1。介绍
性别差异在心血管健康问题的发生率是归因于不同的性荷尔蒙模式中发现男性和女性。一些研究和临床试验表明血管的直接调制函数的女性和男性性激素(
1 ]。睾酮与负面影响心血管系统,如心血管疾病风险增加,血栓形成,心脏肥大,疑似proatherogenic效应(
2 ,
3 ]。然而,最近的研究表明有一些心血管疾病有益的睾丸激素和一些流行病学研究表明,心血管疾病患者也低水平的睾酮(
4 - - - - - -
7 ]。另一方面,高胆醇血症与增加的心血管疾病相关。一些研究试图把高胆固醇血症与异常血管平滑肌(SMC)收缩集中在内皮。
在过去的几年,睾丸素已被证明在不同引起的血管舒张血管从不同物种
8 ,
9 ]。这个血管舒张不减毒的预处理与经典的雄激素受体阻滞剂flutamide [
10 - - - - - -
12 )和nongenomic睾酮类似物也可以引起血管舒张大于genomic-acting类似物(
12 ,
13 ]。另一方面,研究执行不同的老鼠血管显示,切除在主动脉内皮轻微降低睾丸激素松弛剂效果(
13 和肠系膜动脉
11 ,
14 ]。然而,曰et al。(1995)表明,睾酮诱发endothelium-independent放松在孤立的冠状动脉和主动脉从兔子
12 ]。此外,testosterone-induced放松对猪冠状动脉与积累的cGMP endothelium-independent机制(
15 ]。
关于睾丸激素调制膜离子通量的血管平滑肌细胞,建议在大鼠主动脉确立是由生理浓度的抑制这种激素(
16 ,
17 ),衣架式电流只封锁在更高浓度(
17 ]。另一方面,钾离子通道开放的功能含义的testosterone-induced不同动脉的血管舒张从提出了不同的物种
10 ,
11 ,
18 - - - - - -
20. ]。钾离子通道的激活血管平滑肌可能引入等离子体膜的超极化,导致关闭确立和血管松弛。本田等人认为,这种机制可以更相关的系统性高血压的情况下(
18 ]。
胆固醇的影响,最初被认为是介导的内皮,和一些作者认为胆固醇降低endothelium-derived生产和/或可用性的因素,主要是没有,导致内皮功能障碍和异常血管反应性(
21 ]。最近,建议胆固醇:增加血管的敏感性增加2 + 磁导率(
22 通过Rho-kinase],增加钙敏感(岩石)介导的通路
21 ),影响血管反应性endothelin-1和5 - [
22 ,
23 ],减少确立的表达[
24 ,调节特定内向整流的表达水平和ATP-sensitive钾离子通道亚型(
25 ]。另一方面,金合欢醇,nonsterol甲羟戊酸衍生物的胆固醇合成途径,据报道,抑制l型钙通道高瓦斯)在血管平滑肌细胞
26 ,
27 ),它还引发放松感染鼠主动脉和肠系膜动脉(
28 ]。
总之,睾丸激素血管nongenomic行动包括血管舒张,胆固醇在这个级别的影响是不确定的。睾酮诱导的血管舒张可能涉及多个离子通道的调制。本研究的目的是分析的影响睾酮对大鼠主动脉平滑肌和胆固醇比较机制牵涉在每种情况下。睾丸激素的影响和胆固醇在简约endothelium-denuded鼠主动脉进行了分析。整个单元配置的膜片箝技术被用来分析睾丸激素的影响和胆固醇在A7r5细胞钙和钾电流
2。方法
2.1。大鼠主动脉收缩性实验
成年雄性Wistar鼠(查尔斯河,巴塞罗那,西班牙)重400 - 500克被安置的环境适应和至少一个星期前执行适当的实验室实验装置12小时光与光周期:12小时黑暗和食物和水
随意 。按照欧盟规定使用的老鼠对动物保护(86/609)指令和指导的《实验动物保健和使用由美国国家卫生研究院(NIH出版85号- 23,1996年修订)。
老鼠被斩首了。开胸后,得到了主动脉,放置在一个thermostatized (37°C)克雷布斯修改解决方案和脂肪和结缔组织清洁。血管内皮是机械被温柔的摩擦与棉花签通过动脉腔引入。动脉环被放置在一个器官浴(LE01.004 Letica)包含Krebs-bicarbonate解决方案在37°C与carbogen不断加油。克雷布斯的构成的修改方案(毫米):119年氯化钠,氯化钾,CaCl2
·
2 h2 0.5 O, MgSO4
·
