拱 古生菌 1472 - 3654 1472 - 3646 Hindawi出版公司 104147年 10.1155 / 2013/104147 104147年 研究文章 的 Nitrosopumilus maritimusCdvB,但不是FtsZ,组装成聚合物 Ng Kian-Hong 1 斯 Vinayaka 1、2 Srinivasan Ramanujam 3 Balasubramanian 莫汉 1、2、3 为 杰里 1 细胞分裂的实验室 淡马锡生命科学实验室 1研究链接 新加坡国立大学 新加坡 117604年 nus.edu.sg 2 生物科学学院 新加坡国立大学 14科学驱动4 新加坡 117543年 nus.edu.sg 3 力学生物学研究所 新加坡国立大学 5工程驱动器1 新加坡 117411年 nus.edu.sg 2013年 2 6 2013年 2013年 28 02 2013年 08年 05年 2013年 2013年 版权©2013 Kian-Hong Ng et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

Euryarchaeota和Crenarchaeota是两个主要类群的古生菌分子设备使用不同的细胞分裂。Euryarchaea利用tubulin-related蛋白质FtsZ,虽然Crenarchaea,这似乎缺乏功能性FtsZ,采用Cdv分裂(细胞分裂)组件。氨氧化archaeon (AOA) Nitrosopumilus maritimus属于另一个古门,Thaumarchaeota FtsZ和Cdv基因的基因组。在这里,我们使用不同的表达系统描述FtsZ和Cdv蛋白质 n maritimus通过调查这些蛋白质形成聚合物的能力。我们显示的Cdv的蛋白质之一 n maritimusCdvB (Nmar_0816),能够形成稳定的聚合物当裂殖酵母中表达。的 n maritimusCdvB也能够在哺乳动物细胞组装成细丝。然而, n maritimusFtsZ不组装成聚合物在我们的系统。CdvB的能力,但不是FtsZ聚合符合最近的发现显示,几个Cdv蛋白质,但不是FtsZ,本地化的mid-cell网站分裂 n maritimus。因此,我们建议Cdv蛋白质,而不是FtsZ函数作为细胞分裂装置 n maritimus。

 1。介绍

古生菌的细胞分裂机制,第三域的生活,直到近年来阐明已经相对减弱。与真核生物和细菌,使用肌动球蛋白环和FtsZ环,分别对细胞分裂,古生菌似乎更加多样化的细胞分裂机械的使用。看来FtsZ充当主要细胞分裂装置在几乎所有的成员Euryarchaeota [ 1- - - - - - 4]。然而,FtsZ明显缺席古生菌的其他主要的门,Crenarcheota,由极端微生物生存在极其恶劣的条件如高温和高酸性环境。最近发现强烈建议crenarchaeon 硫化叶菌acidocaldarius利用Cdv组件(也称为endosomal排序所需的复杂的运输(ESCRT)在真核生物)对细胞分裂 5- - - - - - 7]。ESCRT装置在真核生物是由几个复合物,扮演了一个重要的角色在不同的细胞过程,例如,多泡体形成,膜离层在胞质分裂,和病毒外出( 8- - - - - - 11]。在 美国acidocaldarius,ESCRT-III-like CdvB (Saci_1373) Vps4-like CdvC (Saci_1372),而另一个基因编码一个卷曲螺旋域蛋白质,CdvA (Saci_1374),被安排在一个operon-like结构( 5, 6]。 美国acidocaldariusCdvB和开合定位在细胞分裂中期细胞,和他们的本地化对应两个隔离类核之间的膜进入网站。占主导地位的否定形式的过度CdvC已被证明导致扩大细胞DNA含量升高,也缺乏细胞DNA,强烈的细胞分裂迹象缺陷( 6]。在最近的一份工作报告的参孙et al ., CdvB和CdvA显示协同变形体外膜( 7),膜的功能,他们的角色是一致的依恋,迫使一代,和执行的二分裂 硫化叶菌细胞。

n maritimus属于一门古菌称为Thaumarchaeota [ 12, 13]。这是一个ammonia-oxidizing archaeon (AOA)导致硝化过程在海洋氮循环 14- - - - - - 16]。有趣的是,在的基因组 n maritimus,有基因编码Cdv蛋白质和FtsZ,提高问题的两个组件用于细胞分裂。最近的一份报告Pelve et al 。表明, n maritimusCdv蛋白质,但不是FtsZ,局部细胞分裂期间mid-cell地区( 17),这表明Cdv蛋白在胞质分裂而不是FtsZ函数在这个有机体。

