AV 病毒学的进步 1687 - 8647 1687 - 8639 Hindawi 10.1155 / 2018/1973705 1973705 评论文章 其中,马赛克potexvirus:一些特性、属性和应用程序 Donchenko Ekaterina 1 http://orcid.org/0000 - 0002 - 0679 - 6818 Trifonova Ekaterina 1 http://orcid.org/0000 - 0001 - 9626 - 2336 尼基丁 尼古拉 1 http://orcid.org/0000 - 0003 - 3407 - 4051 Atabekov 约瑟夫 1 http://orcid.org/0000 - 0002 - 0605 - 9033 Karpova 奥尔加 1 需要好好 芬恩。 部门的病毒学 罗蒙诺索夫莫斯科国立大学 119234年莫斯科 俄罗斯 msu.ru 2018年 19 6 2018年 2018年 21 03 2018年 23 05年 2018年 19 6 2018年 2018年 版权©2018 Ekaterina Donchenko et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

其中,花叶病毒(AltMV)是一个典型的成员 Potexvirus属的形态和基因组结构;还是它展览许多独特的功能。他们允许这种病毒为生物技术被认为是一个有前途的对象。病毒和病毒样颗粒(一种)AltMV稳定在一个广泛的条件,包括实验动物的血清。AltMV一种可以组装在不同pH值和离子的优势。此外,AltMV病毒粒子和一种演示高免疫原性,增强目标抗原的免疫反应从而提供的可能性被用作潜在的佐剂。最近,为植物病毒第一次,我们显示形态相似的病毒和病毒样颗粒的结构区别AltMV病毒粒子和一种。在这次审查中,我们讨论AltMV病毒粒子的特性,AltMV车牌区域大会,和他们的结构和性能,以及AltMV隔离的特点,寄主植物,感染症状,AltMV隔离和净化、基因组结构、病毒蛋白,AltMV-based向量。

 俄罗斯科学基金会 14-24-00007 1。介绍

其中,花叶病毒(AltMV)在1999年首次描述为“孤立451/1”在昆士兰州,澳大利亚( 1]。新病毒被隔离 其中,pungens植物的家庭 苋科。AltMV属于属 Potexvirus和家庭 Alphaflexiviridae。AltMV基因组是一种积极意义单链RNA长6604 - 6607元根据隔离。AltMV病毒粒子表示与螺旋对称灵活的丝状颗粒组成的一种类型的外壳蛋白(CP)的子单元。AltMV病毒粒子的平均长度等于554海里( 1),536海里( 2),或570海里 3]。据Mukhamedzhanova 等。( 3),病毒粒子直径13海里。最近AltMV病毒粒子直径修正至13.5 nm的冷冻电子显微镜( 4]。

由于植物病毒和病毒样颗粒(一种)本质上是安全的人类他们看起来有前途的技术进步在广泛的领域从微电子发展候选疫苗和佐剂 5, 6]。AltMV病毒粒子和一种有相当数量的优势成功应用在生物技术( 4, 7- - - - - - 9]。

 2。AltMV隔离及其分布

在澳大利亚发现了AltMV后不久,其他隔离来自植物在欧洲( 10, 11),美国( 2, 12- - - - - - 16)、巴西( 17)和亚洲( 18]。据报道如今AltMV遍布世界,并能够感染植物的各种家庭包括观赏植物和作物( 1, 19]。迄今为止,完整的核苷酸序列确定下列AltMV隔离:AltMV-Ас(6604元),AltMV-MU(6606元),和AltMV-PA(6607元)。4生物活性cDNA“感染性克隆”(3 - 1、3 - 7、4 - 1、4 - 7)来自AltMV-SP基因组;建立了完整的核苷酸序列的克隆(6607元)。其它分离株的核苷酸序列只有部分确定( 2, 14, 20.]。

分离获得的多样性方面宿主植物的毒性和地理分布的目标意味着系统的存在中分化组AltMV分类单元( 11, 20.]。基于依赖RNA的RNA聚合酶的氨基酸序列(RdRp复制酶)和CP,伊万诺夫 等。( 11)杰出的两组内AltMV物种:phlox-like隔离和portulaca-like隔离。在这项研究中,哈蒙德和Reinsel [ 20.这种区分是通过氨基酸序列分析证实产品的三种蛋白质的“三重基因块”(板)。显然,亚洲AltMV隔离应被视为一个单独的组( 18]。

