病毒RNA相同的病人认为中枢神经系统是一个候选人的肝外复制( 17, 22, 23]。这些研究提供了证据表明有核苷酸替换的HCV ires与淋巴复制。本研究的目的是分析丙肝病毒5 'utr序列的时序变化获得PBMCs和比较他们与那些获得等离子体在丙肝病毒感染的患者。丙肝病毒RNA提取,一(rt - pcr)、克隆、序列,和RNA结构分析是用来确定在PBMCs一一一变体的存在。

 2。材料和方法 2.1。患者样本

血样来自24例(男性,24 - 62岁)阳性anti-HCV通过rt - pcr和丙肝病毒RNA,曾异常肝功能测试以来的首次访问,表明急性感染丙肝病毒(之前消极的)。患者进入圣玛丽急性丙肝病毒群,入选标准(如前所述)( 25]。所有的患者合并感染乙型肝炎病毒(HBV)或有其他原因引起的肝脏疾病。大多数的患者感染HCV基因型1。

所有的工作覆盖病人知情同意后进行。此外,所有这些工作得到了圣玛丽医院伦理委员会的批准。

 2.2。RNA提取和rt - pcr

血样稀释与磷酸盐(PBS)(1:1),分层在聚蔗糖Histopaque 1077 (Sigma-Aldrich)和离心机在室温下400 g 30分钟。PBMC层就被撤掉了;这些细胞被洗两次与PBS和沉淀两次10分钟的100克。

病毒RNA是使用QIAmp从血浆中提取病毒RNA MiniKit(试剂盒)按照制造商的指示而总RNA提取PBMCs使用试剂盒®试剂(表达载体)。总RNA基因组DNA被撤的准备工作已经没有DNA通过涡轮细胞Dnase治疗(Ambion)。总RNA数量和质量评估在NanoDrop nd - 1000分光光度计和1%的琼脂糖凝胶进行分析,以检查尺寸和完整性。RNA reverse-transcribed成互补DNA(互补)42°C使用0.5 60分钟 μM IRES-specific反义引物(5 ' -GCACGGTCTACGAGACCT-3 ')和50 U Moloney小鼠白血病病毒的逆转录酶(MMLV RT) (RETROscript装备,Ambion) 20卷 μl在制造商的协议。丙肝病毒5 ' UTR放大进行了快速启动高保真PCR系统(罗氏)放大243 bp的片段的丙肝病毒5 'utr地区。引物是引物(5“-GCTTAGCCATGGCGTTAG-3”)和反义引物(5“-GCACGGTCTACGAGACCT-3”)。一个没有模板控制(NTC)和逆转录酶(NRT)作为控制-控制排除污染。

PCR条件如下:前置放大变性(一个周期),95°C 2分钟;放大(包括35周期)变性在95°C,持续30秒,30秒退火在56°C, 72°C伸长了40秒。最终伸长步骤(1周期)进行了7分钟的72°C。PCR产品2%琼脂糖凝胶上分离和可视化和纯化使用QIAquick凝胶萃取设备制造商的协议后(试剂盒)。

 2.3。克隆

纯化PCR产品被绑定到pGEM-T简单克隆载体(Promega)使用T4 DNA连接酶(3 u / μl)和转化为能力 大肠杆菌DH5 α细胞表达载体。管没有插入DNA作为消极的控制。重组殖民地被白色/蓝色选择使用5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galacto-pyranoside(半乳糖苷)(Promega)最后一个40毫克/毫升的浓度和质粒DNA提取使用GenElute质粒Miniprep工具包(σ)后,制造商的协议。15个克隆从每个15血浆样品(n = 225)和15个克隆从每个15 PBMC样本(n = 225)测序与ABI3730xl分析仪(MRC CSC基因组学核心实验室,伦敦,英国)。