细胞分裂装置的一个重要特征是能力的一个或多个蛋白质形成聚合物结构。肌动蛋白和FtsZ聚合体内和体外,及其聚合活动必不可少的细胞分裂( 18- - - - - - 23]。我们在以前的研究已经表明,tubulin-like FtsZ和actin-like MreB细菌形式精致的丝在酵母表达系统( 24, 25]。在这项研究中,我们试图进一步了解thaumarchaeal识别细胞分裂 n maritimus蛋白质形成丝状结构的能力。我们将研究集中在FtsZ-like Cdv蛋白质和蛋白质。我们显示的一个 n maritimusNmar_0816 CdvB蛋白质,能够聚合,形成丝状结构在酵母和哺乳动物细胞。相比之下,FtsZ同族体 n maritimusNmar_1262,不会聚合或任何高阶结构形式。我们的研究结果一致的结论Pelve et al .,这表明 n maritimus可能会使用Cdv蛋白质对细胞分裂。

 2。结果与讨论 2.1。<斜体> N的表情。maritimus < /斜体> CdvB CdvC裂殖酵母

CdvB (Saci_1373) 美国acidocaldarius已被证明在crenarchaeal发挥核心作用细胞分裂( 5, 6]。在真核生物中,ESCRT-III蛋白质所形成聚合物结构体内和体外 26- - - - - - 34]。此外,一些从crenarchaeon Cdv蛋白质 Metallosphaera sedula首先证明在体外形成丝状结构所做的一个研究Moriscot et al。 35]。作者表明, m . sedulaCdvA形成螺旋细丝与DNA。有趣的是,他们还表明,c端删除CdvB能够形成聚合物即使不完整的形式。这些发现表明细胞之间复杂的联系/收缩膜变形和蛋白质的合成活动参与细胞分裂。因为 n maritimus和 美国acidocaldariusCdvB分享大量蛋白质序列相似性(参见图S1在网上补充材料 http://dx.doi.org/10.1155/2013/104147),我们如果任何解决 n maritimusCdvB蛋白质可能聚合成丝状结构,一个重要的功能,将进一步支持声称thaumarchaea使用Cdv蛋白质对细胞分裂。由于基因操纵技术有待开发 n maritimus,我们试图回答这个问题用一个确定的绿色荧光蛋白(GFP)标记系统检查外来在酵母细胞骨架元素。我们表达了所有的三个 n maritimusCdvB假字(Nmar_0029 Nmar_0061和Nmar_0816)和CdvC (Nmar_1088)与GFP融合裂殖酵母糖基。有趣的是,其中一个CdvB假字,Nmar_0816,发现容易形成不同的聚合物的结构表达式在裂殖酵母(图 1(一))。所有其他的CdvB假字和CdvC检查显示只有弥漫在整个细胞,GFP信号没有明显的聚合物的形成(图 1(一))。我们仍不清楚为什么另外两个CdvB假字(Nmar_0029和Nmar_0061)没有形成丝状结构尽管他们与Nmar_0816密切相似(图 年代 1 )。一种可能性是,绿色荧光蛋白的融合蛋白可以改变蛋白质的构象,从而抑制其合成技术活动。也可能Nmar_0029和Nmar_0061代表不同的群CdvB Nmar_0816, Nmar_0061和Nmar_0029分享~ 50%蛋白质序列的身份,但他们与Nmar_0816分享~ 30%序列的身份。因此,两组CdvB独特的属性和作用 n maritimus。

n maritimusCdvB (Nmar_0816)丝状结构形式在酵母。(一)裂殖酵母细胞表达的图像 n maritimusCdvB假字和CdvC与GFP融合。男朋友:明亮的领域;比例尺:10 μm。(b)在裂殖酵母延时Nmar_0816聚合物形成的图像。细胞携带pREP42-Nmar_0816-GFP培养缺乏硫胺素24 h在24°C和GFP信号监测。以15秒的间隔帧被抓获。(视频S1)。比例尺:5 μm。(c)延时Nmar_0816-GFP聚合物与图像 大肠杆菌FtsZ-GFP聚合物在光漂白后荧光恢复(捆牢)。虚线矩形表示漂白。比例尺:3 μm。