AltMV-IT、AltMV-MU AltMV-Port、AltMV-Po AltMV-CIN和AltMV-PLR(表 1)被列为portulaca-like隔离( 20.]。伊万诺夫 等。( 11]表示亲密之间的进化关系的隔离组。AltMV-IT的氨基酸序列,AltMV-MU AltMV-Po CPs在替换两个站点不同,蛋氨酸106异亮氨酸为苯丙氨酸和丝氨酸185 ( 11]。AltMV-Au、AltMV-PA AltMV-NAN, AltMV-SP列为phlox-like隔离。属于不同的群体,CPs AltMV-MU和AltMV-PA是不同的12个氨基酸残基主要坐落在CP的n端( 11]。核苷酸序列确定AltMV分离获得 黄芩叶( 12), Torenia( 17), Angelonia angustifolia( 15),而 Thunbergia laurifolia植物( 21详细分析)太短,然而最有可能他们属于portulaca-like类型( 20.]。

AltMV隔离。

病毒分离 加入不。 作者 原始主机 受感染的植物的起源
Phlox-like隔离
AltMV-AU AF080448 吉尔和托马斯,1999年 其中,pungens 澳大利亚昆士兰
AltMV-РА AY863024 哈蒙德 et al。、2004、2006 a, b 夹竹桃多茎目 美国宾夕法尼亚州
AltMV-SP AY850931 哈蒙德 et al。、2004、2006 a, b 夹竹桃多茎目简历。舍伍德紫色 美国,马里兰州
AltMV-BR AY850928 哈蒙德 et al。、2004、2006 a, b 夹竹桃多茎目简历。蓝脊 美国,马里兰州
AltMV-NAN GU126686 唐 et al。,2010年 南天竹属有 美国,好
AltMV-BW JX457329 哈蒙德和Reinsel, 2015年 夹竹桃多茎目简历。布鲁斯的白色 美国,马里兰州
AltMV-LGB JX457330 哈蒙德和Reinsel, 2015年 夹竹桃衣属鸦葱简历。伦敦格罗夫蓝色 美国,马里兰州
AltMV-PGL JQ405265 哈蒙德和Reinsel, 2015年 夹竹桃卡angusta 美国
Portulaca-like隔离
AltMV-IT AY566288 Ciuffo Turina, 2004 马齿苋属的植物大花蔷薇 意大利利古利亚,Albenga
AltMV-Po AY850930 哈蒙德 et al。、2004、2006 a, b 马齿苋属的植物大花蔷薇 美国,马里兰州
AltMV-MU FJ822136 伊万诺夫 et al。,2011年 马齿苋属的植物大花蔷薇 欧洲东南部
AltMV-Port JQ405269 哈蒙德和Reinsel, 2015年 马齿苋属的植物大花蔷薇 美国
AltMV-PLR JQ405266 哈蒙德和Reinsel, 2015年 夹竹桃混合(年度) 美国
AltMV-CIN JQ405268 哈蒙德和Reinsel, 2015年 Pericallis混合动力 美国
亚洲隔离
AltMV-Ас LC107515 逐渐繁盛 等,2016 牛膝bidentata 日本,东京
未赋值的隔离
AltMV佛罗里达隔离 DQ393785 贝克 et al .,2006年 马齿苋属的植物sp。 黄芩叶 Crossandra infundibuliformis 美国、FL
AltMV-Т FJ232066, FJ232067 杜阿尔特 et al .,2008年 Toreniasp。 巴西,圣保罗
AltMV angelonia隔离 EU679363 洛克哈特和Daughtrey, 2008 Angelonia angustifolia 美国,纽约
AltMV隔离g10 - 00982 JQ687034 Vitoreli et al。,2011年 Thunbergia laurifolia 美国、FL

隔离的报道分布可能是由寄主植物栽培的特点决定的。年度夹竹桃、瓜叶菊、angelonia、torenia thunbergia,和马齿苋属的植物大多生长在温室作为观赏植物,而常年夹竹桃和南天竹属植物繁殖栽培在开阔地。类似条件的植物栽培最有可能占portulaca-like AltMV检测温室植物;此外,马齿苋属的植物可能成为感染源为这种类型的园艺。同样,传播phlox-like AltMV获得从植物种植在开阔地是交叉污染的结果从受感染的植物常年夹竹桃 20.]。

根据血清学数据以及核苷酸和氨基酸序列相似性,AltMV的最近的亲戚 木瓜花叶病毒(PapMV) [ 1, 2, 20.]。AltMV很容易混淆PapMV血清学分析或PCR分析基础上的一个不正确的引物选择( 2]导致AltMV被误解为PapMV [ 12, 22]。哈蒙德 等。( 2)认为AltMV远比预期的更广泛,尤其是在幼儿园和温室。

