拱 古生菌 1472 - 3654 1472 - 3646 Hindawi出版公司 845756年 10.1155 / 2012/845756 845756年 研究文章 锰的作用2 +辐射电阻和兼容溶质的嗜热细菌和古生菌 韦伯 金伯利M。 DiRuggiero Jocelyne Ishino Yoshizumi 生物学系 约翰霍普金斯大学 马里兰州巴尔的摩21218 美国 jhu.edu 2012年 14 11 2012年 2012年 25 07年 2012年 18 09年 2012年 13 10 2012年 2012年 版权©2012金伯利·m·韦伯和Jocelyne DiRuggiero。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

防辐射的细菌引起了大量的关注从科学家寻求公开机制难以置信的生存能力。最近的分析表明,抗电离辐射archaeon (IR) Halobacterium salinarum取决于Mn-antioxidant复合物负责清除活性氧(ROS)生成的辐射。我们检查了兼容的溶质海藻糖的作用,mannosylglycerate, di-myo-inositol磷酸盐在有氧和无氧嗜热菌的辐射抗性。我们发现红外嗜热细菌的耐药性 Rubrobacter xylanophilus和 Rubrobacter radiotolerans是高度相关的积累高细胞内海藻糖的浓度与锰、支持Mn的模型吗2 +在需氧菌端依赖ROS清除。相比之下,hyperthermophilic古生菌 Thermococcus gammatolerans和 海床furiosus不包含大量的胞内Mn,我们没有发现显著的抗氧化活性mannosylglycerate和di - myo磷酸肌醇 在体外。我们因此提出,低水平的生成活性氧在厌氧条件下结合高度持续表达解毒系统辐射电阻和规避这些厌氧菌关键需要Mn-antioxidant复合物在细胞内的积累。

 1。介绍

电离辐射生物学(IR)是特别感兴趣的,因为它暴露导致严重的氧化应激细胞的大分子。绝大多数细胞侮辱水条件下造成的间接影响,通过活性氧簇(ROS)的作用而形成的水辐解和生成羟基自由基(HO)•),过氧化物(O2•−)和过氧化氢(H2O2)[ 1]。DNA-associated水分子进行辐解成为核酸的直接威胁,产生氧化DNA碱基和糖,半个步行不能的网站,链断裂,使交联蛋白( 1, 2]。蛋白质是由活性氧攻击引入羰基残留物,氨基酸激进的链式反应,交联,并最终导致蛋白质失活和变性 3, 4]。蛋白质与[4 fe-4s]集群尤其容易受到O2•−和H2O2攻击,导致亚铁离子的释放和HO的形成•通过芬顿反应( 5]。因此预防ROS-mediated细胞损伤的关键幸存的红外曝光。

虽然被认为DNA损伤,特别是DNA双链断裂(双边带),最红外暴露所造成的细胞毒性损伤,最近发现关于红外的DNA损伤的修复和IR-sensitive和IR-resistant生物遭受相同数量的DNA双边带等效剂量的红外(~ 0.01双边带/ Gy / Mbp)强烈离开这教条 6, 7]。现在证实蛋白质是辐射损伤的主要目标,防止蛋白质氧化为生存是一个重要的过程从红外暴露 8, 9]。

关于机制红外阻力,与嗜盐archaeon最近的研究 Halobacterium salinarum显示所发挥的关键作用非酶的抗氧化过程在这个生物的抗辐射性 10, 11]。 h . salinarum除了适应高盐,也展示高层抗干燥,高压,紫外线辐射和红外( 11- - - - - - 14]。它的 D 10 辐射剂量的灰色(Gy)降低了人口的生存90%,是5 kGy的( 13]。的测量 h . salinarum细胞内部显示高锰/铁(Mn / Fe)比类似的极其耐辐射的细菌 耐辐射球菌( D 10 12 kGy的)和其他红外耐药微生物( 9, 10]。进一步的工作 耐辐射奇球菌的优雅建立锰所扮演的角色的关键2 +这种细菌肽复合物的辐射电阻( 15]在酵母, 在活的有机体内研究显示Mn-orthophosphate复合体的重要功能在氧化应激( 16]。在 芽孢杆菌、锰2 +-dipicolinic复合物与压力抗性表型孢子,干态和湿态包括红外热( 17],蓝藻,极耐红外干燥,Mn积累2 +和mycosporine-like氨基酸( 18]。在 h . salinarumenzyme-free细胞提取物富含锰、磷酸、氨基酸和肽酶提供了高水平的保护, 在体外红外的有害影响,潜在的重要作用Mn抗氧化复合物在辐射电阻也延伸到古生菌( 11]。细胞积累Mn与各种各样的有机和无机配体可能是一个广泛的幸存的氧化应激的机制,也有证据表明,这可能延伸到简单的动物,如轮虫( 19]。