接下来,我们仔细看看了聚合物形成的Nmar_0816,发现聚合Nmar_0816可能存在于各种形式从简单的细长结构封闭循环和交织在一起的结构(图 年代 2 )。因为这些高阶结构接近于由细胞骨架蛋白与微管蛋白,肌动蛋白,MreB, FtsZ,我们测试了,如果药物抑制这些细胞骨架元素会影响Nmar_0816聚合物聚合形成。我们发现Nmar_0816聚合物,虽然分享大量的形态相似性丝形成的细胞骨架蛋白,不影响治疗Latrunculin(抑制肌动蛋白聚合),A22(影响MreB聚合),着重,MBC(抑制微管聚合)(数据没有显示)。这些观察结果也证实宿主细胞骨架是可有可无的Nmar_0816聚合物形成和稳定。

 2.2。裂殖酵母Nmar_01816聚合物的形成

理解Nmar_0816聚合物是如何形成的,我们把延时电影Nmar_0816-GFP的裂殖酵母细胞增长。我们发现Nmar_0816-GFP首先形成一个聚集在细胞,并有很强的荧光信号(图 1 (b)和视频 年代 1 )。之后,细长的丝状聚合物开始出现从单向的方式聚合。与精细的纤维细胞,这些聚合物也弯曲,呈环状,和交织在一起,从而形成各种形式的Nmar_0816-GFP聚合物(图 年代 2 和数据未显示)。有趣的是,在某些情况下,裂殖酵母细胞的cytokinetic装置未能通过Nmar_0816-GFP切细丝,导致大量的胞质空泡形成(图 年代 3 一个 和视频 年代 2 ),一个强大的指标在酵母细胞死亡(图 年代 3 B )。低级的表达Nmar_0816并未导致聚合物的形成,作为初始诱导Nmar_0816-GFP(前16小时)只有导致细胞荧光信号但是没有丝状结构。进一步需要4到6个小时诱导聚合物形成(数据没有显示)。我们的实验表明,Nmar_0816蛋白质有可能达到阈值水平聚合和聚合可以开始之前。

接下来,我们试图理解蛋白质周转财产Nmar_0816聚合物的荧光光漂白后恢复(捆牢)。收紧分析显示一个非常缓慢的信号恢复Nmar_0816聚合物在光漂白相比 大肠杆菌FtsZ(~ 2%信号恢复Nmar_0816聚合物在56秒postbleaching ~ 37%相比信号恢复为52秒postbleaching FtsZ丝),表明Nmar_0816蛋白形成的高阶结构是稳定的(图 1 (c))。总的来说,我们的数据表明,Nmar_0816能够形成稳定的高阶聚合物裂殖酵母细胞。相比FtsZ蛋白质的快速周转,确保适当的控制 大肠杆菌部门,可能需要一个稳定的CdvB n maritimus为部门。它也可能 n maritimusCdvB需要其他因素比如CdvC调节其营业额。

 2.3。<斜体> N。maritimus < /斜体> CdvB (Nmar_0816)聚合成高阶结构在哺乳动物NRK细胞

Nmar_0816聚合物的形成是否仅限于裂殖酵母的细胞环境,我们是暂时性的转染哺乳动物NRK细胞构造与GFP融合表达Nmar_0816 n端。转染细胞与GFP-Nmar_0816丝状聚合物(图 2)。相比之下,在控制细胞转染GFP-containing向量,只有漫射GFP信号。有趣的是,在一些转染细胞,GFP-Nmar_0816似乎本地化扩大核内体的边缘(图 年代 4 ),一个功能类似于观察截断hVps2-1过度后,hVps24, hSnf7-1在哺乳动物细胞( 36]。ESCRT-III Vps20,组件,包含一个myristoylation网站潜在的促进与细胞膜的直接关联。已经表明,Vps20介导Vps24的招聘和Vps2膜( 8]。Nmar_0816缺乏公认的脂质修改网站,有趣的是,它的股票12%和5%序列身份与哺乳动物Vps24 (hVps24)和hVps20,分别(图 年代 5 )。作为ESCRT-III成员相互作用,可能Nmar_0816是针对核内体的边缘通过其潜在的与哺乳动物Vps20交互。然而,需要进一步的实验来证明如果针对CdvB核内体是特定的边缘。我们发现一个有趣的联系 n maritimusCdvB和哺乳动物ESCRT-IIIs。然而,我们没有观察到核内体协会Nmar_0816-GFP的酵母。不同细胞因子可能是导致不同的形式和本地化的Nmar_0816裂殖酵母和哺乳动物细胞。综上所述,我们的数据表明,Nmar_0816能够组装成高分子结构不仅在裂殖酵母,而且在哺乳动物细胞。