 3所示。AltMV宿主植物和感染症状

AltMV具有广泛的宿主范围,可以从至少31感染植物分类学包括家庭 Aizoaceae、苋科、伞形科、菊科、十字花科石竹科、藜科、葫芦科、蝶形花科、车前草科,花荵科,和 茄科( 19]。在几个观赏物种包括病毒检测 马齿苋属的植物大花蔷薇、夹竹桃多茎目、黄芩spp。 Crossandra infundibuliformis, Angelonia angustifolia Toreniaspp。 蜡菊spp。 一串红,和 Zinnia线虫( 2, 12, 15, 17]。除了观赏植物,系统性感染植物被发现在各种园艺植物包括 茄属植物lycopersicum,蚕豆根尖、向日葵、Citrullus lanatus, Cucumis巨大成功,和 豇豆属unguiculata( 1]。受感染的植物大多是来自商业托儿所( 2, 10, 12, 15, 17, 18, 21]。

在感染AltMV所有的代表 苋科家庭包括 其中,pungens表现出症状( 1]。相反,植物的家庭 苏木科, 番木瓜科, 禾本科不容易感染AltMV。是木瓜 番木瓜是PapMV的主要宿主,其无感受性AltMV证实,这些病毒属于不同的种类 1]。

AltMV已知清单范围广泛的症状包括萎黄病的发现各种大小、萎黄病,萎黄病的局部病变,叶扭曲和卷曲,马赛克,斑点,各种大小的坏死斑点,坏死环斑,皱纹,矿脉的坏死,中毒的泛黄的(表 2)[ 1, 2, 12, 15, 17]。

AltMV宿主植物的多样性和感染症状。

家庭 主机 症状 作者
当地的 系统性
Aizoaceae Tetragonia expansa 坏死环斑 萎黄病,矿脉的坏死,叶片卷曲 哈蒙德 et al .,2006 b
苋科 苋属caudatus 坏死局部病变 没有感染 哈蒙德 et al .,2006 b
雁来红三色 萎黄病的局部病变 马赛克 吉尔和托马斯,1999年
Gomphrena celosiodes 无症状感染 马赛克
Gomphrena globosa 坏死局部病变 无症状感染 吉尔和托马斯,1999;哈蒙德 et al .,2006 b
其中,dentata 坏死局部病变 坏死斑点,扭曲 哈蒙德 等人,2006 b
伞形科 芹菜graveolens,简历。新鲜的沙拉 坏死局部病变 马赛克 吉尔和托马斯,1999年
菊科 Aster novi-belgii 没有感染 没有感染 哈蒙德 et al .,2006 b
大丽花摘要 没有感染 没有感染
向日葵 无症状感染 没有感染
Sanvitalia procumbens 没有感染 马赛克,叶卷、扭曲
以,简历。黑色天鹅绒 坏死局部病变 没有感染 吉尔和托马斯,1999年
Zinnia线虫 无症状感染 斑点/无症状感染 吉尔和托马斯,1999 /哈蒙德 et al .,2006 b
十字花科 芸苔属植物定var。 学报简历。林白勺 无症状感染 没有感染 吉尔和托马斯,1999年
Rhaphanus巨大成功简历。法国早餐 没有感染 没有感染
苏木科 桂皮多花植物 没有感染 没有感染 吉尔和托马斯,1999年
草决明 没有感染 没有感染
番木瓜科 番木瓜简历。里希特金 没有感染 没有感染 吉尔和托马斯,1999年
石竹科 满天星被 无症状感染 没有感染 哈蒙德 et al .,2006 b
藜科 土荆芥amaranticolor 萎黄病的局部病变 马赛克 吉尔和托马斯,1999年
藜藜麦 萎黄病的局部病变/坏死局部病变 中毒的泛黄/不感染 吉尔和托马斯,1999 /哈蒙德 et al .,2006 b
菠菜oleracea 萎黄病的局部病变/不感染 马赛克/坏死斑点,叶片卷曲
葫芦科 Citrullus lanatusvar。 caf简历。糖果红 无症状感染 马赛克 吉尔和托马斯,1999年
Cucumis巨大成功简历。绿色的宝石 无症状感染 无症状感染
Cucumis巨大成功(两个品种) 没有感染 没有感染 哈蒙德 et al .,2006 b
Cucurbita浆果简历。绿色的按钮 无症状感染 没有感染 吉尔和托马斯,1999年
蝶形花科 大豆简历。布喇格 没有感染 没有感染 吉尔和托马斯,1999年
菜豆简历。丰富的 没有感染 没有感染 吉尔和托马斯,1999 /哈蒙德 et al .,2006 b
菜豆简历科曼地毯 没有感染 没有感染
Pisum一简历。Greenfeast 没有感染 没有感染
三叶草pratense简历。蒙哥马利 无症状感染 没有感染 吉尔和托马斯,1999年
豇豆属unguiculata简历。某省生产 无症状感染/不感染 无症状感染/不感染 吉尔和托马斯,1999 /哈蒙德 et al .,2006 b
蚕豆根尖 无症状感染/不感染 马赛克/萎黄病的斑点
罂粟科 东方罂粟花 没有感染 没有感染 哈蒙德 et al .,2006 b
车前草科 Plantago生长状况 无症状感染 马赛克 吉尔和托马斯,1999年
禾本科 高粱halapense简历。丝绸 没有感染 没有感染 吉尔和托马斯,1999年
玉米简历。禧年 没有感染 没有感染
花荵科 夹竹桃drummondii 没有感染 轻微的斑点 哈蒙德 et al .,2006 b
夹竹桃多茎目 斑点 斑点
茄科 甜椒简历。Yolo不知道意思 没有感染 没有感染 吉尔和托马斯,1999 /哈蒙德 et al .,2006 b
曼佗罗 没有感染 没有感染 吉尔和托马斯,1999年
茄属植物lycopersicum简历。Lisse总值 无症状感染/不感染 斑点/轻微的斑点,叶片卷曲 吉尔和托马斯,1999 /哈蒙德 et al .,2006 b
烟草benthamiana 无症状感染/萎黄病的局部病变 马赛克,满是皱纹,偏上性
烟草clevelandii 没有感染 没有感染/轻度萎黄病
烟草edwardsonii 没有感染 没有感染 哈蒙德 et al .,2006 b
烟草需 没有感染 没有感染 吉尔和托马斯,1999 /哈蒙德 et al .,2006 b
烟草megalosiphon 当地病变坏死,坏死环斑 马赛克,坏死斑点 哈蒙德 et al .,2006 b
黄花烟草 没有感染 没有感染
烟草简历。土耳其 没有感染 没有感染 吉尔和托马斯,1999 /哈蒙德 et al .,2006 b
烟草简历。萨丁 没有感染 没有感染
酸浆属floridana 没有感染 没有感染 吉尔和托马斯,1999年
茄属植物melongena 没有感染 微弱的萎黄病的发现,皱纹 哈蒙德 et al .,2006 b
茄属植物tuberosum简历。Sebago 没有感染 没有感染 吉尔和托马斯,1999年