7小时2 1.2 O, KH2 阿宝4 1.2,NaHCO3 25日,EDTA-Na2 0.03,0.6 L -(+)抗坏血酸和葡萄糖11 (pH值7.4)。中止了两个平行环不锈钢电线和张力测量进行了使用等距传感器(TRI201, Panlab SA,西班牙),放大器(ML118 / D四桥,ADInstruments),界面PowerLab / 4 sp (ML750 ADInstruments)和计算机系统与Chart5 PowerLab软件(ADInstruments)。在休息时间,器官浴的解决方案是改变每15分钟。
最初,环平衡为60分钟,直到1.0 g的静息张力。平衡期后,主动脉环首先简约等渗压的高氯化钾浓度(60毫米)和内皮功能的缺失是证实了松弛剂对乙酰胆碱的缺乏(1
μ
米)。在那之后,动脉清洗和被允许恢复至少45分钟前下引起收缩。戒指是简约使用氯化钾(60毫米)或8644(−)湾K(湾;0.1
μ
米)和睾酮引起的血管舒张(1 - 100
μ
米)分析了收缩。
主动脉瓣环与湾(0.1简约
μ
M)后增加到10毫米氯化钾浓度的柠檬酸溶液。克雷布斯氯化钾浓度增加到10毫米促进的Ca2 + 湾K8644渠道。胆固醇(1 - 100的效果
μ
米)在动脉环简约与氯化钾(60毫米)也进行了分析。在一些实验中,经典的激素受体的参与在使用flutamide vasorelaxant睾丸激素的影响进行了研究,具体为古典激素受体拮抗剂。在这些情况下,后收缩,动脉与flutamide孵化15分钟(10
μ
米)和睾酮的影响在这个对手分析。确定钾离子通道激活睾酮的作用效果,几个钾离子通道抑制剂被用于一些实验:四乙铵(茶;1毫米)的抑制剂
汉堡王
Ca
;格列本脲(10
μ
米),一个的抑制剂
K
三磷酸腺苷
;和4-aminopyridine (4-AP;1毫米)的抑制剂
K
V
。在这些情况下,收缩后,动脉被孵化15分钟与钾离子通道抑制剂和睾丸激素的影响在这些药物存在的原因进行了分析。控制实验与乙醇,车辆用于溶解药物,总是执行。
2.2。细胞培养的血管平滑肌细胞
A7r5细胞系,在这项研究中,使用一个商业主动脉血管平滑肌细胞系从胚胎获取比例(Promochem、西班牙)。细胞生长在培养基杜尔贝科的修改鹰的媒介/营养混合物F-12火腿(DMEF-F12;Sigma-Aldrich、葡萄牙)补充NaHCO3 (1.2 g / L), L-ascorbic酸(20 mg / L;Sigma-Aldrich)、牛血清白蛋白(0.5%;Sigma-Aldrich), heat-inactivated胎牛血清(的边后卫;10%;Biochrom)和青霉素(100 u /毫升)的混合物,链霉素(100
μ
g / mL)、两性霉素B (250 ng / mL) (Sigma-Aldrich)。这些细胞被保存在文化37°C在湿润的气氛中公司为5%2 在空气中。融合后,细胞被置于培养基没有的边后卫(FBS-free培养基)24 - 48小时。胰蛋白酶化使用胰蛋白酶溶液(0.3%)在Ca2 + 毫克2 + 无磷酸盐缓冲溶液与EDTA (0.025%)。随后,这些细胞被保持在4°C FBS-free中直到电生理实验的实现。
2.3。电生理实验
整个单元配置的膜片钳技术被用来分析l型钙电流(
我
Ca
,
l
)和钾电流(
我
K
)。
分析
我
Ca
,
l
,控制外部解决方案包含(毫米):氯化钠124.0,CaCl2 5.0,消息灵通的5.0,四乙铵钠盐(茶)10.0,4.7氯化钾和葡萄糖6.0,pH值7.4调整与氢氧化钠。贴片电极(2 - 4米
Ω
)充满了内部解决方案(毫米):119.8中海,CaCl2 0.06,MgCl2 4.0、3.1 Na-ATP Na-GTP 0.4, EGTA 5.0,消息灵通的10.0和10.0茶,pH值7.3 CsOH调整。Cs的存在+ 而不是K+ 封锁了钾电流的解决方案。这些细胞被维持在一个控股的潜力-80 mV,经常动摇每8 0年代mV测试潜在的女士在500年来衡量
我
Ca
,
l
。
分析
我
K
,控制外部解决方案包含(毫米):氯化钠134.3,CaCl2 1.0,消息灵通的5.0,5.4氯化钾,与氢氧化钠和葡萄糖6.0,pH值7.4调整。贴片电极(2 - 4米