在哺乳动物细胞Nmar_0816丝状结构形式。哺乳动物表达GFP-Nmar_0816 NRK细胞的图像。红色箭头指向的丝状结构。男朋友:明亮的领域;比例尺:7 μm。

 2.4。评价<斜体> N。maritimus < /斜体> CdvB (Nmar_0816) Filament-Forming财产

以前的研究已经表明真核ESCRT-III的核心领域是必要的和足够的聚合 33, 36]。我们试图理解如果这filament-forming财产也是守恒的 n maritimusCdvB。我们生成的氨基端(1 - 108 aa)和c端(109 - 206 aa) Nmar_0816-GFP,的核心领域是中断了在这两种情况下。毫不奇怪,两GFP-fusion蛋白质表达导致扩散GFP信号没有明显的聚合结构(数据未显示)。相比之下,一个小的c端删除Nmar_0816保留其核心域(1 - 192 aa)形成复杂的纤维类似于完整Nmar_0816(图 3(一个))。c端删除也删除了假定的MIT-interacting主题2 (MIM2,交互与麻省理工学院CdvC蛋白质域)Nmar_0816,这也是有可能的形成和稳定Nmar_0816聚合物与CdvC蛋白是独立的交互。以来公认的MIM2 Nmar_0816主题不是与Saci_1373和哺乳动物CHMP6(高度保守的数字 年代 1 和 年代 5 ),目前尚不清楚是否与CdvC交互的能力。综上所述,我们发现的核心域CdvB足够Nmar_0816聚合(表 1和图 3(一个))。有趣的是,我们还不了解其他的原因 n maritimusCdvB假字(Nmar_0029和Nmar_0061)没有聚合等都拥有类似的核心领域一个函数。可能的干扰GFP融合对聚合活性可能有负面影响的其他两个CdvB假字。此外,序列的变化(图c端区域 年代 1 )可能会导致独特的监管CdvB假字聚合。也有可能特定的蛋白质折叠和个人主义的差异可能是导致这些区别。

总结的域分析Nmar_0816 (1 - 216 aa)蛋白质的聚合活性酵母。

聚合活动
Nmar _ 0816年 ( 1 - - - - - - 216年 ) 是的
Nmar _ 0816年 ( 1 - - - - - - 108年 ) 没有
Nmar _ 0816年 ( 109年 - - - - - - 216年 ) 没有
Nmar _ 0816年 ( 1 - - - - - - 192年 ) 是的
Nmar _ 0816年 C123A 是的

在 Nmar _ 0816年 ( 1 - - - - - - 108年 ) 和 Nmar _ 0816年 ( 109年 - - - - - - 216年 ) ,核心域(1 - 181 aa)就被打断了。在 Nmar _ 0816年 C123A 丙氨酸,半胱氨酸残基突变。在 Nmar _ 0816年 ( 1 - - - - - - 192年 ) 被公认的MIM2图案。

的核心域CdvB Nmar_0816聚合物形成的酵母是必要的。(一)酵母细胞表达Nmar_的图像 0816年 ( 1 - - - - - - 192年 ) gfp。比例尺:7 μm。(b)表达和纯化的Nmar_0816 大肠杆菌。W: 6×His-Nmar_0816 nonreducing的情况。W +: 6×His-Nmar_0816, 5%的存在 β-mecaptoethanol。C *: 6×His-Nmar_ 0186年 C 123年 一个 ,nonreducing条件。(c)酵母细胞表达Nmar_的图像 0186年 C 123年 一个 gfp。比例尺:5 μm。