发现了许多极端微生物抗红外,表明辐射电阻是一个偶然的结果对其他环境压力( 20.]。从研究 耐辐射奇球菌的和环境隔离,一个强大的连接之间建立了干燥和红外电阻( 21, 22]。这两种类型的压力产生活性氧和造成严重的氧化损伤细胞的大分子( 23]。然而,没有直接脱水耐性和辐射电阻之间的相关性被发现(超)嗜热古菌( 20., 24]。的分布极其IR-resistant生物体在生命的种系发生树并不局限于原核生物。最近的研究揭示了几个真核生物的高水平的红外阻力包括担子菌类真菌 黑粉菌属maydis( 25,淡水无脊椎动物 Philodina红疹( 26),水熊 Milnesium tardigradum( 27),和蛔虫 秀丽隐杆线虫( 28]。大量的嗜热古菌和细菌还发现了抗红外,包括硫酸盐还原 Archaeoglobus fulgidus产甲烷菌,如 Methanocaldococcus jannaschii,超嗜热菌 p . furiosus Thermococcus radiotolerans,和 Thermococcus gammatolerans( 20., 29日- - - - - - 31日),嗜热细菌 Rubrobacter xylanophilus和 Rubrobacter radiotolerans( 32, 33]。然而,尽管IR-resistant生物分布在生命的三个领域,该分布可能显著不同生物之间的同一家族,甚至物种之间( 7]。

嗜热细菌和古生菌不同的居住环境和生存多个压力包括干燥、辐射、压力,pH值一起极端高温( 20., 34, 35]。的嗜热微生物生长能力以上的温度超过50°C ( 36),要求其大分子抵抗不仅热量的热变性作用,而且随之而来的负担的高氧化应激引起的代谢过程。许多嗜热微生物也halotolerant [ 37, 38,总的来说,这些生物的特点是氨基酸的积累,糖,多元醇,和衍生品(兼容的溶质)[ 39]。兼容的溶质积累通常归因于保护细胞免受渗透压力和热休克和已被证明稳定蛋白质 在体外( 38, 40]。Mannosylglycerate (MG)是嗜热菌中广泛分布,和细胞浓度的MG已经被证明可以有效应对盐胁迫( 38]。Di - myo磷酸肌醇(浸)、嗜热微生物中的一种溶质完全兼容,积累在细胞对热应力 38, 41]。MG和研究了倾斜保护蛋白质的能力 在体外对热应力和冷冻干燥( 42- - - - - - 45]。

在这项研究中,我们调查了兼容的溶质在两所扮演的角色IR-resistant嗜热细菌, r . xylanophilus( D 10 6 kGy的), r . radiotolerans( D 10 10 kGy的),和两个IR-resistant hyperthermophilic古生菌, p . furiosus( D 10 3 kGy的), t . gammatolerans( D 10 6 kGy的)。我们表明,在有氧条件下,兼容溶质积累由嗜热细菌授予红外抗酶 在体外辐射防护是减轻的海藻糖和锰2 +。关于hyperthermophilic古生菌、厌氧环境有助于他们的红外阻力,这是保护酶的最重要因素 在体外。