AltMV感染症状被证明不仅依赖于寄主植物物种,而且持续时间的感染,病毒株,和环境因素。例如,症状主要是明显在植物种植高亮度水平和中等温度下逃脱了注意,在植物生长在低光照水平下和高温( 2]。对于AltMV-SP隔离来自烟草 烟草benthamiana症状严重程度被证明与序列差异的复制酶基因(RdRp)和三块蛋白1 (TGBp1) [ 23]。同样,在AltMV-Po隔离的情况下,症状的严重程度表现了去与CP[氨基酸序列的变化 24]。

AltMV感染宿主范围很广的能力导致无症状的感染允许不同物种之间的交叉污染包括栽培的。考虑到上述,AltMV可能比文学更广泛的建议,尤其是在托儿所( 12, 20.]。

 4所示。AltMV传播和净化

几种方法开发了AltMV隔离从不同的寄主植物(表 3)。吉尔和托马斯 1跟着班克罗夫特描述的过程之前 等。( 25]。这项技术受雇于哈蒙德 等。( 2]最初引入potyviruses potexviruses后来改编。在研究Mukhamedzhanova 等。( 3)和伊万诺夫 等。( 11]AltMV孤立根据协议开发potexvirus,即 马铃薯X病毒(PVX),轻微的修改。这种技术被Donchenko进一步大幅修改 等。( 4]。