进一步研究蛋白质Nmar_0816的属性,我们表示Nmar_0816重组 大肠杆菌,发现纯化Nmar_0816存在单体和二聚体或多聚体nonreducing条件下(图 3 (b))。二聚体或多聚体形式容易解决到单体的形式的~ 25 kDa的存在减少了代理。检查如果Nmar_0816的二聚的/ multimeric表单是由于二硫键的存在,我们为半胱氨酸突变密码子编码成丙氨酸和发现突变Nmar_0816解决只有作为一个单体nonreducing sds - page。从单体的聚合可以发起或二聚的/ multimeric形式的一种蛋白质,我们想知道如果二聚/ multimeric形式的CdvB蛋白质作为蛋白质聚合的成核剂。为了解决这个问题,我们表示的Nmar_0816酵母的突变形式检查如果其聚合活动将中断只有单体的形式存在。如图 3 (c)丙氨酸的半胱氨酸突变Nmar_0816有效聚合成丝状结构,与野生型表明所用二聚的/ multimeric Nmar_0816形式不需要聚合。值得注意的是Nmar_0816是唯一CdvB假字,包含一个半胱氨酸残基(图 年代 1 , C 123年 )。尽管我们已经排除,聚合需要二聚的/ multimeric Nmar_0816的形式,将会很有趣知道的能力Nmar_0816二聚/独处有重要作用的蛋白质折叠与稳定,或函数体内。

 2.5。<斜体> N。maritimus < /斜体> FtsZ大大不同于<斜体> E。杆菌< /斜体> FtsZ,不会聚合成丝

n maritimus基因组包含FtsZ的基因。自从FtsZ用于细菌和euryarchaea细胞分裂装置和能够聚合,我们问 n maritimusFtsZ聚合(Nmar_1262)也有类似的活动。我们的序列对齐和比较 NitrosopumilusFtsZ与 大肠杆菌FtsZ。所示的序列比对, n maritimusFtsZ不分享大量的序列相似性 大肠杆菌为三磷酸鸟苷FtsZ即使在最保守域绑定和水解(T7-loop)(图 4(一)以黄色和绿色突出显示,职责)。我们以前显示的表达 大肠杆菌FtsZ在酵母导致精心FtsZ丝( 25]。然而, n maritimusFtsZ没有显示任何聚合物结构时用酵母(图表示的 4 (b))。自 n maritimusFtsZ并不拥有一个守恒的主题为三磷酸鸟苷绑定( 37),我们的GTP-binding主题所取代 n maritimusFtsZ守恒GTP-binding主题(GGGTGTG) 大肠杆菌FtsZ。突变 NitrosopumilusFtsZ (Nmar_1262 * *)小酵母聚合结构,但仍然没有形成聚合成细丝(图 4 (b))。有趣的是, 大肠杆菌FtsZ携带突变的T7水解循环(D209A,图 4(一))形成类似的聚合结构时,裂殖酵母中表达(图 年代 6 )。已知突变T7循环破坏FtsZ聚合而不是三磷酸鸟苷结合( 38, 39]。 n maritimusFtsZ似乎缺乏守恒T7循环(NVDFAD,图 4(一))。很可能的本地化和形态学改变荧光Nmar_1262 * *的焦点可能是由于三磷酸鸟苷结合在缺乏一个活跃的T7循环。总的来说,我们的结果表明 n maritimusFtsZ可能经历了多个核苷酸变化后失去GTP-binding活动,甚至更换GTP-binding主题不足以恢复其聚合成细丝的能力。

n maritimusFtsZ-GFP (Nmar_1262)没有形成丝状结构在酵母。(一)序列比对的Nmar_1262 大肠杆菌FtsZ (EcFtsZ)。地区突出的黄色和绿色EcFtsZ序列是微管蛋白的两个守恒的主题/ FtsZ GGGTGTG,和NVDFAD (T7-loop)三磷酸鸟苷绑定和水解,分别。序列比对是使用ClustalW2执行程序可以从网站 http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/。(b)酵母细胞的图像表达Nmar_1262-GFP Nmar_1262 * * gfp,既定的AGKAGSA GTP-binding图案与传统GGGTGTG取代。比例尺:10 μm。