 2。材料和方法 2.1。生长条件

Rubrobacter radiotolerans5868年(DSM) Thermococcus gammatolerans15229年(DSM)从DSMZ获得。 Rubrobacter xylanophilus(DSMZ 9941)是Gaidamakova博士的礼物。 Rubrobacter种虫害是生长在TM中包含1 g / L胰蛋白胨,1 g / L酵母提取物,0.7 g / L NaNO3,0.1 g / L Na2HPO4,0.1 g / L次氮基三乙酸,0.1 g / L MgSO4h·72啊,0.1 g / L KNO3卡索,60 mg / L4h·22啊,8 mg / L氯化钠,2.2 mg / L MnSO4·H2啊,0.5 mg / L ZnSO4h·72啊,0.5 mg / L H3薄3,25 μ g / L CuSO45·h2o, 25岁 μ g / L Na2MoO4h·22O, 46岁 μ g / L CoCl2h·62O, FeCl 10毫升/ L 0.17毫米3h·62啊,最后的pH值8.2。文化是在48°C r . radiotolerans和60°C r . xylanophilus,用颤抖的在220 rpm Gyromax 737瓶(Amerex仪器,拉斐特CA)。 海床furiosus应变(DSMZ 3638)是生长在没有硫与100年 μ 米 Na2我们4和0.5% (wt /卷)麦芽糖Pf中包含24 g / L氯化钠,4 g / L Na2所以4,0.7 g / L氯化钾,0.2 g / L NaHCO3,0.1 g / L KBr, 0.03 g / L H3薄3,10.8 g / L MgCl2h·62啊,1.5 / Lg CaCl2h·22啊,0.025 g / L SrCl2h·62啊,0.08%的钠2S·9 h2啊,5 g / L胰蛋白胨,1 g / L酵母提取物,1毫升/ L刃天青(0.2 g L−1解决方案),最后pH值6.8,100毫升血清瓶或1 L瓶在95°C在厌氧条件下 46]。 Thermococcus gammatolerans是生长在ASW-YTP介质包含38 g / L氯化钠,14.5 g / L MgCl吗2h·62啊,5 g / L胰蛋白胨,5 g / L酵母提取物、5 g / L丙酮酸钠,5.6 g / L MgSO4h·72啊,2.5 g / L CaCl2h·22啊,2.6 g / L Na2所以4,1 g / L氯化钾,80 mg / L Na2有限公司3,80 mg / L NaBr, 64 mg / L KBr, 58毫克/ L SrCl2h·62啊,42 g / L H3薄38.1 mg / L Na2HPO42.4 mg / L氟化钠0.4 mg / L NaSiO4,50 μ g / L KI, 0.08% Na2S·9 h2啊,1毫升/ L刃天青(0.2 g L−1解决方案),最后pH值6.8,100毫升血清瓶或1 L瓶在厌氧条件下在88°C。

 2.2。制备Enzyme-Free细胞提取物

文化是生长在适当的媒体和条件0.4 OD 600年 纳米 和细胞离心收获的8000×g(10分钟、4°C)。 Rubrobacter种虫害细胞被洗两次TM-BSS (TM媒体缺乏胰蛋白胨和酵母提取物,最后pH值8.2), p . furiosus细胞与Pf-BSS (Pf中缺乏碳源、钨和Na2S·9 h2啊,最后的pH值6.8), t . gammatolerans细胞与ASW-BSS (ASW-YTP中缺乏碳源和Na2S·9 h2啊,最后的pH值6.8)。颗粒在蒸馏和去离子水(ddH resuspended2O, Sigma-Aldrich)和通过一个Emulsiflex均质器(Avestin, Inc .,渥太华,加拿大)在15000 psi溶解细胞。细胞提取物离心机在12000×g(60分钟,4°C)由蛋白质浓度和标准化,这是由BioRad布拉德福德化验(BioRad大力神,CA)。上层清液进一步离心机在190000×g (40 h, 4°C)和接受使用3 kDa离心过滤设备(Amicon ultracel 3 k过滤器;微孔,Billerica, MA)。结果无蛋白细胞提取物,称为超滤液(UFs),集中在5倍速度真空浓缩器(Heto真空离心;ATR,位于马里兰州劳雷尔)和存储 - - - - - - 20. ° C 。佛罗里达大学的 h . salinarum准备中描述( 11]。

 2.3。保护酶测定

的限制性内切酶 Dde我是0.5的最终浓度单位/补充说 μ L UFs稀释至0.2倍,25毫米磷酸盐缓冲剂(加以pH值7.0,海藻糖20毫米的解决方案,mannosylglycerate(毫克),或di - myo磷酸肌醇(浸),有或没有的250 μ 米 或25 μ 米 MnCl2。分析执行在厌氧条件下清除了超高纯度Ar(99.999%)(谷国家气体,弗雷德里克博士)。辐照在冰使用的解决方案60公司伽马源(贝塞斯达的健康科学统一服务大学,医学博士,剂量率3.2 kGy的/ hr)在以下剂量:0,1,2,3,4,5 kGy的或0,1,2,4,6,8,10,12 kGy的。样本被保存在冰直到1消化 μ 使用1 U g pUC19 DNA酶从每个辐照解决方案在37°C 1 h。结果pUC19 DNA片段分离在1%琼脂糖电泳此种凝胶和可视化与溴化乙锭染色如前所述 11]。