比较AltMV隔离程序。

分离和纯化步骤 作者
吉尔和托马斯,1999年 哈蒙德 et al。2006 b Mukhamedzhanova 等,2011;伊万诺夫 et al .,2011年 Donchenko et al .,2017年
收益率(毫克病毒/ 100 g(绿色植物)和宿主植物使用 23.4 / 土荆芥amaranticolor/ 8.6 - -12.4 / 烟草benthamiana/ 3.4 / 马齿苋属的植物大花蔷薇/ 20.0 / 马齿苋属的植物大花蔷薇/57.3 / 烟草benthamiana/
均化缓冲 0.02М硼酸钠缓冲,0.5%的钠2所以3,рН8.2(每150克250毫升缓冲区的叶子) 0.5 K2H / KH2P04,0.5%的钠2所以3,рH 8.4(3 - 5个叶子的缓冲体积/重量) 0.3Мglycine-КОН,1%的钠2所以3,рН7.5(3毫升缓冲/ 1 g的叶子) 0.3Мglycine-КОН,1%的钠2所以3,рН7.5(3毫升缓冲/ 1 g的叶子)
从植物组织病毒浓缩 离心分离特里同x - 100年的0.5% 离心分离特里同x - 100, 2%4%挂钩 М r 8000年,2%氯化钠 离心分离特里同x - 100年的1%5%挂钩 М r 6000年,2%氯化钠(个人沟通) 离心分离特里同x - 100年的1%降水的两个阶段:(1)5%的挂钩 М r 6000年,2%氯化钠(2)8%的挂钩 М r 6000年
提取的病毒颗粒 - - - - - - 在0.1М提取硼酸钠缓冲,0.1М氯化钾,рН8.0 (BK缓冲区),0.75 - -1.5小时。 提取Tris-HCl在0.05米,0.01 EDTA,pH值8.0,(个人沟通) 提取在0.05МTris-HCl,0.01МEDTA,рН8.0,两个阶段2 - 6小时。
超速离心法步骤 (1)分离的10 - 40%蔗糖梯度(0.01МTris-HCl, 0.001МEDTA,рН8.0)(85 000克,4小时)(2)病毒降水(85 000克,2.5小时) (1)分离30%蔗糖垫(BK缓冲)(85 600克,2.5小时)(2)由中海梯度分离,密度1.32克/厘米3(139 000克,16 - 20小时)(3)透析对0.5хBK缓冲区1 l(3)变化 (1)病毒降水(100 000克,1.5小时)(个人沟通)(2)分离30%蔗糖垫(110 000克,2.5小时)(个人沟通) (1)病毒降水(111 000 g, 3小时)(2)分离30%蔗糖垫(提取缓冲)(111 000克,4小时)
光谱分析( E 1 c 米 ,0.1 % 260年 n 米 ) 2.84 2.5 2.84 2.84

吉尔和托马斯 1)使用 土荆芥amaranticolor作为一个寄主植物传播AltMV导致收益率每100克23.4毫克的病毒感染。尽管收益率相对较高,寄主植物不能为AltMV积累被认为是最佳的。哈蒙德 等。( 2设法隔离AltMV 烟草benthamiana与病毒的产量8.6 - -12.5毫克/ 100克Mukhamedzhanova时绿色生物量 等。( 3)和伊万诺夫 等。( 11)使用 马齿苋属的植物大花蔷薇作为主机的每100克3.4毫克的病毒感染。自 p .开大花的和其他病毒和不容易感染吗 n benthamiana是一种常用的模式植物,在研究Donchenko吗 et al。( 4]马齿苋和烟草植物被选为主持人 26]。为了获得纯化AltMV、传染性材料第一次被传播 p .开大花的为了防止合并感染,后来传播和积累 n benthamiana。这使得产量大大增加了20.0毫克,每100克57.3毫克病毒感染的叶子 p .开大花的和 n benthamiana分别为( 4]。

 5。AltMV基因组的结构

AltMV基因组包含一个唯一的积极意义单链RNA有一顶帽子在5 '末端和聚(序列3 '末端( 1]。AltMV-PA基因组核苷酸序列分析( 2)显示两个未翻译区(UTR) 5”(1 - 94元)和3 '末端分别(6481 - 6607元),以及5个开放阅读框(ORF)。第一个ORF遇到5 '末端的基因组是最长(95 - 4720元),能够编码1540个氨基酸(aa)长蛋白质,即病毒复制酶(RdRp)。大概接下来的三个orf编码的三个运动蛋白质被称为三重基因块蛋白质:ORF2(4704 - 5402元,编码一个26 232 kDa aa长蛋白质);ORF3(5356 - 5688元,编码一个110 kDa aa长蛋白质);和ORF4(5624 - 5815元,编码一个63 kDa aa长蛋白质)。极端的3′末端的基因组包含ORF5(5858 - 6481元)。翻译的ORF5产生一个月22 - 23日kDa CP 207 aa残留长多肽。此外,一个相对短ORF6被确认在所有的目前已知ORF5 AltMV隔离( 2, 11]。一个序列搜索Uniprot数据库编码的蛋白质未能揭示任何重要的相似之处ORF6任何已知的多肽。目前没有证据表明ORF6翻译 在活的有机体内( 2, 11]。