Ω
)充满了内部解决方案(毫米):125.0氯化钾,MgCl2 1.0、5.0 Na-ATP Na-GTP 0.5, EGTA 0.1, 20.0玫瑰,用KOH和葡萄糖10.0,pH值7.3调整。为
我
K
分析,我们使用相同的潜力和去极化60号300 ms进行每8 s。
基底
我
Ca
,
l
和
我
K
测定3 - 5分钟后补丁之间的平衡打破,允许吸管和细胞内的解决方案。电流没有补偿电容和漏电流。所有实验都是在室温下(21 - 25日°C)和温度没有变化超过1°C在给定的实验。细胞电压夹使用膜片钳放大器Axopatch 200 b(轴突仪器,美国)。电流采样的频率10 kHz和过滤0.1千赫使用模拟-数字接口Digidata 1322(轴突仪器,美国)连接到一个兼容的计算机与Pclamp8软件(轴突仪器,美国)。外部解决方案应用于细胞接近通过将细胞的250
μ
m内径毛细管流动的速度20
μ
L /分钟。基底和BAY-stimulated(10海里)
我
Ca
,
l
研究了在不同浓度睾酮(1 - 100
μ
M)和胆固醇(1 - 100
μ
米)溶解在外部解决方案。
2.4。药物
药物和化学物质都是购自Sigma-Aldrich Quimica(辛特拉,葡萄牙),除了4-aminopyridine是购自生原体Cientifica(马德里,西班牙)。
Flutamide(−)湾8644 K(湾)、心痛定(NIF),胆固醇,和睾丸素最初溶解在乙醇。4-Aminopyridine (4-AP)、格列本脲、apamin和四乙铵钠盐(茶)最初被溶解在去离子水。适当稀释克雷布斯修改解决方案或在相应的电生理学外部解决方案之前每天都准备实验。最后在实验浓度的乙醇从未超过0.1%。
2.5。统计分析
使用SigmaStat统计处理的数据进行统计分析系统,版本1.00 (1992)。结果表示为±SEM的意思
n 实验。收缩性的实验
n 显示使用的戒指数量,获得至少3动物。在电生理实验中
n 是细胞的数量分析。多个组之间的比较分析了通过使用一个单向方差分析后跟Dunnet事后测试来确定意味着之间的显著差异。对比分析了两组学生
t 以及。概率水平低于5%被认为是重要的(
P
<
。
05年
)。
收缩性实验,睾酮和胆固醇引起的松弛剂反应表示为百分之一的最大收缩(
E
马克斯
= 100%)产生的相应的血管收缩剂。在这些实验中,s形vasorelaxant效应的量效曲线拟合和集成电路50 值(即。,concentrations inducing 50% of relaxation) were estimated for KCl- or BAY-induced contractions. The antagonist of classical androgen receptors, flutamide, relaxed by itself the arteries contracted by KCl, and in this case the maximal effect used to perform the concentration-response curves was the tension obtained in presence of flutamide.
的
我
Ca
,
l
振幅是自动计算最大峰值电流和稳定电流之间的高原附近最后每8年代的脉搏。的
我
Ca
,
l
使用不同的药物引起的变化表示为百分之一的基底或BAY-stimulated
我
Ca
,
l
。的
我
K
变化表示为基底的百分之一
我
K
没有任何药物获得的去极化。
3所示。结果
3.1。Vasorelaxant睾酮在大鼠主动脉和胆固醇的影响
大鼠主动脉环没有内皮和等渗压的萎缩了两极化的氯化钾(60毫米)解决方案和钙通道的揭幕战湾(0.1
μ
米)。最大收缩引起氯化钾和海湾,
1174.4
±
27.5
毫克(
n = 54)和
1293.6
±
77.1
毫克(
n 分别= 18)没有显著差异(
P
>
。
05年
,学生的
t 以及)。这些收缩影响是可逆的洗后与克雷布斯的解决方案。
在获得稳定的收缩与氯化钾和海湾,累计增加睾酮(1 - 100
μ
米)完全放松(100%)在这两种情况下这些收缩以浓度依赖方式(图