 2.4。测定氨基酸的浓度

UFs的自由和总氨基酸含量 r . xylanophilus r . radiotolerans p . furiosus和 t . gammatolerans用茚三酮测定试验(如前所述)( 11]。

 2.5。icp和离子色谱法

锰、铁、PO4浓度 r . xylanophilus r . radiotolerans p . furiosus和 t . gammatoleransUFs和细胞(锰、铁)测定使用icp(锰、铁)和离子色谱(PO4)部门的环境卫生工程、JHU公共卫生学院(如前所述)( 11]。

 2.6。制备的乙醇提取物

细胞收获与BSS洗。球109细胞resuspended在80%乙醇,打破通过法国媒体如前所述 47),离心机在10000×g(50分钟,4°C)。在整个过程中细胞和乙醇在冰上。乙醇被速度真空浓缩器(Heto真空离心,ATR,月桂,MD),和残留在超纯水(ddH resuspended2O, Sigma-Aldrich)过滤通过10 kDa过滤器(Amicon ultracel 10 k过滤器;微孔,Billerca, MA)。细胞蛋白质浓度由BioRad布拉德福德化验(大力神,CA)使用细胞球109细胞在蒸馏和去离子水(ddH resuspended2O, Sigma-Aldrich),由法国媒体细胞溶解,离心如上所述。

 2.7。高效阴离子交换色谱法

高效阴离子交换色谱法(HPAEC)进行Dionex DX 500 CarboPac PA-10列和PA-10警卫队列(Dionex,桑尼维尔CA)和脉冲测量电流的检测(PAD)。一个整除的乙醇提取物稀释10 - 100倍,注入CarboPac PA-1列平衡与16毫米氢氧化钠。与线性梯度洗脱了从16毫米氢氧化钠醋酸钠0.5米/ 0.1 M氢氧化钠。标准的0.25、0.5、1、2、4 nmol海藻糖,MG,蘸竞选量化。Mannosylglycerate (MG)和di - myo磷酸肌醇(浸)获得Bitop AG)、德国威滕。

 3所示。结果 3.1。超滤液的成分分析

在以前的研究中,无蛋白细胞提取物,也称为超滤液(UFs) IR-resistant细菌和古菌的发现富含锰2 +和有机小分子,包括氨基酸和肽( 11, 15]。结合时 在体外在生理浓度有关,这些成分形成强有力的抗氧化剂复合物在正磷酸盐缓冲(加以 11, 15]。确定潜在作用Mn和兼容的溶质的嗜热菌的辐射电阻,我们测量浓度的金属离子、磷酸盐,和整个细胞溶质和UFs兼容 r . xylanophilus r . radiotolerans p . furiosus和 t . gammatolerans(表 1和 2)。UFs IR-resistant的 Rubrobacter物种丰富的Mn相对于IR-sensitive细菌,产生高Mn / Fe比率类似发现 h . salinarum(表 1)。锰的浓度在厌氧的UFs古生菌 t . gammatolerans和 p . furiosus超过一个数量级低于的值 Rubrobacter物种UFs,导致Mn / Fe比率类似辐射灵敏的细菌 大肠杆菌和 p . putida(表 1)。Mn / Fe比率在整个细胞中跟随趋势的观察与分析Mn UFs / Fe比率(表 1)。磷酸盐水平高在所有UFs除外 p . furiosus(表 2)。