UTR AltMV基因组位于附近的ORF5 3′末端终止密码子。这129元长AltMV中高度保守的基因组区域隔离和核苷酸的同源性达到98%的程度。这可能是与复制酶识别网站的定位在这个地区( 20.]。然而,二级结构和功能的3 ' UTR AltMV基因组尚未确定。同样也适用于5 ' UTR以及假定的监管AltMV基因组的元素。此外,守恒的元素的存在,即octanucleotide hexanucleotide图案,表明其功能在AltMV基因组可能类似于PVX [ 2, 27]。值得注意的是,没有守恒聚腺苷酸化信号相似 竹花叶病毒和PVX中检测出的3′UTR AltMV [ 28]。

 6。< /斜体> <斜体>其中花叶病毒的向量

估计的相关症状的严重程度和效率与各种突变细胞间运动TGBp1和AltMV Lim复制酶序列 等。( 29日)构建了一个基于AltMV基因组的病毒载体。向量进一步应用于轮廓的功能AltMV TGBp3 [ 23)通过蛋白质域和GFP荧光记者。都使用同一个向量设计工作与记者之间的基因序列被插入TGBp3和CP基因的控制下的额外subgenomic (sg)启动子AltMV CP [ 29日]。

由两部分构成的向量也来自AltMV-SP。第一个片段包含AltMV复制酶基因,第二个由板和AltMV CP基因。为了促进克隆,建设分为两个部分:后植物组织转型与AltMV完整的基因组片段是通过重组产生的。第二部分系统获得了两个版本的向量。向量是专为目标蛋白表达在植物和病毒诱导基因沉默(中收取) 23, 29日]。使用AltMV中收取向量抑制内源性蛋白质的4/1 n benthamiana表达和运动在4/1-silenced马铃纺锤块茎类病毒的影响植物被证明( 30., 31日]。向量AltMV-L-att和AltMV-P-att是由网关克隆磁带插入AltMV多个克隆站点(三重基因之间的块和CP基因)对蛋白质表达和中收取的应用,分别是( 32]。

解构的几个变种病毒AltMV-MU基于向量使外源蛋白表达在植物。板从AltMV基因组中删除,而目标基因的控制下被AltMV额外的sg子1 (AltMV-single向量)或者连续两个病毒启动子1和sg sg启动3 (AltMV-double向量)以前在Lim描述 等。( 23]。与AltMV-single相比,AltMV-double证明产生更高的目标蛋白产量由于同时运作两个sg的推动者。AltMV CP和人类粒细胞集落刺激因子表示为模型蛋白在最近的研究( 8]。虽然是尝试增加蛋白质积累水平通过使用三个sg同时启动子,这种方法未能成功( 33]。

 7所示。AltMV蛋白质 7.1。AltMV依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)

两个预测域(解旋酶和聚合酶的)中确定AltMV RdRp爆炸氨基酸序列的算法( 2]。之前解旋酶域甲基转移酶和2-oxoglutarate-Fe (II)加氧酶域位于( 19]。四个变异感染性克隆来自AltMV-SP基因组在感染引起各种症状 n benthamiana植物和与对方在几个不同的氨基酸替换在病毒蛋白包括RdRp [ 23]。克隆被称为3 - 1、3 - 7 4 - 1、4 - 7。没有一个诱导AltMV-SP隔离的感染症状类似。植物感染和两个克隆(3 - 7和4 - 7)导致坏死和最终的死亡,而在案例相结合的四个温和的症状了。复制率增加至少4 * 15°С所有的克隆。植物接种的混合4 - 7(“严重”)和3 - 1(温和的)隔离类似于那些由AltMV-SP出现症状,而克隆率是不同的在25岁和15°С。克隆引起严重症状和坏死率高(3 - 7、4 - 7)不同于那些造成轻微感染一些替换的复制酶氨基酸序列。因此,严重的症状和坏死率较高的特点P1110 / R1121 K1255复制酶变异和温和的症状,R1110 / K1121 / R1255变体。值得注意的是,上述氨基酸替换都位于蛋白质的聚合酶域( 23]。

的AltMV RdRp由1540 aa仅仅68不同的隔离 20.]。虽然之间的差异由45个氨基酸替换RdRp感染性克隆3 - 1和4 - 7占重要改变复制效率( 7, 29日),只有轻微区别夹竹桃和马齿苋隔离检测通过系统发育树分析( 20.]。