 2.4。序列分析

序列比对和熵(Hx)计算进行使用BioEdit软件(版本7.1.3)和系统发育分析大型软件(版本5.1)使用木村出现模型使用从克隆获得的所有序列(PBMCs-derived n = 225, plasma-derived n = 225)。

大多数病人感染了丙肝病毒亚型1 438丙肝病毒的基因组序列1亚型分离获得的病毒生物信息学资源中心数据库和基因库与BioEdit软件使许多丙肝病毒亚型1序列以确定最常表示核苷酸序列,因此,每个位置获得最好的共识是用于PBMC的多个序列比对和plasma-derived IRES扩增子。此外, Δ G是计算在37°C使用特纳模型( 23, 26)的RNA参数RNAeval web服务器( http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAeval.cgi)。

 3所示。结果 3.1。序列变异PBMC和等离子体之间的隔离

的核苷酸差异225序列来自PBMC,所有的225序列来自血浆样品的RNA二级结构突出显示5 'utr丙肝病毒(nt。1 - 383基因型1 b(基因库,AJ238799.1)数据显示IRES核苷酸位置相对于应变丙肝病毒(基因库,NC_004102)(图 1)。二维结构的HCV基因型1 b 5 'utr被用作一个大纲在HCV ires核苷酸替换的位置检测,主要基因型1(图 1基因型1 b), HCV IRES与共识序列基因型1两IRES查明之间的任何差异。唯一的区别是替换11 u, 12 g, 13, 34 g, 35, 204和243年出现在基因型1(数据不包括)。

核苷酸差异中发现5 'utr序列来自病人PBMCs和等离子体。核苷酸的变化PBMC-derived IRES序列(n = 225)所示蓝色而核苷酸变化plasma-derived IRES序列(n = 225)用红色表示。PBMC和plasma-derived样本之间的相似之处核苷酸频率变化在绿点表示不同黄色圆点表示。结构域在罗马字母(I-IV)表示。起始密码子8月突出显示在茎环域IV。替换网站表示广场和箭头表示突变所描述的文本。核苷酸序列和假定的RNA二级结构的5 'utr (nt。1 - 383基因型1 b(基因库,AJ238799.1)]是改编自本田et al。 24]。

PBMC-derived IRES序列有更多的核苷酸替换网站比plasma-derived(27日和20)。核苷酸替换当前位置108,113,115,124,130,198,200,216,234,到255年,只有与PBMC-derived ires有关。另一方面,核苷酸替换A152, G185, A207只出现在plasma-derived ires。核苷酸替换位置107,119,179,183,187,204,205,210,214,220,223,224,243,247,248,262和270有关PBMC和plasma-derived ires(图 1)。

核苷酸频率识别了核苷酸位置核苷酸频率PBMC和plasma-derived HCV ires之间发生分歧。大多数IRES图案是守恒的PBMC和血浆样本之间相似的核苷酸频率得到沿着IRES序列。核苷酸位置179,183,187,205,210,220,223,224,234,247,248,262,270(图 1,用绿色突出显示)包含两个核苷酸频率变化共同在PBMC和plasma-derived样本。然而,职位107、119、124、152、200年,204年,207年,214年、216年和243年不同的核苷酸频率PBMC与plasma-derived样品(图 1,以黄色突出显示)。整体的大部分变化发生核苷酸位置179年至187年和200年到224年之间,偶尔从234年和270年。

 3.2。熵估计PBMC与等离子体序列

熵PBMC和plasma-derived ires之间的差异进行量化多样性在单核苷酸位置(图 2)。计算熵之间的差异PBMCs plasma-derived ires,熵数据集随机替换100倍和熵计算的差异这些随机集。这种差异与PBMC的区别和等离子体在实际设置为确定熵的差异高于您所期望的基于随机采样序列。正值表明,熵在PBMC高于在等离子体一个负值表明PBMC熵低于等离子体。根据随机熵的重大差异是与特定的核苷酸位置相关联。高熵在发现PBMCs核苷酸位置104,108,119,124,200,205,216,221,243,245和282年,在高熵等离子体(低PBMC),发现在核苷酸位置107,152,163,207,210,211,214,220,223,224年、262年和270年(图 2)。