浓度的锰和铁超滤液(UFs)和整个细胞的嗜热微生物和辐射灵敏的细菌。

浓缩的。:
超滤液 整个细胞
生物 D 10 一个 基因组 锰 菲 Mn /铁 锰 菲 Mn /铁
(公斤) (Mbp) ( μ米) ( μ米) (ng / 109细胞) (ng / 109细胞)
p . putidab 0.1 6.2 0.9 6.1 0.1 18 1045年 0.02
大肠杆菌b 0.5 4.6 0.6 3所示。5 0.2 14 645年 0.02
h . salinarumb 5 2。6 87年 8.9 9.8 155年 818年 0.19
r . xylanophilus 6 3所示。2 79年 8.2 9.6 549年 290年 1。9
r . radiotolerans 10 3所示。4 211年 18 11.8 300年 340年 0.88
p . furiosus 3 1。9 5.3 113年 0.1 14 345年 0.04
t . gammatolerans 6 2。1 6.3 15 0.4 3 235年 0.01

一个剂量的可行的细胞减少到10%的人口。

b从[ 11]。

浓度的氨基酸,阿宝4,兼容的溶质在嗜热菌和辐射灵敏的细菌UFs嗜热菌乙醇提取物。

浓缩的。:
超滤液(毫米) 乙醇提取( μ摩尔/毫克蛋白)
生物 氨基酸 阿宝4 海藻糖 毫克 浸 海藻糖 毫克 浸
免费的 总
p . putida一个 52 121年 4.5 nd nd nd
大肠杆菌一个 80年 181年 5.9 nd nd nd
h . salinarum一个 325年 642年 22 nd nd nd
r . xylanophilus 87年 115年 10 17 99年 33 1。5 3所示。0 0.7
r . radiotolerans 134年 159年 24 29日 64年 - - - - - -b 1。7 2。4 nd
p . furiosus 15 35 5.4 nd 52 6 nd 0.2 0.04
t . gammatolerans 221年 235年 19 nd 10 2。3 nd 0.1 0.05

一个从[ 11]。

b没有检测到。

nd:不确定。

我们使用了高效阴离子交换色谱法(HPAEC)量化溶质在UFs兼容。 r . radiotolerans和 r . xylanophilusUFs都包含大量的海藻糖与29毫米和17毫米,分别。此外,我们发现mannosylglycerate (MG) UFs两种 r . xylanophilus(99毫米) r . radiotolerans(64毫米),而只有 r . xylanophilus佛罗里达大学含有di - myo磷酸肌醇(DIP)(33毫米)(表 2)。 p . furiosus佛罗里达大学有52毫米MG和6毫米的倾斜,这是明显的浓度在佛罗里达大学 t . gammatolerans。氨基酸和肽浓度没有显著升高 RubrobacterUFs或物种 p . furiosus与相比, h . salinarum佛罗里达大学,而 t . gammatolerans佛罗里达大学有明显高于游离氨基酸浓度(表 2)。因此,UFs嗜热菌的报道这里积累一些有机小分子只有UFs的 r . radiotolerans和 r . xylanophilus表现出大量的锰。

估计细胞内溶质浓度的兼容,我们分析了我们的嗜热生物使用的乙醇提取物HPAEC(表 2)。我们的数据 p . furiosus类似于之前报道的浓度毫克通过核磁共振,验证我们的方法。利用细胞生长在类似的生长条件对盐度和温度,我们计算一个细胞内浓度0.22毫克 μ 摩尔/蛋白质和0.25毫克 μ 摩尔/毫克蛋白由马丁和桑托斯( 41]。我们计算的近似细胞内浓度MG和倾斜 p . furiosus和 t . gammatolerans使用细胞体积为4.5 μ L /毫克蛋白( 41]。在 p . furiosus、镁和浸渍浓度49毫米和10毫米,分别 t . gammatolerans,我们发现21毫米MG和11毫米的浓度下降。这些细胞内浓度类似MG和蘸的UFs有机体(表 2)。关于 Rubrobacter物种,我们没有一个适当的细胞体积来计算细胞内浓度;然而,表 1显示两个 r . radiotolerans和 r . xylanophilusMG浓度较高(和浸渍浓度 r . xylanophilus)比 p . furiosus和 t . gammatoleransUFs和我们整个细胞(乙醇提取物)决定。