1(一) )。每个浓度睾酮诱导的血管舒张10 - 15分钟后观察。睾丸激素的使用没有伤到动脉的收缩特性,因为洗后,第二次收缩代理管理引起了类似的收缩比前一个(
P
>
。
05年
数据未显示)。最大松弛引起的睾丸激素是相似的动脉收缩了氯化钾或湾(图
1(一) )。然而,集成电路50 获得KCl-contracted动脉显著大于获得BAY-contracted动脉(表
1 )。
表1
集成电路50 值(
μ
米)的睾丸激素对大鼠主动脉环收缩松弛剂影响湾和氯化钾(60毫米)单独或在下列药物:
K
V
通道阻滞剂4-aminopyridine (4-AP;2毫米)
B
K
C
一个
通道阻断剂四乙铵(茶;1毫米)
K
一个
T
P
通道阻滞剂格列本脲(GLI;10
μ
M)和睾酮受体拮抗剂flutamide (10
μ
米)。每个值代表数量的平均值±SEM实验显示在括号中。*
P
<
。
05年
睾酮与集成电路50 获得KCl-contracted动脉,学生的
t 以及。
代理
睾酮集成电路50 (
μ
米)
湾
12.94±1.92 (
n = 6)*
氯化钾
29.88±1.12 (
n = 5)
氯化钾+茶
23.60±1.06 (
n = 4)
氯化钾+ 4-AP
31.24±1.15 (
n = 5)
氯化钾+ GLI
27.87±1.21 (
n = 3)
氯化钾+ Flutamide
20.67±1.26 (
n = 4)
Vasorelaxant睾酮对大鼠主动脉和胆固醇的效果。(一):累积效应的睾酮浓度(1 - 100
μ
米)收缩引起的氯化钾(60毫米)和湾(0.1
μ
米)。(b):累积的睾酮浓度的影响和胆固醇(1 - 100
μ
米)收缩引起的氯化钾(60毫米)。控制曲线的影响类固醇溶剂(乙醇)也显示使用。每个点代表的平均值和竖线表示SEM至少5实验。*
P
<
。
05年
与睾酮对氯化钾收缩的影响,学生的
t 以及。
(一)
![]()
(b)
![]()
胆固醇(1 - 100
μ
M)也诱导浓度的血管舒张大鼠主动脉环收缩了氯化钾。胆固醇的最大放松效果类似于引起睾酮(
P
>
。
05年
)(图
1 (b) )。然而,集成电路50 睾酮(
29.88
±
1.12
;
n
=
5
)明显大于获得胆固醇(
19.10
±
2.58
;
n
=
6
)(
P
<
。
05年
,学生的
t 以及)。
乙醇,车辆用于溶解睾丸激素和胆固醇,根本不会有明显的松弛剂效果(图使用的浓度
1 )。
睾酮在大鼠主动脉的vasorelaxant效应可能是由经典的胞内受体的激活。为了测试这种可能性,flutamide(10的效果
μ
分析了M)对睾丸激素血管舒张。最初,由氯化钾后收缩,动脉环暴露15分钟flutamide,造成显著放松对大鼠主动脉环(
54.8
±
2.7
%)。然而,flutamide并不影响vasorelaxant睾丸激素的影响,因为IC50 值在没有获得和在这个对手是相似的(
P
>
。
05年
,学生的
t 以及;表
1 )。
三个不同的钾离子通道抑制剂的影响(格列本脲、4-AP和茶)也为了调查分析这些渠道参与睾酮的松弛剂机理。格列本脲,4-AP或茶,没有重大影响收缩引起的氯化钾(数据没有显示),没有修改睾酮(图明显的放松的效果
2 )(
P
>
。
05年
、单因子变异数分析与Dunnet事后测试)。的集成电路50 值计算的睾丸激素在任何人面前K+ 从集成电路通道抑制剂没有显著差异50 值计算在缺乏阻滞剂(
P
>
。
05年
;表
1 )。
图2
钾离子通道抑制剂对大鼠主动脉放松引起的睾丸激素。增加睾酮的浓度效应(1 - 100
μ
米)与氯化钾endothelium-denuded鼠主动脉环收缩(60毫米)存在与否的钾离子通道抑制剂格列本脲(GLI;10
μ
米),4-aminopyridine (4-AP;1毫米),或四乙铵(茶;1毫米)。每个点代表平均值±SEM(显示在垂直酒吧)从实验显示在括号中。
![]()