熵PBMC和等离子体之间的区别。熵序列之间的差异(nt HCV IRES的100年到300年)源自PBMCs (n = 225)和血浆(n = 225)。每个酒吧代表熵的区别在一个单核苷酸位置。PBMC的熵和等离子体之间的显著差异是由橙色表示酒吧虽然没有显著差异是由蓝色表示酒吧。结果使用一个Perl脚本生成和R图制作软件的编程语言。

守恒的核苷酸序列被确定在PBMCs和plasma-derived IRES序列。两个守恒的区域被确定在PBMC-derived IRES序列(131 - ctcccgggagagccatagtggtctgcgga accggtgagtacaccggaa - 178和271 - gcgaaaggccttgtggtactgcctgatagg - 300)。plasma-derived IRES序列,五守恒的地区发现了(120 - ccccccctcccgggagagccatagtggtctgc - 151、153 - gaaccggtgagtacaccggaattgcc - 178, 188 - gggtcctttcttggat - 203, 225 - atttgggcgtgcccccgc - 242和271 - gcgaaaggccttgtggtactgcctgatagg - 300)。编号是基于1 b加入没有序列。AJ238799.1。

 3.3。准物种分布在患者

为了确定在隔间(PBMCs或等离子体)每个核苷酸的分布组合在107位置,204年和243年是变量,PBMC, plasma-derived样本在每个病人(图分析 3)。Plasma-derived样品有更多的人口变量的变化比PBMC-derived样品除了病人3和7,只有一个特定的变异存在于血浆样品。在每个病人,棉酚和插科打诨变异出现在等离子体——但不是PBMC-derived样本。

分布位置的核苷酸组合107、204和243年的PBMC, plasma-derived IRES样品在不同的患者。数据代表所有可能的核苷酸组合的频率的百分比在107位置,204年和243年PBMC, plasma-derived HCV IRES样本中发现不同的病人。

 3.4。系统发育分析的HCV IRES人口

PBMC的序列数据从所有克隆获得——和plasma-derived样本被用来构造一个拔起种系发生树(图 4),它显示包含相关血统PBMC, plasma-derived丙肝病毒株和一个独特的血统与孤立plasma-derived株(图 4(一))。一百一十一变异与PBMC和等离子体显示可能的选择(图 4 (b))。

系统发育树分析的PBMC, plasma-derived HCV IRES序列。进化史的推断是使用最大似然方法的基础上,木村出现的模型。最高的树日志可能性(-1129.7196)所示。初始树(s)启发式搜索得到Neighbor-Joining方法应用到一个矩阵的两两距离估计使用复合(制程)可能性最大的方法。树是按比例画,分支长度测量数量的替换/网站。分析涉及450个核苷酸序列。PBMC-derived HCV IRES核苷酸序列(n = 225;颜色蓝色)和plasma-derived HCV IRES核苷酸序列(n = 225;颜色在红色)与三腺嘌呤(a)。HCV ires变体(一一一)在PBMC (n = 36;蓝色三角形)和等离子体(n = 26; red triangles) (b). All positions containing gaps and missing data were eliminated. There were a total of 200 positions (nt 100 to 300) in the final dataset. The bootstrap values along the branches indicate percent confidence of branches. Bootstrap values greater than 70% are shown. The scale bar corresponds to 0.01 substitutions per site. Evolutionary analyses were conducted in MEGA6.