调查这些小分子在辐射电阻的作用,我们测试能力UFs和重组的准备,保护纯化酶的活动暴露增加剂量的红外光谱。

 3.2。防止红外Rubrobacter UFs和兼容溶质的物种

我们测试的辐射防护性能UFs准备 r . xylanophilus和 r . radiotolerans的活动 Dde我,一个限制性内切核酸酶,暴露剂量的红外12 kGy的(图 1)。辐照后,残留的酶活性测定,将质粒DNA的能力;通过琼脂糖凝胶电泳分析了限制片段。在我们的实验条件下, r . xylanophilus和 r . radiotoleransUFs提供保护酶活性在延长到6和8 kGy的剂量,分别与级别的保护授予的 h . salinarum佛罗里达大学和更高的佛罗里达大学IR-sensitive有机体(图 1;( 11])。接下来,我们下一个测试中的兼容的溶质UFs和细胞 Rubrobacter物种的能力对红外保护酶活性,在生理浓度相关。而磷酸盐缓冲剂( P 我 B )保护酶活性的2 kGy的,添加海藻糖导致显著增加保护,6 kGy的(图 2)。当海藻糖和加以结合0.25毫米锰2 +(决心从整个细胞生理相关分析),辐射防护12 kGy的急剧增加。辐射加以和Mn的酶2 +2 kGy的孤独只保护其活性,增加25毫米MG或下降(图没有增加保护 2)。

保护酶活性。的限制性内切酶 Dde我在enzyme-free辐照12 kGy的细胞提取物(UFs) h . salinarum, r . radiotolerans和 r . xylanophilus(稀释到0.2 x)。剩余的限制性内切酶消化活动化验的pUC19质粒DNA;碎片被琼脂糖凝胶电泳分析。第一通道分子大小的梯子。

保护酶活性与溶质在有氧条件下兼容。上面板、限制性内切酶 Dde我和25毫米辐照12 kGy的磷酸盐缓冲剂(加以)和海藻糖20毫米和0.25毫米Mn2 +。在较低的面板,这种酶是辐照10 kGy的,25毫米加以结合0.25毫米锰2 +的25毫米MG或倾斜。剩余的限制性内切酶消化活动化验的pUC19质粒DNA;碎片被琼脂糖凝胶电泳分析。第一通道分子大小的梯子。

 3.3。防止红外UFs和兼容的溶质Hyperthermophilic古生菌

形成鲜明对比 RubrobacterUFs, UFs厌氧菌 p . furiosus和 t . gammatolerans没有保护 Dde我在剂量大于1 kGy的活动在有氧条件下(图 3)。在这些实验中,红外剂量增加1 kGy的间隔5 kGy的提高分辨率。以确定是否缺乏辐射防护是由于分子氧的存在(O2),我们测试了UFs在厌氧条件下的属性。在缺乏O2,UFs p . furiosus和 t . gammatolerans受保护的 Dde我3 kGy的(图 3)。增加0.025毫米锰2 +UFs的 p . furiosus和 t . gammatolerans延长的保护 Dde我酶5 kGy的,代表增加(图2 kGy的有氧条件 3)。虽然这锰浓度(0.025毫米)的生理有关 p . furiosus和 t . gammatolerans,10 - 100倍不到锰浓度的细胞中发现有氧抗辐射 Rubrobacter物种(表 1)。

在有氧和无氧条件下保护酶活性。的限制性内切酶 Dde我是辐照5 kGy的存在与否的氧气在enzyme-free细胞提取物(UFs) t . gammatolerans和 p . furiosus(稀释到0.2 x)。剩余的限制性内切酶消化活动化验的pUC19质粒DNA;碎片被琼脂糖凝胶电泳分析。第一通道分子大小的梯子。

我们也比较了酶保护活动MG和蘸的存在和缺乏O2。在厌氧条件下发现的细胞内环境 p . furiosus和 t . gammatolerans毫克的保护 Dde我酶5 kGy的扩展,从只有1 kGy的在有氧条件下(图 4)。保护酶活性也扩展在有氧和无氧条件下酶时辐照MG和锰2 +。下降并没有显示任何增加酶保护,单独或结合镁和锰2 +引起的,而是减少酶的保护。事实上,单独加以提供的保护水平相同,加以和20毫米倾斜。我们还发现,加以保护超过20毫米的MG。这些实验表明,孵化酶在厌氧条件下的辐射是最有效的条件扩展酶活性更高剂量的红外光谱。