 7.2。AltMV TGBp1

氨基酸序列的执行爆炸分析AltMV TGBp1预测氨基端解旋酶的存在域( 2]。

类似于AltMV复制酶,TGBp1 AltMV-SP各种克隆体现差异的氨基酸序列。克隆有亮氨酸残基的一部分(TGBp1L88),另一部分脯氨酸残基在88位置(TGBp1P88) [ 29日]。仅仅TGBp1L88能够有效地抑制转录后的基因沉默在植物。进一步调查这一现象显示,病毒变异表达TGBp1P88复制率比较低表达TGBp1L88变体。同时,TGBp1变异都是能够支持细胞间运动虽然以不同的速率与TGBp1P88减慢感染的传播。值得注意的是,同时表达两个TGBp1变异的植物细胞减少蛋白质的antisilencing活动这意味着两个变量之间的相互作用( 29日]。这种交互确认使用酵母2台混合动力系统。亚细胞定位的TGBp1变体通过激光扫描共焦显微镜 n benthamiana叶子表明TGBp1L88本地化在核膜和核仁形成离散聚合,虽然TGBp1P88本地化在核周质 23]。外核TGBp1L88证明驻留在细胞壁小点状的总量,这表明其与胞间连丝的协会。相反,TGBp1P88是广泛分布于细胞质中。解旋酶域我以来PVX TGBp1要求之前已经报道过了 在体外齐聚反应( 34, 35),氨基酸序列对齐的AltMV TGBp1和PVX TGBp1在搜索进行AltMV TGBp1寡聚化网站。因此,7保守序列主题被确定的解旋酶域AltMV TGBp1。域的突变体替换G31R和GK33/34RR我TGBp1无法二聚的酵母2台混合动力系统。中断的相互作用也被观察到 在活的有机体内在 n benthamiana植物通过双分子荧光互补。这种蛋白质域的至关重要的作用我认为二聚作用。第二和第三领域而言,没有突变改变了二聚过程。的寡聚化AltMV TGBp1分子对沉默抑制[至关重要 36]。可视化的亚细胞定位AltMV TGBp1变异方面的功能和缺陷寡聚化透露以下模式:AltMV TGBp1变异能够齐聚在核仁或本地化的细胞壁,而突变体的占据了核仁,核浆而不是没有发现附近的细胞壁( 36]。这些数据表明,TGBp1齐聚反应中扮演着重要角色在细胞间运动和沉默抑制。

AltMV TGBp1能够选择性地绑定到几个细胞蛋白( 37),即线粒体ATP合酶δ亚基链,聚光chlorophyll-protein复杂我亚基A4,叶绿素a / b结合蛋白,叶绿体IscA-like蛋白质,和叶绿体 β腺苷三磷酸酶。后者被证明特别只绑定到AltMV TGBp1L88变种有效沉默抑制因子。与此同时,叶绿体之间没有相互作用 β腺苷三磷酸酶和TGBp1P88被检测到。自从病毒诱导蛋白表达的抑制诱发严重的症状在寄主植物, βatp酶被认为是参与寄主植物免疫反应。因此,之间的交互 β腺苷三磷酸酶和TGBp1P88似乎抑制这一过程 37]。

类似于PVX TGBp1, TGBp1 AltMV能够接触的一端病毒粒子从而激活RNA翻译 在体外( 3, 38]。

 7.3。AltMV TGBp2

到目前为止,对AltMV TGBp2除了跨膜结构域被爆炸氨基酸序列分析( 2]。尽管序列相似性高只有110个氨基酸残基的不同分离株中,portulaca-like AltMV-Po和AltMV-IT组成一个进化枝分明从五夹竹桃隔离,引导价值的100% 20.]。

 7.4。AltMV TGBp3

的三维结构AltMV TGBp3仍然悬而未决,没有透露具体领域的爆炸搜索( 2]。到目前为止,两篇论文已经解决这个问题 29日, 39),并演示了AltMV TGBp3大不相同的同源PVX通过亚细胞定位以及组织模式之一。在感病叶片荧光标记TGBp3是主要局限于叶肉细胞的叶绿体外膜。有趣的是,TGBp3过度诱导叶绿体膜囊泡形成和矿脉的坏死,导致了整体症状严重程度。删除分析表明两个氨基酸残基(17 v18l) TGBp3作为独特的信号AltMV TGBp3定位在叶绿体膜( 29日]。此外,TGBp3能够直接与光系统II的PsbO蛋白质交互oxygen-evolving复杂( 39]。这种交互是由氨基端TGBp3从16到残留的20。所需的信号序列AltMV TGBp3叶绿体表面目标也是局部在这个地区( 29日]。这可能提供确凿的证据AltMV TGBp3针对叶绿体膜通过PsbO互动,在它将被运送到叶绿体从细胞质中合成的地方( 39]。因此,PsbO之间的交互的效率和AltMV TRGp3与矿脉的坏死等症状的严重程度和叶绿体膜囊泡形成。以防受损TGBp3表达病毒失去了进入叶肉细胞的能力,因此导致全身感染,而在这一过程中突显了TGBp3的至关重要的作用。因此,缺陷病毒传播能力相对有限内表皮没有系统性的运动( 29日]。可视化的亚细胞定位AltMV RNA通过荧光 原位杂交表明病毒RNA以及TGBp3主要积累在叶绿体膜的表面。同时,主要的RNA检测在叶肉细胞( 29日]。这个驱动器的结论AltMV复制大多出现在叶肉细胞,更具体地说,在叶绿体外膜。有趣的是,细胞TGBp2展出的存在不影响AltMV TGBp3亚细胞定位与PVX TGBp3 [ 29日, 40]。