单点突变的影响热力学稳定的RNA在有关IRES域(图检查 5)。减少 Δ G表示相关域的稳定性的增加而增加 Δ G表示稳定下降。突变G200A、A204C A214U、U216C G243A没有对RNA二级结构的稳定性的影响。然而,突变A107G A108C IRES域二世和突变A152G C207A, U262C, U270C IRES第三域增加IRES的稳定结构。G200A和U216C只有在PBMCs发现而G152A和C207A plasma-derived ires(图 5)。

单点突变的效应相关的热力学稳定性IRES域。相关的热力学稳定域计算使用RNAeval程序与RNA和自由能参数 Δ G组37°C。蓝色细胞表明突变只发现在PBMC-derived ires红细胞表示只在plasma-derived ires突变检测。

 4所示。讨论

PBMC-derived样本有一个更高的突变数量域II相比plasma-derived样本(7和2突变),尤其是nt 107年和130年之间(图 1)。最近的研究表明,域II诱导40 s核糖体亚基的构象变化和可能拥有编码核糖体RNA的解码中心在翻译机器的装配 27, 28]。因此,它是可能的,核苷酸替换C108A单独或结合G107A域II中发现可能影响导致PBMCs翻译起始的初始步骤。只在PBMC-derived ires突变C108A,检测,可以帮助丙肝病毒可能减少HCV翻译和避免免疫检测。

序列变化在第三领域更为明显,尤其是在顶端部分,高于4路交界处(III a、b和c),和子域之间IIIc和IIId(图 1)。域的顶端部分三世与eIF3, 40 s核糖体亚基,一些交易因素( 29日),可能促进招聘IRES的核糖体。nt 175年到187年之间的序列多态性和nt 210年至224年也被发现在先前的研究 30.]。此外,接近40 s亚基的螺旋结IIIabc第三域的原因可能是替换的浓度在这个IRES地区,一个地区一个重要的角色在48的形成年代始发前复杂而在43 s亚基的招聘和eIF3 4]。茎环结构iii a和IIIc守恒PBMCs和plasma-derived ires之间,除了单一突变在茎环IIIc位置234只发现PBMC-derived样品(图 1)。

核苷酸的分布组合在107年职位,204年和243年在每个病人(图检查 3)表明,血浆样本更加多样化的人口比PBMC的变体。这些结果可能是由于减少暴露在PBMCs病毒的免疫系统,被动逃避其响应。因此,一一一变种似乎PBMCs的天然野生型可能显示一个优惠取向这些细胞和/或功能更全面的适应这些细胞的翻译。先前的研究表明,低和高翻译变体IRES地区序列变化可能是由免疫系统( 31日]。

PBMC变体的存在不是在等离子体中发现相同的病人,因此来自于他/她的肝脏,可能表明出处来自PBMCs复制或其他肝外网站或可能代表存储丙肝病毒RNA从过去的准物种不再出现在等离子体,或可能是由于病毒变异的选择或与PBMCs有关。

之间的显著差异根据随机熵PBMC, plasma-derived序列(图 2)表示高熵PBMCs (nt头寸104、108、119、124、200年,205年,216年,221年,243年,245年和282年)和高熵在等离子体(nt位置107,152,163,207,210,211,214,220,223,224,262和270年)。这些PBMC的熵之间的显著差异和等离子体显示核苷酸多样性在这些特定位置显示可能的选择和病毒多样性在每个位置。

显著差异,高熵值是位于域II PBMCs和只有右边的预测IRES域三世。另一方面,等离子体的高熵只关注职位107年IRES域二世和两边域三世,在特定的领域希望和域IIId参与eIF3a绑定和40 s核糖体亚基( 32]。这说明在这些区域选择性压力与IRES活动和熵的关系变化。关于nt头寸107、204和243年,熵高只有107年和243年在等离子体位置虽然没有显著差异发生在204位置(图 2)。

系统发育分析的PBMC, plasma-derived IRES序列(图 4)认为,总的来说,PBMC-derived ires是最不同的变异与分支长度和最长似乎起源于等离子体。另外,树建议PBMC, plasma-derived ires的非随机分布。系统发育树显示一一一变体可能改变和/或来自等离子体。然而,需要更多的数据来理解不同的系统发育多分枝的关系。