3.2。睾酮和胆固醇对< inline-formula > < mml:数学xmlns: mml = " http://www.w3.org/1998/Math/MathML " id = " M75 " > < mml: mrow > < mml: msub > < mml:多行文字>我< / mml:多行文字> < mml: mrow > < mml:多行文字>钙、L < / mml:多行文字> < / mml: mrow > < / mml: msub > < / mml: mrow > < / mml:数学> < / inline-formula > A7r5细胞
全细胞膜片钳技术被用来分析钙电流通过确立(
我
Ca
,
l
在A7r5细胞)。基底的平均值
我
Ca
,
l
密度是0.93±0.05 pA / pF (
n = 91)。湾的应用(10海里;特定刺激的确立)大大刺激了钙电流74.8±5.7% (
n = 36)高于基础水平。相反,硝苯地平(1
μ
M;确立抑制剂)显著降低当前直到20.6±2.2%的水平(
n = 8)的基底电流(
P
<
。
05年
)。即便如此,湾的影响和/或硝苯地平是完全可逆的冲刷药物(图
3 )。这些结果表明,目前的分析是一个确立电流(
我
Ca
,
l
)。图
3 显示了两个实验的时间进程,湾(10 nM)刺激基底
我
Ca
,
l
(图
3(一个) )和硝苯地平(1
μ
米)抑制BAY-stimulated和基底(数字
3(一个) 和
3 (b) 、职责)。
硝苯地平和海湾的效果
我
Ca
,
l
振幅在A7r5细胞。原始的记录
我
Ca
,
l
以膜片钳实验表明:湾(10 nM)刺激
我
Ca
,
l
和硝苯地平(NIF;1
μ
米
)抑制海湾刺激(a);硝苯地平(1
μ
米)直接抑制基底
我
Ca
,
l
(b)。
(一)
![]()
(b)
![]()
像一个提议vasodilatatory睾酮的抑制机制确立,我们测试了类固醇的影响
我
Ca
,
l
。图
4(一) 显示了一个典型实验,不同浓度(1 - 100
μ
米)的睾丸激素抑制基底
我
Ca
,
l
方式是可逆的。图
5(一个) 总结这类实验的结果中,睾酮在不同浓度(1、10、30和100
μ
米)抑制基底
我
Ca
,
l
浓度的方式。胆固醇在基底的影响
我
Ca
,
l
还分析了(图
5(一个) ),像睾丸激素、胆固醇(1 - 100
μ
米)抑制基底
我
Ca
,
l
。此外,胆固醇似乎similareffects testosteroneon基底
我
Ca
,
l
(
P
>
。
05年
,学生的
t 以及),即使睾酮影响更大。
睾酮的影响
我
Ca
,
l
振幅在A7r5细胞。原始的记录
我
Ca
,
l
以膜片钳实验表明增加睾酮的浓度(结核菌素;10 - 100
μ
米)抑制基底
我
Ca
,
l
(一)和BAY-stimulated
我
Ca
,
l
(b)。
(一)
![]()
(b)
![]()
睾酮和胆固醇的影响
我
Ca
,
l
在A7r5细胞。不同浓度(1 - 100
μ
米)的睾丸激素和胆固醇抑制基底
我
Ca
,
l
(a)和BAY-stimulated(10海里)
我
Ca
,
l
(b)。每一列表示均值±SEM(显示在垂直酒吧),在基底(a)的百分比或BAY-stimulated (b)
我
Ca
,
l
从实验的数量显示在括号中。
(一)
![]()
(b)
![]()
进一步描述抑制睾酮对血管的影响确立,我们分析他们的影响
我
Ca
,
l
刺激的确立受体激动剂。图
4 (b) 显示了一个典型实验,不同浓度(1 - 100
μ
米)的睾丸激素可逆地抑制了
我
Ca
,
l
刺激湾(10海里)。BAY-stimulated睾丸激素的抑制作用
我
Ca
,
l
是依赖于浓度。100年
μ
M睾酮浓度完全抑制了海湾的刺激减少
我
Ca
,
l
以下基
我
Ca
,
l
水平(图
5 (b) )。进一步描述的抑制性影响胆固醇在血管确立,我们也分析他们的影响
我
Ca
,
l
刺激的海湾。抑制胆固醇BAY-stimulated
我
Ca
,
l
。抑制在使用的最大浓度的胆固醇
73.9
±
16.8
%的BAY-stimulated
我
Ca
,
l
(图
5 (b) )。乙醇(0.001 - -0.1%),车辆用于溶解睾丸激素和胆固醇,并不影响基底或刺激
我
Ca
,
l
(数据没有显示)。BAY-stimulated睾酮和胆固醇的影响