保护酶活性与溶质兼容。的限制性内切酶 Dde我辐照5 kGy的氧气的存在与否,在水或20毫米毫克,20毫米MG和0.025毫米Mn, 20毫米倾斜,或20 mM毫克,锰浸20毫米,0.025毫米。20毫米的浸渍溶液的pH值9.5;因此10毫米加以了最终pH值为7.5。剩余的限制性内切酶消化活动化验的pUC19质粒DNA;碎片被琼脂糖凝胶电泳分析。第一通道分子大小的梯子。

 4所示。讨论

嗜热微生物增长是由高温的要求,但在这个群体有很大的多样性代谢功能和居住的环境微生物( 48]。在这里,我们调查了辐射电阻的两组嗜热微生物系统和新陈代谢截然不同。细菌, r . xylanophilus和 r . radiotolerans是IR-resistant嗜热微生物的有氧环境和古细菌, t . gammatolerans和 p . furiosus是IR-resistant超嗜热菌的厌氧环境。

紧密相关性高辐射抗性细菌和古生菌和细胞内高锰/ Fe比率从研究模型建立了生物和环境隔离 11, 22, 49]。这两个 r . xylanophilus和 r . radiotolerans表现出类似的Mn /菲比IR-resistant 耐辐射奇球菌的和 h . salinarum,强调中央Mn在原核生物的辐射电阻所扮演的角色( 7]。先前的研究表明,锰2 +促进蛋白质保护细胞通过与小分子的相互作用表现为协同作用,包括正磷酸盐、氨基酸、肽、核苷,生成催化 O 2 • - - - - - - - - - H2O2清除复合物( 11, 50, 51]。这两个 Rubrobacter物种的UFs浓缩在Mn和磷酸盐和保护酶活性, 在体外相比,从类似的高剂量的红外超滤 h . salinarum( 11]。这些发现表明Mn-associated抗氧化分子也可能出现在 Rubrobacterspp。, 在活的有机体内保护所有细胞大分子的缓解的影响生成的活性氧( 11, 50]。的 RubrobacterUFs不包含高浓度的氨基酸或肽,如被发现 耐辐射奇球菌的和 h . salinarum但他们在兼容的溶质浓缩,包括海藻糖,MG,浸 11, 15, 17]。

兼容的溶质的嗜热微生物已被广泛的研究protein-stabilizing属性( 44]。大量的嗜热微生物是防辐射的,在此我们评估了可能的这些分子对辐射的抗氧化性能。在这个工作之前,溶质在兼容 r . radiotolerans没有被调查。我们发现这种细菌海藻糖积累和MG类似的数量 r . xylanophilus,但不是当增长48°C。与超嗜热菌浸大多有关(最佳生长温度> 80°C),和 r . radiotolerans被认为是中度嗜热的最佳生长温度48°C ( 52]。 r . xylanophilus相比之下,有一个最佳生长温度60°C,这是最低生长温度报告中已知生物积累下降( 53]。如前所述, r . xylanophilus海藻糖积累,MG,浸在其最佳生长条件和增加这些兼容的溶质的浓度在加热或渗透压力的反应 37]。我们已经确定, r . radiotolerans还维护基底毫克分子细胞浓度的海藻糖和MG,代表有机溶质结构上存在于细胞,与潜在的抗氧化性能。虽然意外,MG和没有保护酶活性 在体外,这些溶质携带负电荷和兼容可能排斥在不同的带负电荷的蛋白质网站,离开地区容易受到活性氧的攻击。尽管如此,这两个化合物以前清除HO)•( 44),我们得出结论,他们不是有效的食腐动物 O 2 • - - - - - - 和H2O2,由红外( 1]。

海藻糖,类似规模的兼容的溶质MG和倾斜,但没有携带指控,高度对红外保护蛋白质的活动,单独或结合锰2 +。海藻糖存在于各种微生物,包括细菌、酵母、真菌、植物、无脊椎动物和被发现保护蛋白质免受热、渗透压力、干燥、氧化( 54]。此外,菌株的 Chroococcidiopsis干燥、IR-resistant藻青菌,是积累海藻糖( 55, 56]。这里我们演示实验的抗氧化特性的海藻糖和建议,结合锰和磷酸盐、有机小分子形式中发现高辐射抗性的基础 r . xylanophilus和 r . radiotolerans。这些发现符合当前模型的锰基抗氧化剂清除生成的活性氧,建立了有氧细菌和古菌( 7, 11, 51]。除了其抗氧化活性,Mn也可能行为功能上代替铁Fe-S集群的酶,从而减轻芬顿的有害影响化学在氧化应激( 57]。