我们的发现与研究Pelve等人都建议 n maritimus可能会使用Cdv蛋白质细胞分裂虽然也有FtsZ-like蛋白质的基因编码。这就引发了另一个有趣的问题是什么FtsZ的功能 n maritimus如果不是因为细胞分裂。然而,从序列比对 大肠杆菌FtsZ,显然对我们 n maritimusFtsZ没有守恒GTP-binding主题(因此,可能不会绑定到三磷酸鸟苷)和完全缺乏T7-loop三磷酸鸟苷水解。因此,它是可能的 n maritimusFtsZ已经失去了它的细胞分裂功能。有趣的是,Thaumarchaeota一直建议有Euryarchaeota物种形成之前的分歧和Crenarchaeota [ 12]。并非不可能的祖先血统古生菌FtsZ-like和Cdv蛋白质已经进化到产生两种截然不同的热点血统,使用Cdv蛋白质对细胞分裂和失去了FtsZ,而另一个依赖FtsZ并带走Cdv蛋白质。那样,thaumarchaea可能代表一个“活化石”Cdv蛋白质被用于细胞分裂,而FtsZ正在丧失其在细胞分裂机械的进化功能的作用。

CdvB的一个有趣的方面是,它往往存在多个基因组(三个假字 n maritimus和四个 美国acidocaldarius)。这将是有趣的,知道这些假字重叠功能。在 美国acidocaldarius的,只有一个CdvB蛋白(Saci_1373)已被证明是参与细胞分裂( 5, 6]。另外两个CdvB假字(Saci_0451和Saci_1416)已经提出起源于一个最近的基因重复事件( 40]。有趣的是,这两个假字被发现在分泌膜囊泡( 41),这表明他们可能从Saci_1373扮演不同的角色 美国acidocaldarius。在 n maritimus基于序列的身份,很可能polymer-forming Nmar_0816和另外两个假字(Nmar_0029和Nmar_0061)形式截然不同的族群的CdvB会扮演不同的角色。然而,需要更多的实验来展示各自的功能 n maritimus。这也将是有趣的理解的CdvB假字和不为生物至关重要。基因缺失分析将提供一个快速了解这一点。

总之,我们已经表明,一个 n maritimusNmar_0816 CdvB假字,能组装成细丝。相比之下,FtsZ没有聚合试验。作为细胞骨架聚合物参与细胞分裂,我们得出结论 n maritimus可能使用CdvB作为其细胞分裂机械。

 3所示。实验程序 3.1。质粒的制备

编码序列的 n maritimusCdv组件(Nmar_0029 Nmar_0061、Nmar_0816 Nmar_1088)和FtsZ (Nmar_1262)密码子优化,合成,克隆到pUC57质粒的商业基因合成服务(GenScript USA Inc .)。 美国非洲酒GFP-tagging表达载体包含尿嘧啶pREP42-GFP营养缺陷型生物合成基因选择是来自我们的实验室集合。表达绿色荧光蛋白的融合蛋白与pREP42-GFP向量是一个中等强度的控制下thiamine-repressible nmt启动子( 42]。

 3.2。Gap-Repair克隆和酵母转换

Gap-repair克隆进行描述( 43]。Gene-specific片段引物列表(见表S1) n maritimus~ 50元重叠区域从pREP42-GFP N - PCR扩增获得的和糖用高保真taq(罗氏)根据制造商的指示。不同pUC57质粒携带codon-optimized n maritimus基因被用作模板。用琼脂糖凝胶电泳PCR片段进行了分析。pREP42-GFP向量线性化了 BamHI和 心好双消化(新英格兰生物学实验室)和纯化使用柱净化设备(试剂盒)。PCR碎片和线性化pREP42-GFP混合在10:1比和转换成MBY192应变( ura4-D18, leu1-32年,h -)使用醋酸锂方法如前所述 44]。简单地说,酵母细胞生长光学密度0.5。细胞和无菌水冲洗一次,洗一次1 x LiAc / TE方案(100毫米醋酸锂10毫米Tris-HCl 1毫米EDTA, pH值7.5)。细胞被resuspended在100年 μL 1 x LiAc / TE方案和孵化与各自的质粒在室温下10分钟。与240年细胞进一步孵化 μL挂钩/ LiAc / TE方案(LiAc / TE方案以40%聚乙二醇4000)30分钟30°C。42 μL(二甲亚砜(DMSO)被添加到在42°C细胞热休克前5分钟。热休克后,细胞被镀用无菌水清洗一次,在爱丁堡基本培养基(EMM)补充氨基酸和15 μ硫胺素的M。后4 - 5天的增长,至少20殖民地从每个转化株的选择和re-streaked新鲜补充电解板没有硫胺素和孵化30°C 4 - 5天。殖民地被荧光的荧光显微镜下检查。与GFP信号转化株生长在液体培养的详细检查。进一步验证filament-forming Nmar_0816-GFP,细胞与pREP42-Nmar_0816-GFP转化质粒由传统restriction-based克隆方法。的转化株pREP42-Nmar_0816-GFP显示filament-forming属性与gap-repair克隆获得的转化株是没有区别的。构建pREP42-Nmar_1262 * * gfp(更换变体三磷酸鸟苷结合主题与传统GGGTGTG AGKAGSA),两个独立的氨基端和c端片段通过使用引物PCR扩增结合相应的核苷酸序列的变化(引物序列见表S1)。碎片都是用于一个重叠的PCR的最后片段PCR Nmar_1262交换的三磷酸鸟苷结合主题(Nmar_1262 * *)。Nmar_1262 * *的PCR片段然后修复克隆用于随后的差距。