我
Ca
,
l
不是明显不同(
P
>
。
05年
,学生的
t 以及),即使胆固醇效果较低。
3.3。睾酮和胆固醇对< inline-formula > < mml:数学xmlns: mml = " http://www.w3.org/1998/Math/MathML " id = " M123 " > < mml: mrow > < mml: msub > < mml: mrow > < mml:多行文字>我< / mml:多行文字> < / mml: mrow > < mml: mrow > < mml:多行文字> K < / mml:多行文字> < / mml: mrow > < / mml: msub > < / mml: mrow > < / mml:数学> < / inline-formula > A7r5细胞
全细胞膜片钳技术被用来分析钾电流(
我
K
在A7r5细胞)。基底的平均值
我
K
密度是
9.1
±
1。4
pA / pF (
n = 34)。为了确定类型的钾离子通道负责总电流测量,我们使用选择性阻断剂不同的频道。的
K
V
通道阻滞剂4-AP降低基底
我
K
在
35.8
±
2.9
% 60 + mV。茶(1毫米),用作
汉堡王
Ca
通道阻断剂,减少净电流
30.4
±
5.7
% 60 + mV(图
6 )。我们还测试了low-conductance的存在
K
Ca
通道使用选择性阻断剂apamin (10
μ
米),诱导小减少基底
我
K
(
9.8
±
2.5
%)。格列本脲,通常用作
K
三磷酸腺苷
通道阻断剂,也诱导小减少
我
K
(
8.7
±
0.8
%,
n
=
5
)(图
6 )。钾离子通道阻滞剂的影响是完全可逆的冲刷药物使用。因此,我们的数据表明,钾电流测量主要由钾出口
K
V
和
汉堡王
Ca
频道。
图6
不同钾通道阻滞剂的效果
我
K
在A7r5细胞。酒吧代表的影响
我
K
下面的钾通道阻滞剂:
K
V
通道阻滞剂4-aminopyridine (4-AP;2毫米);的
汉堡王
Ca
通道阻断剂四乙铵(茶;1毫米);的low-conductance
K
Ca
通道阻断剂apamin (APM 10
μ
米);和
K
三磷酸腺苷
通道阻滞剂格列本脲(GLI;10
μ
米)。每一列表示均值±SEM(显示在垂直酒吧),在抑制的百分比
我
K
从实验的数量显示在括号中。
![]()
为了进一步描述睾酮的血管松弛剂机理,这对A7r5类固醇的影响
我
K
进行了分析。结果表明,不同浓度(1 - 100
μ
米)的睾丸激素不抑制
我
K
当前(表
2 )。类似的结果观察不同浓度的胆固醇(表
2 )。
表2
睾丸激素的抑制作用和胆固醇(1 - 100
μ
米)A7r5细胞基底钾电流(
我
K
)。每个值代表%的均值变化的基础
我
K
±SEM实验的数量显示在括号中。
浓度
睾酮
胆固醇
1
μ
米
1。5
±
1。9
%
(
n
=
10
)
- - - - - -
1。8
±
1。9
%
(
n
=
10
)
10
μ
米
- - - - - -
0.8
±
2.3
%
(
n
=
7
)
- - - - - -
1。3
±
1。6
%
(
n
=
10
)
30.
μ
米
- - - - - -
1。0
±
1。7
%
(
n
=
9
)
- - - - - -
0.0
±
0.9
%
(
n
=
10
)
One hundred.
μ
米
- - - - - -
6.8
±
3所示。3
%
(
n
=
9
)
1。4
±
0.8
%
(
n
=
8
)
4所示。讨论
在目前的研究中,我们分析了影响睾酮和胆固醇endothelium-denuded鼠主动脉动脉和萎缩
我
Ca
,
l
和
我
K
用全细胞电压钳A7r5细胞。
睾酮松弛剂效应以前观察到的其他作者处理大鼠主动脉(
14 ,
18 ,
29日 ,
30. )和冠状动脉等血管从狗
31日 从人类和
32 ),或人类脐动脉(
10 ]。睾酮在大鼠的vasorelaxant效果剥蚀主动脉环收缩与氯化钾浓度和最大松弛效应获得100%,获得的数据,在赞同Tep-areenan et al。
14 ]。一些作者认为vasorelaxant效应部分依赖的内皮