 7.5。AltMV CP

AltMV外壳蛋白(CP)是一个22-23-kDa蛋白质组成207 aa。一起AltMV复制酶和TGBp1 AltMV CP确定症状严重程度在寄主植物( 24]。

AltMV和PVX病毒粒子被发现是平移激活。AltMV基因组RNA通常是使壳体化和完全nontranslatable 在体外;然而,翻译可以通过AltMV CP的磷酸化激活蛋白激酶C或TGBp1绑定病毒粒子( 3]。

AltMV CP显示组装成稳定的聚合物通常被称为一种扩展 在体外在不同的条件下。类似于PapMV CP [ 41]AltMV CP形成的一种扩展 在体外没有4.0рНRNA和低离子强度( 3]。然而,PapMV CP是无法形成RNA-free种pH值8.0,而AltMV CP形成粒子形态类似本地病毒粒子在相同条件下( 3]。相比PapMV种,AltMV被证明是高度稳定的范围广泛的条件下( 3, 4]。根据他们的血清学特性( 3),病毒粒子和一种AltMV结构不同。最近的研究表明,尽管形态相似性很高,AltMV CPs拥有不同的褶皱在含有RNA病毒粒子和RNA-free种。通过冷冻电子显微镜(CryoEM)的直径AltMV一种测量是15.2海里,因此超过AltMV病毒粒子(13.5海里)。作者建议没有RNA能极大增加一种中央通道直径(30)和病毒粒子(20)。CryoEM图像处理表明,一种拥有更多的CP子单元每转比AltMV病毒粒子(8.75)(9.55)具有相同音高(35.7) 4]。作者假设,尽管AltMV病毒粒子的相似性和一种整体形态在低倍镜下学习,AltMV CP不同的折叠和intersubunit交互的存在和缺乏RNA。

与同事Tyulkina [ 42)设计了基于PVX基因组杂交病毒载体和AltMV CP基因融合的流感病毒序列M2e的抗原决定基。这个向量是用于表达嵌合AltMV CP在组装工厂和车牌区域。作者认为这车牌区域作为候选疫苗( 42]。不像PapMV没有其他作品使用AltMV病毒粒子或车牌区域作为抗原表位的平台展示。

两AltMV种和病毒粒子在各种条件下稳定性高。结果表明,病毒颗粒和一种不改变他们的形态和大小在蒸馏水孵化期间,0.15 M氯化钠,Tris-HCl和0.01米,0.15 M氯化钠,pH值7.5。特别值得一提的是,AltMV病毒粒子和一种也保持稳定1小时后小鼠血清中孵化。因此,没有车牌区域的RNA和RNA蛋白质交互的缺席并不影响蛋白质的稳定的螺旋AltMV在选定的条件下一种。( 4]。此外,高immunostimulating属性导致显著增强免疫反应的抗原模型试验动物显示这两种类型的粒子( 43]。这些数据确保病毒粒子的实际应用和一种AltMV作为疫苗佐剂平台发展。这两种类型的病毒粒子有很多优势,比如装配条件和稳定的粒子与最近的AltMV相对相比,即PapMV,已经应用在这个领域最成功的研究( 44, 45]。

 8。结论

其中,花叶病毒(AltMV)是一个代表potexviruses基因组结构和病毒粒子形态典型的组。此外,AltMV已被证明有各种各样的理想的属性的实际应用。此外,病毒颗粒生产和净化的协议已经阐述了建立其进一步应用的基础。许多病毒载体来自AltMV基因组提供了一个视角目标蛋白在植物生产的工具。在广泛的条件下稳定以及immunostimulating属性使AltMV病毒和病毒样颗粒大量的生物医学应用程序的一个强大的工具。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

 确认

这项工作是支持的俄罗斯科学基金(批准号14-24-00007)。

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