未来的分析化学和酶的探索将验证和解释RNA结构或造型的关键。总的来说,这项研究的结果表明,IRES受到更多的修改在PBMCs比在等离子体更多的突变只在PBMC-derived IRES被确定。是可能的,一些不同的突变与PBMCs和等离子体可能与病毒粒子释放的起源,这可能是肝脏或淋巴细胞,根据获得的突变可能在肝外网站允许病毒复制或抑制。这个假设也可以解释小变异与每个人口相关的克隆研究。之前的研究在b细胞表明丙肝病毒感染,慢性感染期间,b细胞和/或单核细胞经常怀有特定丙肝病毒变异( 33]。

两个守恒IRES地区有关plasma-derived IRES PBMC-derived IRES和5。这些地区位于核糖体结合位点之前报道( 34]。nt 271年到300年之间的守恒的地区是常见的在PBMC, plasma-derived ires作为绑定到这个地区是至关重要的40 s亚基( 35]。这个区域包含子域名IIId, HCV IRES的必不可少的组成部分,因为之前的研究表明,突变在域IIId中断IRES-mediated启动造成的结构性重组HCV IRES导致减少IRES活动( 32, 36]。PBMC-derived样品有更多的突变在域IIId plasma-derived IRES暗示可能减少IRES活动获得的突变域IIId PBMCs。

检测突变的影响的分析的热力学稳定IRES表示,一些突变IRES域II和III(图 5)增加或减少IRES的稳定性。单点突变只发现在plasma-derived IRES职位152年,207年和270年影响了预测IRES结构和热力学稳定性(图 5)。核苷酸替换C270U坐落在一个地区(277 - 295)是必不可少的绑定到40年代子单元( 35]。有可能是一个突变的效应对IRES稳定可能会抵消另一种变异的发生。例如A107G的影响和/或可能会抵消A108C G107A的影响和/或C108A一起或在组合(图 5)。IRES可能获得单点突变,因为C207A只发现在plasma-derived IRES减少IRES的热力学稳定性,从而可能降低等离子体或获得突变病毒翻译如G107A G152A和C207A增加IRES稳定并可能增加病毒的翻译。

热力学稳定值可能不预测RNA结合核糖体亚基的亲和力但可能IRES稳定可能影响丙肝病毒复制。因此,丙肝病毒可能收购突变降低IRES的热力学稳定性和控制它的复制而出现在immunoprivileged网站。这也许可以解释不同的丙肝患者疾病的结果。可能发现突变可能发生在病毒的生命周期在特定细胞环境条件和点突变的位置在IRES可能会扰乱IRES功能或降低转换效率见先前的研究[ 17, 21, 37]。此外,随着时间的推移获得突变的数量可能会增加导致长期的临床后果。

 5。结论

总之,这些研究结果表明,准物种动力学是一个机制,通过这个机制,丙肝病毒能够通过IRES适应宿主环境多样性,可能调节在不同的细胞转化活性和取向。相似之处的突变和地区确定在本研究可能的功能,结构,或进化IRES序列之间的关系,这可能影响细胞因子的绑定和相应减少或提高翻译效率。结果提高的可能性,这些菌株可能通过IRES的效率竞争,先前的研究显示等离子IRES更有能力比B细胞在肝细胞IRES指示extra-hepatic菌株选择性压力,因此,extra-hepatic复制( 38]。丙肝病毒变异可能选择性优势immunoprivileged网站和允许的持久性病毒在这些网站没有免疫检测之前建议( 20.]。这可以解释为什么核苷酸替换更经常发生在比plasma-derived PBMCs样本。

 数据可用性

DNA和RNA序列数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

 确认

这项研究是由肝脏研究基金和艾玛·汤姆森博士是一个受欢迎的接受者相信友谊。

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