11 ,
13 ,
14 ,
18 ]。我们的数据表明,无论内皮的作用,影响睾丸激素诱导内皮细胞的缺失,与其他作者(协议
12 ,
15 ,
30. ,
33 ]。我们表明,睾酮完全放松动脉收缩氯化钾或海湾,尽管IC50 大了氯化钾动脉收缩。高细胞外氯化钾浓度诱导等离子体膜去极化。这个去极化激活压敏电阻器频道,其中LTCCwhoseopening增加细胞内钙水平和肌肉收缩。湾直接和具体打开确立,同样诱导血管平滑肌收缩,细胞内钙增加。因此,这些结果表明,睾酮抑制氯化钾,BAY-induced收缩和指向确立抑制这种效应的一个原因,正如前面提出的其他作者(
34 ]。为了证实这一点,我们执行A7r5膜片钳研究分析确立的睾丸激素影响的活动。湾,一个已知的受体激动剂这种类型的频道,显然刺激基底
我
Ca
,
l
确立,选择性拮抗剂硝苯地平,明显阻塞或基底BAY-stimulated钙电流。这些数据证实钙电流测量是由于钙通过确立条目。我们的结果也显示基底快速睾丸激素浓度的抑制作用
我
Ca
,
l
。其他作者建议之前,在A7r5细胞,睾酮抑制确立(
16 ,
17 和衣架式钙通道
17 ]。几个作者表明,雄激素诱导的血管舒张大鼠主动脉可以诱导非确立因为放松这些类固醇引起的轻微收缩时引起的海湾,比氯化钾或去甲肾上腺素诱导宫缩(
35 ]。然而,我们的研究结果表明,收缩引起湾被睾丸激素和废除,第一次,我们表明,睾酮抑制BAY-stimulated
我
Ca
,
l
,证实睾酮对大鼠主动脉确立的抑制性能。
睾酮的浓度需要体外诱导血管舒张supraphysiological。一般来说,睾酮的浓度之间存在广泛差异需要体内和体外产生影响。通常所需的雄激素浓度诱导放松效果supraphysiological [
8 ,
12 ,
35 ,
36 ]。关于对离子通道的影响,与血管平滑肌细胞以前的研究显示,睾酮浓度差异需要观察这些影响。A7r5细胞,Scragg等人发现睾酮抑制确立和衣架式钙通道supraphysiological浓度(
17 ]。在相同的细胞,大厅等人发现摩尔浓度睾酮抑制确立的
16 ]。在HEK293细胞中转染人类心血管确立alpha1C亚基的,这是表明,睾酮的浓度从0.1到100
μ
M抑制这些通道(
37 ]。在新鲜的大鼠主动脉细胞,Montano等人也发现睾酮的生理浓度抑制确立(
36 ]。像其他亲脂性的物质,睾丸激素是由血浆蛋白运输,如性激素结合球蛋白(SHBG)。最近SHBG的膜受体识别在某些细胞类型促使hormone-globulin复杂的建议可能会引起细胞反应或者SHBG可能负责正确定位在细胞膜内的睾酮(
38 ]。如果参与睾酮SHBG表示细胞膜蛋白质,这种信号机制的缺失在我们的实验中可能导致这些研究明显失去效力。然而,所需的浓度升高似乎与类固醇的溶解度有关,因为在我们的实验条件没有类固醇结合蛋白。
睾丸激素的抑制作用是快速、可逆的,并且这种影响药物洗后消失。这些数据表明,睾丸激素效应是由nongenomic通路。以前,一些作者描述nongenomic机制的存在性类固醇诱导的调节血管张力(
39 ]。除此之外,一个未知的受体的存在,没有标识并放置在细胞表面或细胞内空间,建议(
38 ,
40 ]。同时,睾丸激素可能会阻止确立直接绑定到通道(
41 ]。此外,最近Scragg等人发现确立硝苯地平结合位点的突变导致的损失睾丸激素血管舒张效应(
37 ]。另一方面,其他作者表明,环核苷酸水平的增加与睾丸激素的血管舒张作用在猪冠状细胞和大鼠主动脉细胞(
15 ,
36 ),这表明一个交互的睾酮环核苷酸通路。
与假设关于抑制钙通道相比,其他研究者报道,睾酮的血管舒张效应是由于钾离子通道的刺激
13 ,
18 ]。钾离子通道的激活血管平滑肌可能引入确立的复极化和关闭,导致血管放松。书目数据关于不同钾离子通道的作用vasorelaxant睾丸激素的影响是有争议的。激活
汉堡王
Ca
渠道已经涉及到睾丸激素的作用在大鼠肠系膜动脉床上(
11 ,
19 ),在猪冠状细胞(
15 ),在人类内乳动脉(
20. 人类脐动脉[],
10 ]。的参与
K
V
渠道的睾酮在大鼠主动脉(放松的效果
13 ),兔冠状动脉(
19 ),和人类脐动脉(
10 ]。最后,
K