 3.3。细胞培养、转染和表达的GFP-Nmar_0816 NRK细胞

GFP-Nmar_0816在哺乳动物细胞的表达,全长Nmar_0816放大和克隆到pEGFP-C1向量(Clontech)。NRK细胞保持在Kaighn修改F12 (F12Kσ)中补充10%胎牛血清的边后卫,1毫米谷酰胺,100 U /毫升青霉素,100 μg / mL链霉素(GIBCO) 37°C和5%的公司2。对转染细胞种植在盖玻片室confluency 60% - -70%。细胞被冲洗一次Opti-MEM转染前我立即介质(LifeTechnologies)。然后冲洗细胞转染与1 μg的每个pEGFP-C1-Nmar_0816 pEGFP-C1使用Lipofectamine 2000试剂(英杰公司)根据制造商的指示。4 h孵化后,介质包含DNA-Lipofectamine取代F12K中含有10%的边后卫,和一个额外的细胞培养成像前14 - 16 h。

 3.4。蛋白表达和sds - page分析

全长Nmar_0816是PCR扩增引物信息(见表S1)和克隆到pQE30向量(试剂盒)表达为6×His-Nmar_0816重组蛋白 大肠杆菌M15。重组6×His-Nmar_0816与1毫米IPTG诱导和净化镍柱(试剂盒)根据制造商的指示。表达6×His-Nmar_ 0816年 C 123年 一个 (半胱氨酸丙氨酸突变) 大肠杆菌,两个独立的氨基端和c端使用引物PCR获得碎片合并丙氨酸突变的半胱氨酸核苷酸序列(引物序列见表S1)。重叠的PCR进行使用和N - c端PCR片段得到的最后片段PCR与半胱氨酸Nmar_0816丙氨酸突变。的Nmar_ 0816年 C 123年 一个 然后片段克隆到pQE30向量表达式和净化。纯化的重组蛋白sds - page分析了10%。

 3.5。显微镜和收紧的分析

酵母的数字化成像,图像是在一个奥林巴斯IX71倒置显微镜配备了电荷耦合器件(CCD)相机(CoolSNAP ES,光度)、100 x / 1.45 NA计划Apo物镜(奥林巴斯)和Metamorph (v.7.6)软件。荧光光漂白后复苏(收紧)进行使用蔡司元510反向共焦显微镜100 x / 1.25 NA高度消色透镜物镜。在哺乳动物,NRK细胞荧光成像,图像被使用Axiovert 200倒置显微镜(卡尔蔡司)100 x / 1.30 NA Plan-Neofluar透镜或蔡司LSM元510反向共焦显微镜100 x / 1.4 NA Plan-Apochromat镜头。所有图片来自Axiovert 200是使用CCD相机(CoolSNAP冷却总部Roper科学)和MetaView成像软件(通用成像)。图像处理ImageJ软件( http://rsb.info.nih.gov/ij/)表示。

 确认

作者要感谢Drs。谢唐,Mithilesh Mishra Phing-Chian柴,辛格Nongmaithem Sadananda,和Sreepathy萨钦瑟哈德里的批判阅读纸和细胞分裂实验室的所有成员的技术建议。特别感谢博士Snezhana Oliferenko宝贵的意见在纸上。这项工作是支持的研究资金来自淡马锡生命科学实验室和力学生物学研究所。

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