厌氧超嗜热菌的辐射抗性的基础 p . furiosus和 t . gammatolerans似乎是完全不同于有氧的嗜热微生物。两个生物体表现出低Mn / Fe类似于辐射灵敏的比率 大肠杆菌和 p . putida( 9]。这是在冲突与Mn的模型2 +端依赖ROS清除进行有氧细菌和古菌( 7, 11, 51]。然而,许多蛋白质在厌氧生物需要铁如脱氢酶和铁氧还蛋白,一个电子载体 p . furiosus使用的NAD ( 58- - - - - - 60]。 p . furiosus像大多数厌氧超嗜热菌,缺乏氧气解毒酶超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶使用有氧同行( 61年]。相反, p . furiosus有过氧化物还原酶(SOR) nonheme含铁酶催化还原的 O 2 • - - - - - - 在H2O2几种氧化物酶,包括rubrerythrin和烷基氢过氧化物还原酶I和II ( 61年, 62年]。此外,尽管锰2 +端依赖活性氧的清除 O 2 • - - - - - - 和H2O2——形成主要是在有氧辐照确实是至关重要的氧气的存在,这可能不是在厌氧条件下( 63年, 64年]。在O2的形成, O 2 • - - - - - - 是一个互译过程中自由电子吗 ( e - - - - - - ) 与O反应2(2.0十10米−1年代−1)。这是明显快于没有O2的形成 O 2 • - - - - - - 何鸿燊取决于浓度•和H2O2(2.7十7米−1年代−1)[ 63年]。在我们的 在体外保护试验, p . furiosus和 t . gammatoleransUFs显示增加保护在厌氧条件下,表明一个元素的辐射电阻可能归因于厌氧环境本身。另一个因素可能是它们的代谢适应保持严格的厌氧条件下细胞内环境。

而活性氧解毒酶被证明是可有可无的有氧archaeon的生存 h . salinarum红外光谱( 11全基因组mRNA的微阵列分析) p . furiosus为了应对辐射显示基因编码一个假定的Dps-like iron-chelating蛋白质和膜结合两个氧化还原酶是红外后差异表达,可能在氧化应激反应 65年]。最有趣的发现是许多系统的高层组成型表达参与氧解毒和氧化还原内稳态,大概是为了防止细胞蛋白质氧化损伤( 65年]。同样,琼通路中的基因最高度表达 p . furiosus在正常厌氧生长条件,没有发现转速的增加表达针对红外或H2O2,表明这种蛋白质可能运行在最大容量, 59, 62年, 65年]。的一个变体SOR-mediated O 2 • - - - - - - 解毒是最近发现的 Desulfoarculus baarsii琼与亚铁氰化物减少 O 2 • - - - - - - 没有形成H2O2。这个系统是高效的,因为琼铁网站仍然是减少,从而消除氧化还原酶回收水的要求( 66年]。我们建议,低水平的生成的活性氧在厌氧条件下结合高度持续表达了厌氧超嗜热菌的解毒系统, p . furiosus和 t . gammatolerans是关键,其辐射抗性和规避的需要Mn-antioxidant复合物在细胞内的积累。

极端微生物的研究以及如何满足极端环境中的物理和化学挑战他们导致了许多新见解应激反应的机制。以前的工作,再加上机制这里描述的嗜热菌的辐射电阻,凸显了多种策略微生物可以用来逃避环境压力。各种Mn-antioxidant复合物发现迄今为止表明,极端微生物的适应他们的环境为小说提供一个巨大的水库辐射防护和抗氧化剂分子对红外的有害影响。一个问题是:Mn有氧系统的红外阻力的一个普遍特征,和Mn的模型2 +端依赖ROS清除扩展到真核系统?

 确认

这项工作是支持的AFOSR(格兰特FA95500710158) j . Di。鲁杰罗icp工作的部分支持由马里兰州约翰霍普金斯和NIEHS香烟赔偿基金项目中心(批准P30 ES00319)。作者感谢Elena Gaidamakova和维拉Matrosova的健康科学统一服务大学(USUHS),贝塞斯达,医学博士,技术支持使用伽马源USUHS戴利和m . j .,以换取他的支持。

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