三磷酸腺苷
通道介导的睾丸激素血管舒张大鼠主动脉(
18 ),人体桡动脉(
42 ),和人类阴茎海绵体(
43 ]。我们使用不同类型的钾离子通道抑制剂,来测试这些渠道参与睾丸激素的效果。茶、格列本脲和4-AP没有明显修改vasorelaxant睾丸激素的影响表明钾通道开放没有参与大鼠主动脉血管舒张引起的睾丸激素。进一步探讨睾酮对钾离子通道的影响,我们在A7r5膜片钳研究执行。当前的测量被显著地抑制
K
V
通道阻断剂(4-AP)和
汉堡王
ca
通道阻断剂(茶),但是low-conductance
K
Ca
通道阻断剂(apamin)和
K
三磷酸腺苷
通道阻滞剂(格列本脲)只有一个小钾电流的影响。因此,我们的研究结果表明,钾电流A7r5细胞主要是由于
K
V
和
汉堡王
ca
。另一方面,我们的数据也表明,睾酮未能刺激
我
K
A7r5细胞,证实了收缩性数据,表明钾离子通道不涉及睾酮在大鼠主动脉vasorelaxant效果。这些数据同意获得猪前列腺小动脉(
33 和在大鼠胸主动脉
36 ]。事实上,睾酮对钾离子通道的影响从未在A7r5细胞。
一些作者认为testosterone-induced血管舒张不减毒通过预处理与经典的雄激素受体阻滞剂flutamide [
10 - - - - - -
12 ]。极地,nonpermeable睾酮类似物已被证明比非极性引起更大的血管舒张,透水类似物(
13 ]。此外,testosterone-mediated保持血管舒张血管的雄激素受体缺陷(
41 ]。因此,效果似乎是独立于古典基因信号通路,这一效应是由一种不同的信号通路或未知的受体。对大鼠主动脉,一些作者观察到flutamide没有抑制testosterone-induced血管舒张(
12 ,
14 ]。Tep-areenan等人也证明米非司酮(一个未指明的类固醇受体拮抗剂)没有抑制睾酮的效果(
14 ]。我们的数据也表明,细胞内的堵塞睾酮受体没有修改vasorelaxant睾酮的作用,证实雄激素受体睾丸激素效应是独立的。相比之下,墨菲和Khalil表明,睾酮在猪冠状动脉vasorelaxant效果被flutamide抑制(
44 ]。另一方面,我们的数据表明,flutamide引起一个意想不到的和直接放松KCl-contracted动脉。从这个意义上讲,伊利埃斯库等人曾显示flutamide诱导的大鼠主动脉血管舒张效应,并认为这种效应是独立的核受体的激活和涉及NO-cGMP通路的激活
45 ]。英航等人也观察到这种效果在大鼠动脉和动脉的大flutamide放松雄性比雌性,暗示sex-dependent机制(
46 ]。
一些调查人员发现其他性类固醇有相同的血管舒张效应比睾酮(
47 ,
48 ]。同时,提出的一些机制来解释这些类固醇的血管舒张作用aresimilar thatproposed睾丸激素,如抑制钙条目由17个beta雌二醇和孕酮在猪冠状动脉(
48 ),或抑制雌激素确立的大鼠主动脉(
49 ]。这些数据可以显示一个未指明的这个群体效应的物质。事实上,法尼醇,nonsterol甲羟戊酸衍生物和中间的胆固醇合成途径,也抑制血管平滑肌细胞的确立(报道
26 ,
27 ]并诱发放松感染大鼠主动脉和肠系膜动脉(
28 ]。为了调查的血管舒张作用的特异性睾丸激素,我们分析了胆固醇的影响在大鼠主动脉和A7r5细胞。第一次,我们表明,胆固醇,如睾丸激素,完全放松的动脉收缩了氯化钾,尽管睾酮
集成电路
50
是更大的。关于胆固醇对离子通道的影响,也第一次,我们的研究结果表明,胆固醇浓度增加抑制基底和BAY-stimulated
我
Ca
,
l
,表明similareffect testosteroneon这些渠道的大鼠主动脉细胞。像睾丸激素、胆固醇也未能修改由膜片箝钾电流测量。这些结果表明,睾酮和胆固醇在鼠主动脉,共享相同的机制与确立的抑制有关。
总之,我们的结果表明,睾酮抑制
我
Ca
,
l
但不是在大鼠主动脉血管平滑肌细胞
我
K
。同时,睾丸激素的影响不是由典型的激素受体或钾通道激活。此外,我们的结果表明,胆固醇similareffects首次thattestosterone鼠主动脉和A7r5细胞,表明一种常见的两种类固醇的作用机制,也可以由其他类固醇共享。